mPRα介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及性激素及受体与肺腺癌关系研究领域，特别涉及mPRa介导孕酮调节肺 腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，女性激素及其受体在肺腺癌的发生、发展与治疗中的作用成为人们研究 的热点。有学者认为肺腺癌像乳腺癌和子宫内膜癌等一样也属于性激素依赖性肿瘤。女性 激素包括雌激素(Estrogen)和孕激素(孕酮，Progesterone，P4)，雌激素的促癌作用已达成 广泛共识，而孕激素对肺癌的作用与雌激素似乎不同。Ishibashi等在孕激素受体表达阳性 的小鼠肺癌模型中，发现用孕酮处理可以抑制肿瘤生长。与之相反的是，Check等的研究结 果却表明米非司酮(孕激素核受体抑制剂)能延缓小鼠自发肺部肿瘤的进展。此外，在孕酮 对乳腺癌影响的研究中也发现类似矛盾的肿瘤生物学现象。现在认为这种矛盾现象可能与 实验对象的孕激素受体不同或其表达状态不同有关，这激起研究者们对孕激素及其受体在 肿瘤中作用机制探索的兴趣。
[0003] 孕激素可与孕激素受体(ProgesteroneReceptor，PR)结合激活下游的分子信号 通路而发挥作用。孕激素的经典作用途径由孕激素核受体（nuclearprogesterone receptor，nPR)介导，依赖于目的基因的转录和翻译，调控革El基因的表达水平而对细胞的各 种功能产生调控作用，称之为基因组作用。另外，孕酮还可对缺乏孕激素核受体的细胞和组 织发挥作用，如T淋巴细胞、血小板、大鼠黄体细胞等，这种作用并不依赖于孕激素核受体的 基因转录，故命名为非基因组作用。在这类细胞中，强有力的nPR激动剂（如R5020)或nPR拮 抗剂(如米非司酮)对孕酮的快速非基因组作用很少或根本没有影响。这些证据均提示除了 孕激素核受体之外，还有可能存在其他类型的孕激素受体。
[0004] 2003年Zhu等首次从云纹犬牙石首鱼卵巢组织中克隆出了孕激素膜受体 (MembraneProgesteroneReceptors，mPRs)的cDNA，认为其编码的蛋白质满足类固醇激素 受体的七条标准，即结构合理性、亚细胞定位、组织分布具有特异性、可与孕激素特异性结 合、具有激素调节作用、信号转导功能和生物学相关性。到目前为止，已发现的mPRs亚型有 五种，即mPRa、mPR0、mPRy、mPR5、mPRe，其中mPRa(MembraneProgesteroneReceptora)是 新发现的，研究较多的，且作用最强的孕激素膜受体，因而受到广泛关注。后来对其结构研 究发现，mPRa基因编码的mRNA长度为4.Okb，其表达的蛋白质分子大小为40kDmPRa蛋白具 有7次跨膜区域，包含细胞内的羧基端(C-端)和细胞外的氨基端(N-端），与G蛋白耦联受体 (GproteinCoupledReceptor，GPCR)具有相似性，属于一种独特的受体家族，叫做孕激素 和脂联素Q受体家族（ProgestinandadiponectinreceptorJAQlOJOO?年Dressing等利 用PCR和Western-blot技术在乳腺癌MCF-7和SKBR-3细胞中检测到有mPRamRNA和蛋白质表 达。我们课题组前期研究发现mPRa在肺腺癌细胞和组织中均有表达，其可介导孕酮(P4)抑 制肺腺癌细胞A549的增殖与侵袭。2010年Zuo等在乳腺癌细胞的研究中发现mPRa与小窝蛋 白-l(Cav-l)和表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor，EGFR)共同定位 于细胞膜表面的小窝囊泡结构，并证明mPRa介导孕酮可经PI3K/Akt和EGFR信号通路逆转乳 腺癌细胞的上皮间质转化(EMT)。此外，多项研究表明，孕酮可通过非基因组作用快速启动 多种细胞活动，其中一部分是通过EGFR信号通路完成，进而对细胞的多种生物学效应进行 调控，包括激素分泌、小分子物质摄入、离子通道激活以及胞质内酶的活化(如MAPK、PKA) 等。这些研究均提示孕激素膜受体信号通路与EGFR信号通路存在交联。
[0005]EGFR信号通路是目前肺癌研究中最为广泛的一个领域。人们发现EGFR基因突变或 扩增导致EGFR信号通路的持续活化与NSCLC的发生、进展和预后相关。EGFR活化突变主要位 于酪氨酸激酶区域，常见的突变类型有18外显子(如G719X)、19外显子(如LREA缺失）、20外 显子、21外显子(如L858R)突变。在肺癌患者中，约20%的患者存在EGFR突变，而这一比例在 肺腺癌(40 % )、女性患者(42 % )、亚裔(30 % )和不吸烟(51 % )患者中明显增加。EGFR基因突 变的发现使以EGFR为目标分子的靶向治疗成为晚期NSCLC治疗的里程碑，其中EGFR酪氨酸 激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是目前临床应用最普遍的一类靶向治疗药物，常用的药物有吉非 替尼(Gefitinib)、厄洛替尼（特罗凯/0SI-774)、埃克替尼等。然而，肺癌对EGFR-TKIs的敏 感性主要取决于EGFR的突变状态，EGFR野生型患者对EGFR-TKIs的敏感性较差，故指南推荐 对存在EGFR活化突变的肺癌患者优先考虑使用EGFR-TKIs。
[0006] 在EGFR突变型患者中，EGFR-TKIs治疗后RR(缓解率)可达到75%，这就意味着大约 25 %的患者不能从EGFR-TKIs治疗中获益即发生了耐药。此外，人们发现，几乎所有对EGFR-TKIs非常敏感的肺癌患者在治疗8-16个月后不可避免的发生了耐药。EGFR-TKIs耐药分为 原发性耐药和获得性耐药。目前研究发现原发性耐药可能的机制有:20外显子插入或复制 突变（如D770-N771、insNPG、insSVQ、insG、N771T突变）；罕见突变（如E709A突变）；与EGFR突 变并存的其他基因组突变(如PIK3CA突变、IGF1R突变）；EGFR野生型（如:ALK融合基因突变、 KRAS突变、BRAF突变）等。获得性耐药的可能机制有：二次突变（如T790M、L747S、D761Y、 T854A突变）;MET基因扩增等。针对EGFR-TKIs的耐药情况，各国科研工作者经过不懈努力提 出了一些应对之策，包括二、三代EGFR-TKIs的研发、多条信号通路阻断剂的联合应用、其他 驱动突变基因阻断剂（如克唑替尼）等。然而，对EGFR-TKIs耐药的研究现在仍处于起步阶 段，许多问题亟待解决，因此，改善EGFR-TKIs的敏感性、逆转其耐药性以及寻找新的针对 EGFR野生型肺腺癌的治疗靶点成为肺癌治疗的新兴主题之一。
[0007]随着对女性肺癌特点的深入研究，多项临床研究发现亚裔女性肺腺癌患者更容易 发生EGFR基因突变，且对EGFR-TKIs治疗的敏感性相对较高，推测女性激素及其受体可能与 EGFR突变及EGFR-TKIs靶向治疗相关。最近有研究证明，SRC抑制剂通过介导ERK (ExtracellularRegulatedKinase)再活化可恢复肺腺癌耐药株PC-9GR细胞对EGFR-TKIs 的敏感性。而之前已有研究证明在人子宫平滑肌细胞中，mPRa可介导孕酮抑制SRC的表达。 然而，目前mPRa介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性本领域尚无相关研究。
【发明内容】
[0008]为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供mPRa介导孕酮调节肺腺 癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，从女性激素的角度探讨孕酮经膜受体介导是否可以改 善不同EGFR突变表型的肺腺癌细胞(EGFR野生型A549细胞、EGFR突变型PC-9细胞、EGFR耐药 突变型PC-9GR细胞)对EGFR-TKIs的敏感性，拟为未来研究肺腺癌靶向药物增敏剂提供理论 基础。
[0009]为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0010]mPRa介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，通过比较mPRa对不同EGFR突变状态的肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的影响，诱导肺腺癌敏感株PC-9细胞成为 耐药株PC-9GR细胞，从而动态观察耐药过程与mPRa表达的关系。
[0011 ] 进一步的，mPRa介导孕酮调节肺腺癌细胞对EGFR-TKIs敏感性的方法，包括如下步 骤：
[0012]步骤一:细胞培养
[0013] (1)冻存细胞复苏
[0014]将冻存的细胞迅速放入提前调好温度的37°C恒温水浴箱，轻轻摇晃冻存管，使细 胞尽快融化;待细胞悬液完全融化后，喷洒75%的酒精消毒，放入已用紫外灯照射消毒好的 生物安全柜中，用巴氏吸管将冻存管内细胞混悬液转移至无菌的15ml离心管中；加入5ml提 前配制好的完全培养基，混勾，常温离心机800rpm，离心5min;弃上清液，加入5ml完全培养 基混匀，转入无菌培养瓶中，置于37°C，5 %C02的细胞恒温培养箱中进行培养；
[0015] (2)细胞换液
[0016]从细胞恒温培养箱中取出细胞培养瓶，荧光倒置显微镜下观察细胞的生长状态， 喷洒酒精消毒后放入生物安全柜中；倒掉培养瓶中旧的培养基，无菌PBS溶液轻轻冲洗3次， 加入5ml新鲜的完全培养基，置于37°C，5 %C02的细胞恒温培养箱中进行培养；
[0017] (3)细胞培养传代
[0018]从细胞恒温培养箱中取出细胞培养瓶，荧光倒置显微镜下观察细胞的生长状态， 如果细胞生长密度达80-90%则可以传代;喷洒酒精消毒后放入生物安全柜中，倒掉培养瓶 中旧的培养基，无菌PBS溶液轻轻冲洗3次，加入lml0.05%的胰蛋白酶液，置于恒温培养箱 中消化3-5min，若荧光倒置显微镜下观察细胞的形态已收缩变圆形，可加入约3ml的完全培 养基终止细胞消化过程;巴氏吸管轻轻吹打使细胞分散成单个，将细胞悬液平均分配到2个 新的培养瓶中，每个培养瓶加入完全培养基至5ml，标记好细胞种类、传代日期和细胞代数， 置于37°C，5 %C02的细胞恒温培养箱中进行培养；
[0019] (4)细胞冻存
[0020]在细胞冻存前24h需换液一次，取生长状态良好，处于对数期分裂细胞进行冻存； 将细胞从培养瓶底部消化下来;配制细胞冻存液，胎牛血清:DMS0 = 9:1;用冻存液重悬细 胞，并用巴氏吸管轻轻吹打细胞使之混匀，转移至冻存管中，进行梯度降温，-4°C冰箱放置 20min，-20°C冰箱放置20min，-80°C冰箱暂时保存，1周内转移至液氮罐中可长期保存，注意 标记好细胞种类、冻存日期和细胞代数；
[0021 ] 步骤二:基因测序法检测EGFR突变状态
[0022] (1 )DNA提取:按照DNA提取试剂盒protocol进行操作；
[0023] 1)准备工作:①向裂解液RL-plus中加入一定量的β-巯基乙醇使其终浓度为1% ; ②按试剂瓶上标注向漂洗液PW、缓冲液GD加入适量无水乙醇;③用RNase-FreeddH20配制 70%的无水乙醇；
[0024] 2)收集细胞，数量〈lx107个，PBS溶液洗涤细胞，吸出roS溶液，向细胞中加入含有 0.05 %胰蛋白酶消化细胞，当细胞脱离瓶底时，加入完全培养基终止消化，将细胞溶液转移 至RNase-Free的离心管中，800rpm离心lOmin，收集管中细胞沉淀，仔细吸弃所有上清液；[0025]3)裂解处理:对于离心后得到的细胞沉淀，手指轻弹离心管底部，使细胞沉淀变松 散，加入约600μ1裂解液RL-plus，涡旋震荡3〇sec;
[0026] 4)将所有溶液转移至DNA吸附柱CB3,吸附柱CB3放在2mlRNase-Free的离心管中，12000rpm离心60sec;
[0027]5)向DNA吸附柱CB3中加入500μ1缓冲液⑶，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的 离心废液，将吸附柱CB3再放回收集管中；
[0028]6)加入500μ1漂洗液PW于吸附柱CB3中，室温下静置约2min，12000rpm离心60sec， 倒掉收集管中的离心废液，将吸附柱CB3再放回收集管中；
[0029] 7)重复步骤6);
[0030]8)12000rpm离心2min，倒掉收集管中的离心废液，将吸附柱CB3在室温下放置3-5min，使吸附材料中残余的漂洗液彻底晾干；
[0031]9)将吸附柱CB3放入一个新的1.5mlRNase-Free的离心管中，加入100μΙ洗脱缓冲 液ΤΒ，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到DNA溶液；
[0032](2)引物设计，设计EGFR突变位点特异性引物序列；
[0033] (3)PCR反应体系：
[0035] (4)PCR反应条件；
[0037] (5)基因测序；
[0038]步骤三:CCK_8法检测细胞增殖率(按照试剂盒protocol进行操作）
[0039] (1)CCK_8操作方法：
[0040]收集肿瘤细胞，加完全培养基悬浮，细胞计数板计数后按照5000cel ls/wel 1接种 于96孔板，边缘孔用无菌PBS填充以防止过度蒸发影响实验结果，每孔100μΙ，每组设置6个 复孔;在5%C02、37°C培养箱中培养过夜;给予无血清培养基饥饿处理4小时后，加入各组处 理药物，置于5%C02、37°C分别培养24h、48h、72h;以不加药物组为对照组，以仅含完全培养 基不含细胞组为本底;检测时各组按ΙΟμΙ/well加入CCK-8试剂，37°C孵育lh测定0D 450;扣 除本底后，加药组0D值除以对照组0D值的比值即为细胞生存率；
[0041] 计算公式:生存率=(加药组0D-本底0D)/(对照组0D-本底0D)X100% ;
[0042] (2)CCK_8法测肺癌细胞对吉非替尼的IC50值
[0043]收集肺癌细胞，加完全培养基悬浮，细胞计数板计数后按照5000〇6118/\^11接种 于96孔