专利名称：T细胞介导的免疫的改善的制作方法
技术领域：
本发明涉及改变患者T细胞群组成或者增加其T细胞数目的方法，所述患者具有被抑制的或异常的T细胞群或功能。这些方法包括破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺。
背景技术：
胸腺很大程度上受其与神经内分泌系统的双向通讯的影响(Kendall，1988)。特别重要的是垂体、肾上腺和生殖腺之间的相互作用对胸腺功能的影响，包括营养作用(TSH和GH)和萎缩作用(LH、FSH和ACTH)(Kendall，1988；Homo-Delarche，1991)。事实上，胸腺生理的特性特征之一是在结构和功能上渐进的减退，这与青春期时期循环的性类固醇产生的增加匹配(Hirokawa和Makinodan，1975；Tosi等，1982和Hirokawa等，1994)。激素的精确的靶和它们引起胸腺萎缩的机理仍待确定。因为胸腺是外周T细胞库产生和维持的主要部位，因此这种萎缩已经被广泛地假定为老年人的基于免疫的疾病的发病率增加的主要原因。特别地，由T细胞依赖的免疫功能如细胞溶解T细胞活性和促有丝分裂反应的下降所表明的免疫系统的缺陷反应在以后的生命中免疫缺陷、自身免疫疾病和肿瘤的发病率增加(Hirokawa，1998)。
胸腺萎缩的影响反映在外周，伴随着胸腺输入至T细胞库的减少，导致更少多样性的T细胞受体(TCR)所有组成成分。还观察到改变的细胞因子分布型(Hobbs等，1993；Kurashima等，1995)、CD4+和CD8+亚群的改变以及与原初T细胞对照对记忆的偏离(Mackall等，1995)。另外，胸腺生成的效率随着年龄增加而削弱，这样最终失去在T细胞减少后免疫系统重新产生正常T细胞数目的能力(Mackall等，1995)。但是，最近Douek等(1998)的工作假定地表明即使在老年人中也发生胸腺输出。将TCR基因重排的切除DNA产物用以说明在HIV感染后老年患者中循环的新生原初T细胞。该输出的速率及随后的外周T细胞库再生需要进一步的阐述，因为青春期后的患者与青春期前的患者相比，接受化学治疗的患者表现出T细胞库，特别是CD4+T细胞再生速率的显著下降(Mackall等，1995)。Timm和Thoman(1999)的最近的工作进一步例证了这点，他们表明虽然老年小鼠在BMT后CD4+T细胞再生，但是由于老化的外周微环境和差的原初T细胞胸腺产生，它们表现出对记忆细胞的偏离。
胸腺基本上由分散在多样的基质细胞(主要是上皮细胞亚群)中的发育中的胸腺细胞组成，基质细胞构成微环境并提供生长因子和细胞相互作用，生长因子和细胞相互作用是T细胞最优发育所必需的。胸腺细胞和控制它们的分化和成熟的上皮亚群之间共生发育的关系(Boyd等，1993)，意味着性类固醇抑制可能在两种细胞类型中的任一种的水平发生，然后其将影响另一种的状态。在胸腺细胞自身中不大可能存在固有缺陷，因为以前采用放射嵌合体的研究已表明，BM干细胞不受年龄的影响(Hirokawa，1998；Mackall和Gress，1997)并且具有与幼年BM细胞相似的胸腺再生潜力的程度。另外，在老年动物中胸腺细胞至少在一定程度上保持其分化能力(Mackall和Gress，1997；George和Ritter，1996；Hirokawa等，1994)。但是，Aspinall(1997)最近的工作表明在前体CD3-CD4-CD8-三阴性(triple negative，TN)群内有缺陷，其发生在TCRβ链基因重排的阶段。
通过恢复胸腺功能获得的巨大临床益处提供重要的策略用以治疗特别是老年人、HIV患者和化学治疗后的免疫缺陷。
因此，在第一个方面，本发明提供改变患者的T细胞群组成或者增加其T细胞数目的方法，所述患者具有被抑制的或异常的T细胞群或功能，该方法包括破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺。
优选地，T细胞群组成的改变的特征在于由功能和/或特性分子的表达定义的T细胞亚群性质和/或比率的改变，其中特性分子选自T细胞受体、CD4、CD8、CD3、CD25、CD28、CD44、CD62L和CD69。
进一步优选的是，增加患者T细胞数目导致与其它淋巴样细胞相比，T细胞数目的相对增加。优选地，其它淋巴样细胞是B细胞。
同样优选的是，具有被抑制的或异常的T细胞群或功能的患者患有选自以下的疾病癌症、人免疫缺陷病毒感染、自身免疫疾病、过敏疾病或者子宫内膜异位症。
优选地，癌症患者已接受化学治疗和/或放射治疗和/或骨髓移植。
优选地，人免疫缺陷病毒感染的患者患有艾滋病。
在进一步优选的实施方案中，患者是青春期后的。
自身免疫疾病被认为是作为多基因性状而发生的，它的基本组成部分是病理学自身反应T细胞的参与。通过伴有或者没有骨髓移植而以化学治疗或者放射治疗这样的患者，可以去除这些自身反应T细胞。破坏性类固醇信号传导至胸腺将使胸腺再活化，从而导致新的非自身反应T细胞的股(cohort)。
因此，在第二个方面，本发明提供治疗患者的自身免疫疾病的方法，所述方法包括以下步骤；去除患者的T细胞群，以及破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺。
本发明的第二个方面的步骤可以以任何顺序进行。
在优选的实施方案中，该方法另外包括对患者进行骨髓移植。
在进一步优选的实施方案中，通过对患者进行化学治疗或放射而去除T细胞群。
本发明还可以用于增强患者对抗原的免疫应答。
因此，在第三个方面，本发明提供增强患者对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺，以及给予抗原。
抗原可以，例如，来自感染物或者来自肿瘤细胞。
在第三个方面的优选的实施方案中，患者患有癌症或感染。
在第三个方面的进一步优选的实施方案中，抗原在给予前与佐剂混合。
在第四个方面，本发明提供在器官移植后，减少患者的宿主抗移植物反应的方法，所述方法包括以下步骤去除患者的T细胞；破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺；以及将器官从供者移植入该患者内。
优选地，第四个方面的方法还包括将骨髓从供者移植给患者。
就本发明的方法而言，优选的是通过抑制性类固醇产生，或者通过阻断胸腺中的性类固醇受体而破坏性类固醇信号传导至胸腺。
优选地，通过阉割或者给予性类固醇类似物而实现性类固醇产生的抑制。
优选的性类固醇类似物包括氟他米特、戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林，dioxalan衍生物如曲普瑞林、美它瑞林(meterelin)、布舍瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林和促黄体生成激素释放激素类似物。
目前，优选的性类固醇类似物是促黄体生成激素释放激素类似物。更优选地，促黄体生成激素释放激素类似物是地洛瑞林。
在另一个优选的实施方案中，通过缓释肽配方给予性类固醇类似物。优选的缓释肽配方在WO 98/08533中提供，该文献引入本文做参考。
在第五个方面，本发明提供用以增强患者对抗原的免疫应答的组合物，所述组合物包括佐剂、抗原和促黄体生成激素释放激素类似物。
本领域技术人员也将理解，本发明可以应用于在其发育过程中某阶段拥有胸腺的任何生物。优选地，该生物是哺乳动物。更优选地，该生物是人。
本说明书中，词语“包括”将被理解为包含所述的元素、整数或步骤，或者元素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它元素、整数或步骤，或者元素组、整数组或步骤组。
图3随着年龄和阉割后CD4对CD8胸腺细胞群的FACS图。各象限的百分比在各图的上方给出。随着年龄胸腺细胞亚群保持恒定，并且在阉割后胸腺细胞有同步的扩张。
图4.1通过引入BrdU脉冲检测胸腺细胞的增殖。随着年龄和阉割后增殖的胸腺细胞的比率保持恒定。
图4.2年龄和阉割对胸腺细胞亚群增殖的影响。(A)构成总增殖群的各亚群的比率。在增殖群中CD8+T细胞的比率显著增加。(B)增殖的各亚群的百分比。2岁的TN和CD8亚群比2个月的有着显著少的增殖。阉割后2周，TN群回复到正常幼年增殖水平，而CD8群在增殖上表现出显著的增加。至阉割后4周，该水平与正常幼年水平相等。(C)虽然随着年龄和阉割后总TN增殖保持恒定，但是随着年龄TN1亚群增殖的显著降低，至阉割后4周没有回复到正常水平(D)。***＝高的显著性，P＜0.001，**＝显著性，P＜0.01。
图5通过IT FITC标记测定的1岁和2岁小鼠的迁移率。幼年成鼠的迁移率是每天1％。所用对照为没有注射的动物。随着年龄迁移率保持恒定。
图6用化疗药环磷酰胺治疗后，胸腺、脾和淋巴结细胞数目的变化。注意治疗后1周和2周，与未阉割(只给予环磷酰胺)组相比，阉割动物中胸腺的快速扩张。另外，与只给予环磷酰胺的组相比，阉割组的脾和淋巴结中的数目显著增加。至4周，细胞数目正常。(各治疗组和时间点的n＝3-4)。
图7放射(625拉德)后，胸腺、脾和淋巴结细胞数目的变化。注意与未阉割(只放射)组相比，治疗后1周和2周，阉割动物胸腺的快速扩张。至4周，细胞数目正常。(各治疗组和时间点的n＝3-4)。
图8放射后，胸腺、脾和淋巴结细胞数目的变化。注意与未阉割组相比，治疗后1周和2周，阉割动物胸腺的快速扩张。但是，所观察到的差异没有小鼠在治疗前1周阉割明显(图8)。至4周，细胞数目正常。(各治疗组和时间点的n＝3-4)。
图9用化疗药环磷酰胺治疗后，胸腺、脾和淋巴结细胞数目的变化。注意与未阉割(只给予环磷酰胺)组相比，治疗后1周和2周，阉割动物胸腺的快速扩张。另外，与只给予环磷酰胺的组相比，阉割组的脾和淋巴结中的数目也显著增加。至4周，细胞数目正常。(各治疗组和时间点的n＝3-4)。环磷酰胺治疗后，在免疫系统的再生方面，化学阉割与外科阉割类似。
图10用HSV-1进行脚垫免疫接种后淋巴结细胞构成。注意与未阉割组相比，老年阉割后的细胞构成增加。下面的图说明通过FACS门控(gate)CD25对CD8细胞时总的活化细胞的数目。
图11说明在HSV-1免疫接种后，淋巴结中活化细胞比率的流式细胞计量术的点图的实例。活化细胞是CD25/CD8双阳性的(double positive)。
图12在HSV-1接种后，在活化LN中在CTL上的Vβ10表达。注意阉割后老年小鼠的克隆反应(clonal response)的dimunition和期望反应的恢复。
图13Ly5同类系小鼠在骨髓移植后，胸腺、脾、淋巴结和骨髓细胞数目的变化。注意与未阉割组相比，在治疗后的所有时间点，阉割动物胸腺的快速扩张。另外，与只给予环磷酰胺的组相比，阉割组的脾和淋巴结中的数目显著增加。(各治疗组和时间点的n＝3-4)。与未阉割动物相比，阉割小鼠的同类系(Ly5.2)细胞显著增加(未给出数据)。
图14胎肝重构后，阉割和未阉割小鼠的胸腺细胞数目的变化。各试验组的n＝3-4。(A)2周时，阉割小鼠的胸腺细胞数目处于正常水平，并且显著性地高于未阉割小鼠的(*p≤0.05)。四周后观察到阉割小鼠的胸腺(thumii)肥大。未阉割的细胞数目依然低于对照水平。(B)CD45.2+细胞-CD45.2+是表示源于供者的标记。重构后两周，阉割和未阉割小鼠中均出现源于供者的细胞。治疗后四周，阉割小鼠的胸腺中约85％的细胞源于供者。在未阉割小鼠的胸腺中则没有源于供者的细胞。
图15在致死放射和胎肝重构后，源于供者的胸腺细胞群的CD4对CD8 FACS图。各象限的百分比在各图的右侧给出。年龄匹配的对照图是8个月大的Ly5.1同类系小鼠胸腺。阉割和未阉割小鼠的胸腺在D45.2+细胞上门控，只显示源于供者的细胞。重构后两周，阉割和未阉割小鼠之间胸腺细胞亚群没有差异。
图16在致死放射、胎肝重构和阉割后的骨髓和淋巴树突细胞(DC)数目。各试验组小鼠的n＝3-4。以下图的对照(白色)棒基于在未治疗的年龄匹配小鼠中发现的树突细胞的正常数目。(A)源于供者的骨髓树突细胞—重构后两周，未阉割小鼠中出现正常水平的DC。在同一时间点，阉割小鼠有显著性更多的DC。(*P≤0.05)。在四周时，阉割小鼠的DC数目依然高于对照水平。(B)源于供者的淋巴树突细胞—重构后两周，阉割小鼠的DC数目是未阉割小鼠DC数目的两倍。治疗后四周，DC数目依然高于对照水平。
图17胎肝重构后，阉割和未阉割小鼠的总细胞数目和CD45.2+骨髓细胞数目的变化。各试验组小鼠的n＝3-4。(A)总细胞数目—重构后两周，骨髓细胞数目正常，并且阉割和未阉割小鼠之间在细胞数目上没有显著性差异。重构后四周，阉割和未阉割小鼠之间在细胞数目上有显著性差异(*p≤0.05)。(B)CD45.2+细胞数目—就骨髓中的CD45.2+细胞数目而言，重构后两周，阉割和未阉割小鼠之间没有显著性差异。四周时，阉割小鼠的CD45.2+细胞数目依然高。在同一时间点，未阉割小鼠中没有源于供者的细胞。
图18胎肝重构后，骨髓中的T细胞和源于骨髓和淋巴的树突细胞(DC)的变化。各试验组小鼠的n＝3-4。以下图中的对照(白色)棒基于在未治疗的年龄匹配小鼠中发现的T细胞和树突细胞的正常数目。(A)T细胞数目—重构后两周和四周，阉割和未阉割小鼠中的数目均减少。(B)源于供者的骨髓树突细胞—重构后两周，阉割和未阉割小鼠的DC细胞数目均正常。在这个时间点，阉割和未阉割小鼠中的数目之间没有显著性差异。(C)源于供者的淋巴树突细胞—重构后两周和四周，数目在正常水平。两周时，阉割和未阉割小鼠中的数目之间没有显著性差异。
图19胎肝重构后，阉割和未阉割小鼠的总细胞数目和CD45.2+脾细胞数目的变化。各试验组小鼠的n＝3-4。(A)总细胞数目—重构后两周，细胞数目减少，并且阉割和未阉割小鼠中的数目之间没有显著性差异。重构后四周，阉割小鼠中细胞数目接近正常水平。(B)CD45.2+细胞数目—重构后两周，就脾中的CD45.2+细胞数目而言，阉割和未阉割小鼠之间没有显著性差异。四周时，阉割小鼠中CD45.2+细胞数目依然高。在同一时间点，未阉割小鼠中没有源于供者的细胞。
图20胎肝重构后，脾在T细胞和源于骨髓和淋巴的树突细胞(DC)方面的变化。各试验组小鼠的n＝3-4。以下图中的对照(白色)棒基于在未治疗的年龄匹配小鼠中发现的T细胞和树突细胞的正常数目。(A)T细胞数目—重构后两周和四周，阉割和未阉割小鼠中的数目均减少。(B)源于供者的骨髓树突细胞—重构后两周和四周，阉割和未阉割小鼠中的DC细胞数目均正常。两周时，阉割和未阉割小鼠中的数目之间没有显著性差异。(C)源于供者的淋巴树突细胞—重构后两周和四周，数目在正常水平。两周时，阉割和未阉割小鼠中的数目之间没有显著性差异。
图21胎肝重构后，阉割和未阉割小鼠的总细胞数目和CD45.2+淋巴结细胞数目的变化。各试验组小鼠的n＝3-4。(A)总细胞数目—重构后两周，细胞数目在正常水平，并且阉割和未阉割小鼠之间在细胞数目方面没有显著性差异。重构后四周，阉割小鼠的细胞数目在正常水平。(B)CD45.2+细胞数目—重构后两周，就淋巴结中的CD45.2+细胞数目而言，阉割和未阉割小鼠之间没有显著性差异。四周时，在阉割小鼠中的CD45.2细胞数目依然高。在同一时间点，未阉割小鼠中没有源于供者的细胞。
图22胎肝重构后，在肠系膜淋巴结中T细胞和源于骨髓和淋巴的树突细胞(DC)的变化。各试验组小鼠的n＝3-4。以下图中的对照(白色)棒基于在未治疗的年龄匹配小鼠中发现的T细胞和树突细胞的正常数目。(A)T细胞数目—重构后两周和四周，阉割和未阉割小鼠中的数目均减少。(B)源于供者的骨髓树突细胞—重构后两周，阉割和未阉割小鼠的DC数目均正常。四周时，它们减少。两周时，阉割小鼠和未阉割小鼠中的数目之间没有显著性差异。(C)源于供者的淋巴树突细胞—重构后两周和四周，数目在正常水平。两周时，阉割和未阉割小鼠中的数目之间没有显著性差异。
发明的详细描述短语“改变T细胞群组成”指改变由功能和特性分子的表达定义的T细胞亚群的性质和/或比率。这些特性分子的实例包括，但不限于，T细胞受体、CD4、CD8、CD3、CD25、CD28、CD44、CD62L和CD69。
短语“增加T细胞的数目”指患者的胸腺和/或循环和/或脾和/或骨髓和/或外周组织如淋巴结、胃肠道、泌尿生殖道和呼吸道中的T细胞数目的绝对增加。该短语还指T细胞的相对增加，例如当与B细胞相比时。
“具有被抑制的或异常的T细胞群或功能的患者”包括患有癌症的个体，特别是已接受化学治疗或者放射治疗的患者，或已接受骨髓移植的患者，或者乳腺癌和前列腺癌患者，或者任何导致T细胞异常或细胞介导的免疫功能下降的癌症或增殖性疾病。该短语还包括感染了人免疫缺陷病毒的个体，特别是患有艾滋病的患者。另外，该短语包括任何青春期后的患者，特别是因青春期后胸腺萎缩而免疫反应下降和疾病发病率增加的老年人。该短语还包括患有子宫内膜异位症、自身免疫疾病、变态反应、过敏或者任何免疫功能障碍的患者。该患者可以已接受同种异体骨髓移植，或者是化学治疗后的白血病患者，如CLL和低级的霍奇金淋巴瘤患者，他们被如氟达拉滨、克拉屈滨、地塞米松和2-细胞脱氧腺苷(2-cytodeoxyadenosine)的药物治疗，这些药物对T细胞是严重毒性的。
“佐剂”指增强抗原组合物的免疫原性和疗效的一种或多种物质。合适佐剂的非限制性实例包括角鲨烷和角鲨烯(或者其它动物源的油)；嵌段共聚物；洗涤剂如吐温-80；Quil-A，矿物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；源于棒状杆菌属的佐剂如短小棒状杆菌；源于丙酸杆菌属的佐剂如痤疮丙酸杆菌；牛型结核分枝杆菌(Bacillus Calmetic和Guerinn或卡介苗)；白细胞介素如白细胞介素2和白细胞介素12；单核因子如白细胞介素1；肿瘤坏死因子；干扰素如γ干扰素；组合如皂苷-氢氧化铝或Quil-A氢氧化铝；脂质体；iscom佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成糖肽如胞壁酰二肽或其它衍生物；阿夫立定；脂质A；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或有磷酸铝的或DHAE-葡聚糖；羧基聚亚甲基如Carbopol′EMA；丙烯酸共聚物乳剂如Neocryl A640(例如美国专利5 047 238)；牛痘或动物病毒蛋白；亚病毒颗粒佐剂如霍乱菌毒素，或其混合物。
关于降低器官移植后患者的宿主抗移植物反应的方法，首先去除宿主淋巴细胞(例如通过放射或化学治疗)。其后是与破坏性类固醇信号传导至胸腺相联的供者骨髓/干细胞移植，以建立嵌合体，其包括在宿主胸腺内建立供者细胞，供者细胞包括树突细胞，以导致新育的宿主T细胞对供者的耐受。在中枢耐受的建立后，宿主将接受源于供者的干细胞移植物。
容易理解，可以以许多方式破坏性类固醇信号传导至胸腺，例如，抑制性类固醇产生或者阻断胸腺中的性类固醇受体。抑制性类固醇产生可以，例如，通过阉割、给予性类固醇类似物，以及其它公知的技术实现。在一些临床案例中，通过外科阉割以永久去除生殖腺是合适的。在优选的实施方案中，通过给予性类固醇类似物而破坏性类固醇信号传导至胸腺，优选是给予促黄体生成激素释放激素。目前优选的类似物是地洛瑞林(在美国专利4218439中描述)。
性类固醇类似物及它们在治疗和“化学阉割”中的用途是公知的。这些类似物的实例包括氟他米特(在FR7923545、WO 86/01105和PT100899中描述)、戈舍瑞林(在US4100274、US4128638、GB9112859和GB9112825中描述)、醋酸亮丙瑞林(在US4490291、US3972859、US4008209、US4005063、DE2509783和US4992421中描述)、dioxalan衍生物如在EP413209中所描述的、曲普瑞林(在US4010125、US4018726、US4024121、EP 364819和US5258492中描述)、美它瑞林(在EP 23904中描述)、布舍瑞林(在US4 003884、US4118483和US4275001中描述)、组氨瑞林(在EP217659中描述)、那法瑞林(在US4234571、WO 93/15722和EP52510中描述)、黄体瑞林(在US4089946中描述)、亮丙瑞林(在Plosker等中描述)和LHRH类似物如在EP181236、US4608251、US4656247、US4642332、US4010149、US3992365和US4010149中描述的。以上提及的各文献均引入本文作参考。
正如本领域技术人员将理解的那样，至少某些用以破坏性类固醇信号传导至胸腺的方法只有给予合适的化合物才是有效的。结果是，本发明某些实施方案的优点是，一旦达到了本发明所期望的免疫效果，(2-3个月)就可以停止治疗，患者的生殖系统将恢复正常。
正如将会被理解的那样，术语“器官”以其最宽的含意而被使用，并且包括皮肤、肾、肝、心脏、肺等。
为了进行三色免疫荧光法，用抗αβ TCR-FITC或抗γδ TCR-FITC、抗CD4-PE和抗CD8-APC(均从Pharmingen，圣地亚哥，加利福利亚州获得)对胸腺细胞进行常规标记，接下来进行流式细胞计量分析。脾和淋巴结悬浮液用αβ TCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或有CD4-PE和CD8-APC的B220-B(Sigma)标记。B220-B用购自Caltag Laboratories，Inc.，Burlingame，加利福利亚州的链霉抗生物素-三色缀合物显示。
为了进行BrdU检测，将细胞用CD-4-PE和CD8-APC表面标记，然后固定并透化，如以前所描述的(Carayon和Bord，1989)。简言之，染色细胞于4℃固定在1％PFA/0.01％吐温-20中；为了使DNA变性，洗涤过的细胞于37℃在500微升脱氧核糖核酸酶(100 Kunitz单位，Boehringer Mannheim，西德)中保温30分钟。最后，细胞与抗BrdU FITC(Becton-Dickinson)一起保温。
为了进行四色免疫荧光法，对胸腺细胞CD3、CD4、CD8、B220和Mac-1进行标记，它们一起由抗鼠Ig-Cy5(Amersham，英国)检测，而且为了分析，对阴性细胞(TN)进行门控。用CD25-PE(Pharmingen)和CD44-B(Pharmingen)进一步将它们染色，接着用链霉抗生物素-三色(Catlag，CA)染色，如以前所描述的(Godfrey和Zlotnik，1993)。然后如上述进行BrdU检测。
样品在FacsCalibur(Becton-Dickinson)上分析。根据0°和90°光散射图门控活的淋巴细胞，并用Cell quest软件(Becton-Dickinson)分析数据。免疫组织学冷冻的胸腺切片(4微米)用低温控制器(Leica)切割并立即固定在100％丙酮中。
为了进行二色免疫荧光法，切片用单克隆抗体系列MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35和44(Godfrey等，1990；表1)双标记，这些抗体由本实验室制备，并用多价兔抗细胞角蛋白Ab(Dako，Carpinteria，加利福利亚州)评价上皮细胞决定簇的共表达。结合的mAb用FITC缀合的绵羊抗鼠Ig(SilenusLaboratories)显示，抗细胞角蛋白用TRITC缀合的山羊抗兔Ig(Silenus Laboratories)显示。
为了检测溴脱氧尿苷，切片用抗细胞角蛋白染色，接着用抗兔-TRITC染色，或者用特异性mAb着色，然后切片用抗鼠Ig-Cy3(Amersham)显示。如以前描述的进行BrdU检测(Penit等，1996)。简言之，切片被固定于70％乙醇中30分钟。半干的切片在4摩尔/升HCl中保温，并用硼酸盐缓冲液(Sigma)洗涤以中和，接着在PBS中洗涤两次。用抗Brdu-FITC(Becton Dickinson)检测BrdU。
为了进行三色免疫荧光法，切片用特异性MTS mAb和抗细胞角蛋白一起标记。如上述进行BrdU检测。
用Leica荧光显微镜和Nikon聚焦显微镜分析切片。迁移研究通过腹膜内注射0.3毫升0.3毫克赛拉嗪(甲苯噻嗪；BayerAustralia Ltd.，Botany新南威尔士，澳大利亚)和1.5毫克盐酸氯胺酮(可达眠；Parke-Davis，Caringbah，新南威尔士，澳大利亚)在盐水中的溶液麻醉动物。
胸腺细胞的FITC标记技术的细节与文献(Scollay等，1980；Berzins等，1998)所述相似。简言之，将胸腺叶暴露并向各叶注射约10微升350微克/毫升FITC(在PBS中)。伤口用外科棉线缝合，鼠被暖至从麻醉中完全苏醒。注射后约24小时，通过CO2窒息处死小鼠并取出淋巴器官以进行分析。
细胞计数后，用抗CD4-PE和抗CD8-APC将样品染色，然后通过流式细胞计量术分析。迁移细胞被识别为表达CD4或CD8的活门控FITC+细胞(以忽略自身荧光细胞和双峰)。将FITC+CD4和CD8细胞的百分数相加，以分别得到淋巴结和脾的总迁移百分比。按Berzins等(1998)以前所描述的计算日输出率。
用不成对斯氏t检验或非参数Mann-Whitney检验分析数据，以确定对照和至少平行进行三份的试验测试结果之间的统计显著性。试验值与对照值有显著性差异，表示如下*p≤0.05，**p≤0.01和***p≤0.001。结果年龄对胸腺细胞群的影响(i)胸腺重量和胸腺细胞数目随着年龄增加，胸腺重量(图1A)和总胸腺细胞数目(图1B)都有高显著性(p≤0.0001)下降。幼年成体的相对胸腺重量(毫克胸腺/克体重)平均值为3.34，到18-24个月该值降至0.66(脂肪沉积限制了精确计算)。胸腺重量的降低可以归因于总胸腺细胞数目的降低1-2个月的胸腺含有约6.7×107个胸腺细胞，到24个月时降至约4.5×106个细胞。通过阉割去除性类固醇对胸腺的影响，再生发生，而且至阉割后4周，胸腺重量和细胞数目均与幼年成体相同(图1A和图1B)。有趣的是，在阉割后2周胸腺细胞数目有显著性(p≤0.001)增加(约1.2×108)，细胞数目至阉割后4周恢复到正常幼年水平。
由胸腺产生的T细胞数目的降低没有反映在外周，脾细胞数目随着年龄保持恒定(图2A)。外周中的稳态机制是明显的，因为脾和淋巴结中B细胞与T细胞的比率不受年龄和随后的到达外周的T细胞数目降低的影响(图2B)。然而，随着年龄CD4+和CD8+T细胞的比率显著性(p≤0.001)从2个月的2∶1降至2岁的1∶1(图2C)。阉割和随后到达外周的T细胞数目增加后，没有观察到外周T细胞数目的变化脾T细胞数目和脾和淋巴结中B∶T细胞的比率在阉割后没有改变(图2A和B)。阉割后2周，外周CD4∶CD8的比率随年龄的降低仍然明显，但在阉割后4周被完全逆转(图2C)。(ii)αβTCR、γδTCR、CD4和CD8表达为了确定所见的胸腺细胞数目随年龄的降低是否是特定细胞群减少的结果，用定义标记(defining marker)标记胸腺细胞以分析单个的亚群。另外，这样允许进行阉割后胸腺恢复的动力学分析。比较主要胸腺细胞亚群比率与正常幼年胸腺的该比率(图3)，发现其随年龄保持一致。另外，通过αβTCR和γδTCR表达的胸腺细胞的进一步再分未显示这些群的比率随年龄的变化(未给出数据)。阉割后2和4周，胸腺细胞亚群保持相同的比率，并且因为胸腺细胞数目阉割后增加100倍，这表明所有胸腺细胞亚群的同步扩张而不是扩张的发展进展。
因此，在老年动物胸腺中所见的细胞数目降低似乎是所有细胞表型平衡的减少的结果，没有检测到T细胞群的显著变化。胸腺细胞再生以同步方式发生，同时而非依次补充所有T细胞亚群。胸腺细胞的增殖如图4.1所示，在4-6周时，15-20％的胸腺细胞增殖。胸腺细胞的大多数(约80％)是DP，而TN亚群组成第二大群，其为6％(图4.2A)。因此，大部分分裂通过免疫组织学在被膜下和皮质中见到(未给出数据)。一些分裂用显示SP细胞(9％的CD4 T细胞和25％的CD8 T细胞)分裂比率的FACS分析在髓质区见到(图4.2B)。
尽管在老年胸腺中细胞数目显著地降低，胸腺细胞的增殖保持恒定，在2岁时降至12-15％(图4.1)，增殖群的表型与2个月的胸腺相似(图4.2A)。免疫组织学显示1岁时的分裂，以反映在幼年成体所见的分裂，但是2岁时，增殖主要在外皮质和围管结构周围见到(未给出数据)。阉割后2周，尽管胸腺细胞数目显著地增加，但增殖的胸腺细胞的比率没有变化，这再次表明细胞的同步扩张(图4.1)。免疫组织学显示阉割后2周的胸腺细胞增殖的定位和分裂细胞的程度与2个月大的胸腺的情况相似(未给出数据)。当分析代表增殖群的各亚群的比率时，增殖群内的CD8 T细胞的百分比有显著性(p＜0.001)增加(2个月和2岁时为1％，阉割后2周增加到约6％)(图4.2A)。
图4.2B说明幼年、老年和阉割小鼠中各亚群的增殖程度。DN亚群的增殖有显著性(p≤0.001)减退(由2个月时的35％至2岁时的4％)。CD8+T细胞的增殖也显著性(p＜0.001)降低，反应了免疫组织学的结果(未给出数据)，而老年胸腺的髓质中的分裂都不明显。至阉割后4周，DN增殖的降低没有回复到的正幼年水平。但是，阉割后2周，CD8+T细胞亚群的增殖显著性(p≤0.001)增加，在阉割后4周回复到正常幼年水平。
用标记CD44和CD25进一步分析DN亚群增殖的降低。除了胸腺细胞前体，DN亚群还包含αβTCR+CD4-CD8-胸腺细胞，这些胸腺细胞被认为在转化为SP细胞时已经减量调解两种共同受体(Godfrey和Zlotnik，1993)。通过在这些成熟细胞上门控，可能分析真实TN区室(CD3-CD4-CD8-)，它们的增殖速率随年龄或阉割后没有显示差异(图4.2C)。但是，表达CD44和CD25的亚群的分析显示TN1亚群(CD44+CD25-)增殖的显著性(p＜0.001)降低，从正常幼年时的20％降至18个月时的约6％(图4.2D)，其在阉割后4周被恢复。TN1亚群增殖的降低由TN2亚群(CD44+CD25-)增殖的显著性(p≤0.001)增加补偿，TN2亚群至阉割后2周回复到正常幼年水平(图4.2D)。年龄对胸腺微环境的影响使用来自MTS系列的，用多克隆抗细胞角蛋白Ab双标记的mAb的广泛系列，通过免疫荧光法检测胸腺微环境随年龄的变化。
被这些mAb识别的抗原可以再分成三组胸腺上皮亚群、血管关联的抗原和那些在基质细胞和胸腺细胞上都存在的。(i)上皮细胞抗原2岁大小鼠胸腺的抗角蛋白染色(全-上皮)显示常规胸腺结构的丧失，伴随严重的上皮细胞解体和明显的皮质-髓质连接。使用mAb、MTS 10(髓质)和MTS44(皮质)的进一步分析显示皮质大小随年龄显著减小，而髓质上皮有更少的实际减少(未给出数据)。用抗细胞角蛋白标记明显看出，老年胸腺的没有上皮细胞的区域或角蛋白阴性区(KNA′s，van Ewijk等，1980；Godfrey等，1990；Bruijntjes等，1993)更加明显且大小增加。在老年胸腺中还出现了胸腺上皮“囊状”结构，在髓质区特别明显(未给出数据)。用抗细胞角蛋白染色确定地显示了脂肪沉积、胸腺大小的严重减小和皮质-髓质连接完整性的降低(未给出数据)。如图2.1所示，阉割后2周胸腺开始再生。这在胸腺叶的大小(a)、由MTS 44显示的皮质上皮的增加(b)和髓质上皮的定位(c)方面是明显的。髓质上皮通过MTS 10检测，2周时仍有被MTS 10染色的上皮亚囊(subpocket)分散在整个皮质中。至阉割后4周，出现明显的髓质、皮质和可辨认的皮质-髓质连接(未给出数据)。
标记MTS 20和24被提出用来检测原上皮细胞(Godfrey等，1990)并进一步说明老年胸腺的再生。它们在4-6周大量存在于E14中，检测分离的髓质上皮细胞簇，但是老年胸腺密度再次增加(未给出数据)。阉割后，所有这些抗原以与幼年成体胸腺相同的水平表达，MTS 20和24回到位于皮质-髓质连接的上皮的不连续的亚囊中。(ii)血管关联的抗原血-胸腺屏障被认为是T细胞前体迁移到胸腺和成熟T细胞从胸腺迁移到外周的原因。
MAb MTS 15对胸腺血管内皮是特异性的，表现颗粒状的、扩散染色模式(Godfrey等，1990)。在老年胸腺中，MTS 15的表达显著增加，反映了血管和血管周围间隙的增加的频率和大小(未给出数据)。
用mAb MTS 16检测含有重要结构和细胞粘附分子如胶原蛋白、层粘连蛋白和纤维蛋白原的胸腺细胞外基质。分散于整个正常幼年胸腺中，MTS 16表达的性质在老年胸腺中变得更加广泛并互相联系。MTS 16的表达在阉割后2周进一步增加，而阉割后4周，这种表达代表了2个月胸腺的情况(未给出数据)。(iii)共享抗原通过髓质上皮的弱染色，由mAb MTS 6检测的正常幼年胸腺中的MHCII表达在皮质上皮上(Godfrey等，1990)呈强烈阳性(颗粒状)。老年胸腺显示MHC II表达的降低，阉割后2周，该表达有实际的增加。至阉割后4周，表达再次降低并与2个月大的胸腺相似(未给出数据)。胸腺细胞迁移幼年小鼠中每天约有1％的T细胞从胸腺迁移出(Scollay等，1980)。我们发现尽管在数目上显著性(p≤0.001)地减少，但迁移以与14个月甚至2岁的正常幼年小鼠相同的比率的速率发生(图5)。新近胸腺迁移细胞的CD4∶CD8比率从2个月时的约3∶1增加到26个月时的约7∶1。至阉割后1周，迁移到外周的细胞数目显著增加，而总迁移率保持在1-1.5％不变。实施例2化学治疗或放射诱导的胸腺萎缩的逆转放射或环磷酰胺治疗后，阉割小鼠(治疗前一周或治疗当天)胸腺再生速率显著增加。
在胸腺中，照射后的小鼠胸腺结构严重破坏，同时伴有快速分裂细胞的减少。皮质萎陷、老年/氢化可的松治疗的胸腺的回现(reminiscent)，显示DN和DP胸腺细胞的损失。CD4+和CD8+SP胸腺细胞上的αβ-TCR表达有减量调节—编程性细胞死亡的细胞的证据。相比较而言，环磷酰胺治疗的动物胸腺结构的破坏不太严重，并且DN和DP胸腺细胞再生速率更快。
至治疗后1周，甚至在这一较早阶段，阉割小鼠也表现显著的胸腺再生(图6、7和8)。相比较而言，未阉割小鼠表现DN和DP胸腺细胞(快速分裂细胞)的严重损失和随后的CD4与CD8细胞(抗放射)比率的增加。胸腺细胞数目的差异最好地说明了这一点，阉割动物在治疗后1周胸腺大小至少增加4倍。至2周时，随着DN和DP胸腺细胞二者的再生，未阉割动物表现出相对的胸腺细胞规度。但是，胸腺细胞的比率仍不等于幼年成体对照胸腺。实际上，2周时，阉割和未阉割小鼠之间调节速率的巨大差异最大(至4周时，治疗组之间的胸腺细胞数目相等)。
有趣的是，胸腺大小似乎越过对照鼠的基线，表明胸腺内的快速扩张，同时这些新生胸腺细胞的迁移还未发生(胸腺细胞迁移出并进入外周需要约3-4周)。因此，尽管各亚群中的比率相等，但胸腺细胞数目在被释放放入外周之构建。
图9说明与外科阉割相比，化学阉割在促进T细胞再生方面的用途。化学阉割的动力学比外科阉割慢得多，也就是说，小鼠需要约3周多的时间降低它们的循环性类固醇水平。但是，化学阉割在再生胸腺方面仍是有效的，如图9所示。实施例3性类固醇抑制后的胸腺再生导致缺乏的外周T细胞功能的恢复为了确定阉割是否能够增强免疫应答，检测单纯疱疹病毒(HSV)免疫，因为它允许研究疾病进展和CTL(细胞毒性)T细胞的作用。阉割小鼠具有性质上和数量上改善的对病毒的反应性。小鼠脚垫免疫，免疫后第5天分析腘(导液(draining))淋巴结。另外，取脚垫并将其均化，以确定整个试验中的特定时间的病毒滴度。
免疫后第5天，阉割小鼠比老年小鼠有显著大的淋巴结细胞构成(图10)。另外，淋巴结内的活化细胞数目与老年对照相比显著增加(图10和11)。进一步，活化细胞数目与在幼年成体中发现的活化细胞数目相关，表明阉割小鼠中的CTL在更大程度被活化，但是由于B细胞活化，幼年成体可能具有增大的淋巴结。
在CTL响应HSV中Vβ10的使用在免疫后有40％的偏离。当分析老年和阉割小鼠的Vβ表达时，发现其在幼年成体和阉割小鼠中是主要的。但是，没有观察到老年小鼠有这种偏离(图12)。这表明为了得到最大的免疫应答性，在整个一生中的提高的胸腺T细胞产生的至关重要的需求。实施例4性类固醇的抑制促进新的造血前体细胞被吸收入胸腺，其使宿主和供者的淋巴细胞(T、B和树突细胞)的嵌合混合物以前的实验已经表明微嵌合体形成在器官移植接受中起重要作用。也已证明树突细胞在对移植物抗原的耐受中起主要作用。因此，研究了阉割对胸腺嵌合体形成和树突细胞数目的影响。
在同基因试验中，每个治疗组使用4只3个月大的小鼠。所有对照均年龄匹配且未经治疗。在同类系试验中，每个治疗组使用3-4只8个月大的小鼠。所有对照均年龄匹配且未经治疗。同基因小鼠致死放射、胎肝重构和阉割后的胸腺变化阉割和未阉割重构小鼠的总胸腺细胞数目与未治疗的年龄匹配的对照进行比较，并总结于图12中。治疗后一周，阉割和未阉割小鼠的白细胞数目均低于对照的，但它们之间没有显著性差异。3周后，细胞数目仍低于对照水平，但是，阉割小鼠的细胞数目比未阉割小鼠的高3倍(p＜0.05)(图13A)。致死放射、同基因胎肝重构和阉割后的脾变化阉割和未阉割小鼠中，放射和重构后1到3周，脾中的总细胞数目显著降低。阉割和未阉割的治疗组之间，总脾细胞数目没有统计上的显著性差异(图13B)。致死放射、同基因胎肝重构和阉割后的肠系膜淋巴结变化阉割和未阉割小鼠中，放射和重构后1周，肠系膜淋巴结细胞数目显著降低。但是，至3周时间点，细胞数目已经达到对照水平。阉割和未阉割的治疗组之间，淋巴结细胞数目没有统计上的显著性差异(图13C)。同类系小鼠致死放射、胎肝重构和阉割后的胸腺变化在未阉割小鼠中，4周时间胸腺细胞数目显著降低，没有或几乎没有再生的证据(图14A)。但是在阉割组中，至两周时，已经有广泛的胸腺生成(thymopoiesis)，其至4周时已返回对照水平，比未阉割小鼠高10倍。关于CD45.2(源于供者的抗原)的胸腺流式细胞计量分析表明，4周时，在未阉割组中没有可检测的源于供者的细胞，但值得注意的是，在这个时间点阉割小鼠中实际上所有胸腺细胞都是源于供者的(图14B)。产生源于供者的造血前体的胸腺生成的广泛增强，确定T细胞分化是否正常进行是重要的。用流式细胞计分析CD4、CD8和TCR定义的亚群。重构后2周，胸腺细胞亚群比率没有比率上的变化(图15)。这个观察结果在4周时是不可能的，因为未阉割小鼠没有用源于供者的细胞重构。但是，在这个时间点，阉割小鼠中的胸腺细胞比率表现正常。
胎肝重构后两周，阉割小鼠中源于供者的骨髓树突细胞(定义为CD45.2+Mac1+CD11C+)显著性地多于未阉割小鼠，差别是4倍(p＜0.05)。治疗后四周，阉割小鼠中源于供者的骨髓树突细胞数目仍高于对照水平(图16A)。胎肝重构后2周，阉割小鼠的胸腺中源于供者的淋巴树突细胞(定义为CD45.2+Mac1-CD11C+)的数目是在未阉割小鼠中发现的两倍。治疗后四周，阉割小鼠中源于供者的淋巴树突细胞数目仍高于对照(图16B)。
重构和阉割后4周，对CD11C、上皮(抗角蛋白)和CD45.2(源于供者的标记)的免疫荧光染色使树突细胞定位到胸腺的皮质髓质连接和髓质区。用共定位软件确证了这些细胞的供者来源(未给出数据)。流式细胞计量数据表明重构后4周，胸腺中约85％的细胞是源于供者的，这支持上述观点。致死放射、胎肝重构和阉割后骨髓中的变化阉割和未阉割重构小鼠骨髓中的细胞数目与未治疗的年龄匹配对照的细胞数目进行比较，并总结于图17A中。重构后两周和四周，阉割小鼠的骨髓细胞数目正常。未阉割小鼠的骨髓细胞数目在两周时正常，但在四周时显著降低(P＜0.05)。不过，在该时间点，未阉割小鼠未用源于供者的细胞重构。
关于CD45.2(源于供者的抗原)的骨髓流式细胞计量分析表明，重构后4周，未阉割小鼠的骨髓中没有可检测的源于供者的细胞，但是，在这一时间点，阉割小鼠中几乎所有的细胞均是源于供者的(图17B)。
重构后两周，阉割和未阉割小鼠的源于供者的T细胞数目均显著低于在对照小鼠中发现的数目(p＜0.05)。在4周时，未阉割小鼠的骨髓中没有源于供者的T细胞，阉割小鼠中的T细胞数目仍低于对照水平(图18A)。
重构后2周，在未阉割和阉割小鼠的骨髓中源于供者的、骨髓和淋巴树突细胞为对照水平。治疗后四周，阉割小鼠中的数目进一步降低，在未阉割组中没有发现源于供者的细胞(图18B)。致死放射、胎肝重构和阉割后的脾变化阉割和未阉割重构小鼠的脾细胞数目与未治疗的年龄匹配的对照进行比较，结果总结于图19A。治疗后两周，阉割和未阉割小鼠的脾细胞数目均接近对照的50％。至四周时，阉割小鼠中的数目接近正常水平，但是，未阉割小鼠中的数目仍降低。CD45.2(源于供者)流式细胞计量数据表明，重构后2周，阉割和未阉割小鼠的源于供者的细胞数目没有显著性差异(图19B)。4周时，未阉割小鼠的脾内没有可观察到的源于供者的细胞，但是，阉割小鼠中几乎所有的脾细胞都是源于供者的。
重构后两和四周，阉割和未阉割小鼠中的T细胞数目均显著降低(p＜0.05)(图20A)。胎肝重构后两周，发现未阉割和阉割小鼠中源于供者的骨髓和淋巴树突细胞(分别为图20A和B)处于对照水平。4周时，未阉割小鼠的脾内没有可检测到的源于供者的树突细胞，阉割小鼠中的数目仍降低。致死放射、胎肝重构和阉割对肠系膜淋巴结数目的影响阉割和未阉割的重构小鼠的淋巴结细胞数目与未治疗的年龄匹配的对照进行比较，并总结于图21A中。重构后两周，阉割和未阉割小鼠中的细胞数目均在对照水平。重构后四周，阉割小鼠中的细胞数目仍在对照水平，但未阉割小鼠中的细胞数目显著降低(图21B)。关于CD45.2的流式细胞计量分析表明，重构后2周，阉割和未阉割小鼠中的源于供者的细胞数目没有显著差异(图21B)。重构后4周，未阉割小鼠中没有可观察到的源于供者的细胞。但是，在相同的时间点，阉割小鼠中实际上所有的淋巴结细胞均是源于供者的。
重构后两和四周，阉割和未阉割小鼠中源于供者的T细胞数目均低于对照水平。4周时，阉割小鼠中的数目仍低，未阉割小鼠的淋巴结内没有源于供者的T细胞(图22)。胎肝重构后两周，发现未阉割和阉割小鼠中源于供者的骨髓和淋巴树突细胞处于对照水平(分别为图22A和B)。治疗后四周，源于供者的骨髓树突细胞数目降到对照水平以下，但是，淋巴树突细胞数目保持不变。
如以前所证明，胸腺重量随年龄显著降低(Hirokawa和Makinodan，1975，Aspinall，1997)并与胸腺细胞数目显著降低有关。由阉割技术诱导的，可能因皮质甾类的作用而导致胸腺进一步萎缩的紧张，通过性类固醇影响的去除而被克服，阉割2周的胸腺的细胞构成比阉割前的胸腺增加20-30倍。至阉割后3周，老年胸腺在胸腺大小和细胞数目方面显著增加，超过幼年成体胸腺的胸腺大小和细胞说明，推测这是因为性类固醇的作用已经在2个月大的小鼠中发挥它们的作用。
我们的数据证实了以前的发现，该发现强调随年龄，胸腺细胞分化和保持恒定亚群比率的连续的能力(Aspinall，1997)。另外，我们已经证明阉割后同时发生胸腺细胞分化，表示胸腺细胞亚群的同步扩张。由于胸腺细胞数目随年龄显著降低，因此分析胸腺细胞的增殖以确定这是否是胸腺萎缩的原因。
胸腺细胞的增殖不受年龄诱导的胸腺萎缩或阉割后性类固醇影响的去除的影响，所有胸腺细胞的约14％增殖。但是，这种分裂的定位随年龄而变化2个月的小鼠胸腺在整个被膜下和皮质区显示大量分裂(TN和DP T细胞)，同时在髓质中也有一些分裂发生。由于胸腺上皮随年龄的破坏，难以分辨增殖的定位，但是似乎在模式上不如幼年的均一，且移至外层皮质。至阉割后2周，分裂的胸腺细胞在整个皮质检测到，并且在髓质中明显，具有与2个月的胸腺相似的分布。
由CD4和CD8分析确定的增殖群的表型不随年龄或阉割后而改变。但是，胸腺细胞亚群内的增殖分析显示TN和CD8+细胞的增殖均随年龄显著降低。TN亚群中基于标记CD44和CD25的进一步分析显示TN1(CD44+CD25-)群增殖的显著降低，其被TN2(CD44-CD25+)群的增加补偿。TN群中的这些异常反映了Aspinall(1997)的发现。令人惊奇的是，至阉割后2周，TN亚群以正常水平增殖，表明该群对性类固醇作用的抑制的立即反应。此外，阉割后2周和4周，增殖的CD8+T细胞的比率显著高于对照胸腺，可能表明在外周T细胞库的重建中的作用。
证明胸腺细胞迁移随年龄以恒定胸腺细胞比率发生，这与Scollay等(1980)给出的以前的数据冲突，Scollay等表明胸腺细胞迁移到外周的速率的十倍降低。这些结果的差异可能是由于2岁胸腺的胸腺内FITC标记的困难或脂肪沉积对FITC吸收的影响。然而，如Scollay所发现，T细胞迁移的绝对数目显著降低，导致RTE对外周T细胞库的比率显著降低。这将导致主要影响T细胞所有组成成分的外周中的变化(Mackall等，1995)。以前的文章(Mackall等，1995)已经表明T细胞所有组成成分随年龄倾向于记忆而不是原初T细胞表型。但是如果个体遭遇新的病原体，减少的T细胞所有组成成分不能应对，这可能是老年免疫缺陷增多的原因。显然，有在无免疫应答的患者中重建T细胞库的需求。阉割允许胸腺通过显著增加原初T细胞的产生而重见外周。
在外周中，T细胞数目保持在恒定水平，如脾和淋巴结的B∶T细胞比率所证明，可能是因为外周内环境平衡(Mackall等，1995；Berzins等，1998)。但是，外周细胞组成的破坏明显，老年胸腺表现CD4∶CD8比率从幼年成体的2∶1到2岁小鼠的1∶1的显著降低，这可能表明CD4+T细胞更易老化的性质，或来自胸腺外源的CD8+T细胞产生的增加。至阉割后2周，该比率正常，再次反映免疫系统对外科阉割的立即反应。
上述发现首次证明老年胸腺能够以与青春期前的胸腺相同的性质发挥作用。在这方面，T细胞数目显著降低，但胸腺细胞分化的能力没有被干扰。它们的分化和最终迁移到外周的整体能力又受胸腺的与年龄相关的萎缩的影响。但是，注意两个重要的发现。首先，似乎有对TN细胞分化能力的负面影响，与Aspinall(1997)的发现相关。该缺陷可能是由于胸腺细胞自身的固有缺陷。然而我们的数据和以前的工作已经表明胸腺细胞的分化虽然减少，但仍然发生，而且来自BM的干细胞进入也不受年龄的影响(Hirokawa，1998；Mackall和Gress，1997)。这暗示胸腺基质作为性类固醇作用的靶，以及作为结果的该T细胞亚群前体的异常调节。第二，CD8+T细胞的增殖能力随年龄显著降低，而且阉割后，与2个月的小鼠相比，CD8+T细胞增殖的比率显著增加。成熟T细胞的增殖被认为是迁移前的最后步骤(Suda和Zlotnik，1992)，这样CD8+增殖的显著降低将预示它们迁移能力的降低。该假设被我们的发现支持，我们发现RTE中CD4∶CD8 T细胞的比率随年龄增加，预示CD8 T细胞迁移的降低。或者，如果胸腺上皮是CD8 T细胞维持的关键因素，是淋巴基质分子还是细胞因子影响，该因素可能随增加的性类固醇产生干扰。通过去除性类固醇的影响，CD8 T细胞群又可以最佳地增殖。因此，必须详细确定胸腺上皮细胞在阉割前后的状态。
由于缺乏扩张上皮网络的胸腺细胞，皮质似乎随年龄而“萎陷”。阉割后胸腺上皮的最大变化是由MTS 44检测的皮质上皮网络的增加，表明胸腺细胞数目的显著增加。阉割后2周，KNA丰富，并且似乎容纳增殖胸腺细胞，表明胸腺细胞发育正以高于上皮可以应对的速率发生。皮质上皮的增加似乎是因为胸腺结构的延伸而不是该亚群的增殖，因为通过免疫荧光用BrdU染色没有观测到上皮的增殖。
髓质上皮不易受年龄影响，最可能是由于积聚在该区域的T细胞数目较少(由于选择事件，＞95％的胸腺细胞在DP阶段损失)。但是，老年胸腺表现严重的上皮细胞破坏，这由皮质-髓质连接的特征的缺乏，伴随髓质上皮掺入皮质上皮中表明。至阉割后2周，由MTS10染色所检测，髓质上皮在一定程度上重新形成，但是，亚囊仍存在于皮质上皮中。至阉割后4周，皮质和髓质上皮完全重新形成，具有与幼年成体胸腺相似的清晰皮质-髓质连接。
当与阉割前胸腺相比时，阉割后观察到细微的变化，在降低的MHC类II和血-胸腺屏障抗原的表达中最明显。MHCII(由MTS6检测)在老年胸腺中的表达增加，可能与对照中发育的胸腺细胞因其数目减少的降低有关。或者，其可能简单地由于缺乏胸腺细胞的掩蔽，在DP胸腺细胞减少的放射后胸腺中也得到解释(Randle和Boyd，1992)。一旦胸腺细胞数目在阉割后增加，抗原结合部位再次被胸腺细胞的累及所阻断，从而降低免疫荧光的检测。阉割后，老年胸腺中检测血-胸腺屏障(MTS12、15和16)的抗原再次增加并且又回复到幼年成体的表达。由于胸腺萎缩的胸腺细胞掩蔽的缺乏和抗原的高相似性可以解释这种表达增加。或者，发育的胸腺细胞可以给这些抗原的表达提供必要的控制机理，因此当它们减少时，表达是不受控制的。由MTS 20和MTS 24检测的原始上皮抗原在老年胸腺中的表达增加，但在阉割后回复到皮质-髓质连接的上皮亚囊。表这明老年小鼠中缺乏使该上皮前体亚型分化的信号。去除性类固醇导致的阻断，这些抗原可以分化以表达皮质上皮抗原。
以上结果表明胸腺上皮的缺陷，该缺陷使其不能给发育的胸腺细胞提供发育必要的刺激。但是，胸腺上皮和胸腺细胞的共生性质使确定通过性类固醇影响的破坏的精确途径困难。髓质上皮为其正确发育和维持需要皮质T细胞。因此，如果该群减少，髓质胸腺细胞不可能接收适当的信号以发育。这看来特别影响CD8+群。IRF-/-小鼠显示降低的CD8+T细胞数目。因此，确定这些细胞的增殖能力将是令人感兴趣的。
所观察到的TN1亚群增殖的缺陷表明皮质上皮的损失在TCR基因重排的关键阶段影响胸腺细胞发育，在该阶段皮质上皮提供胸腺生成所必需的因子如IL-7和SCF(Godfrey和Zlotnik，1990；Aspinall，1997)。实际上，IL-7-/-和IL-7R-/-小鼠显示与在老年小鼠中看到的胸腺形态相似的胸腺形态(Wiles等，1992；Zlotnik和Moore，1995；von Freeden-Jeffry，1995)。确定IL-7和IL-7R随年龄的变化需要进一步的工作。
总之，老年胸腺仍保持其功能，但是，由于胸腺微环境的结构完整性的缺乏，老年小鼠中发育的胸腺细胞没有如在正常幼年小鼠中看到的一样处于胸腺上皮细胞的严格控制下。因此，这些细胞的增殖、分化和迁移将不处于最佳调节之下，并可能导致外周中自体反应/免疫功能异常T细胞释放的增加。TN以及，特别是CD8+群中的缺陷可能导致在外周T细胞库中所见的随年龄的变化。另外，我们已经详细描述了阉割对胸腺上皮细胞发育和重新形成的影响。使用类固醇受体结合分析进行的胸腺萎缩机理研究以及胸腺上皮亚群在阉割后的胸腺再生中的作用研究目前正在进行。通过阉割的胸腺功能恢复将为再生外周T细胞库提供基本手段，从而在免疫抑制的个体中重建免疫性。
阉割对胸腺结构和T细胞产生的影响在免疫耗竭的动物模型中研究。具体而言，实施例2测定了在亚致死放射和环磷酰胺治疗后阉割对免疫系统恢复的影响。这些免疫耗竭的形式抑制DNA合成，因此靶向于快速分裂的细胞。在胸腺中，这些细胞主要是未成熟皮质胸腺细胞，但是，所有亚群都起作用(Fredrickson和Basch，1994)。在正常健康的老年小鼠中，外周T细胞的性质和数量上的偏差很少导致病理状态。但是，主要问题发生在T细胞严重减少之后，因为胸腺的T细胞再生能力下降。这种结果发生在HIV/AIDS中，特别是癌症治疗中化学治疗和放射治疗之后(Mackall等，1995)。
在亚致死放射和环磷酰胺治疗的小鼠中，阉割显著增强胸腺再生。为了评价占主要由皮质甾类诱导的对外科阉割反应的紧张对胸腺再生的影响，在免疫耗竭的当天和前7天进行阉割。尽管在免疫耗竭后一周就看到胸腺细胞构成和胸腺结构的增加，但主要差异在阉割后两周观察到。这是在免疫耗竭当天或前7天进行阉割的情况。
免疫组织学显示在所有实例中，阉割后2周，胸腺结构表型正常，而未阉割小鼠的胸腺结构解体。全上皮细胞标记表明免疫耗竭在未阉割小鼠的胸腺中引起皮质上皮萎陷和胸腺结构的一般破坏。髓质标记支持该发现。有趣的是，阉割诱导的胸腺再生的第一特征之一是由MTS 16鉴定的胞外基质的明显增量调节。
流式细胞计量分析数据表明阉割小鼠中所有胸腺细胞亚群细胞数目的增加，与免疫荧光法相同。在各时间点，免疫耗竭和阉割后，所有CD4、CD8和αβ-TCR定义的亚群都有同步增加。这是不寻常但一致的结果，因为T细胞发育是渐进过程，预期前体细胞(包含在CD4-CD8-门内)将有初始增加，其可能在第一个时间点之前就已经发生。此外，因为前体代表总胸腺细胞的非常小的比率，所以它们数目的变化可能没有检测到。还分析了阉割对其它细胞，包括巨噬细胞和粒细胞的影响。一般而言，胸腺中巨噬细胞和粒细胞数目很少改变。
在放射和环磷酰胺免疫耗竭模型中，胸腺细胞数目在治疗后两周出现峰值并在治疗后四周降低。在放射或化学治疗后，胸腺重量和细胞构成几乎立即显著降低，约5天后，胸腺再生的第一阶段开始。重构的第一波(第5-14天)被抗放射性的胸腺细胞(主要是双阴性)的增殖引发，这些胸腺细胞引发所有胸腺细胞亚群(Penit和Ezine，1989)。第二降低在第16至第22天观察到，其是由于抗放射性细胞有限的增殖能力，以及骨髓(也受放射影响)产生胸腺前体降低。第二再生阶段是由于源于前体的骨髓对胸腺的补充(Huiskamp等，1983)。
注意成体小鼠中从HSC到成熟T细胞的发育大约需要28天是重要的(Shortman等，1990)。因此，至治疗后4周，仍几乎没有看到外周T细胞的变化并不奇怪。外周被一些胸腺输出支持，但是至治疗后4周，预期在外周发现的T细胞大多数是增殖的抗环磷酰胺或抗放射性的克隆，它们在缺失细胞不存在时扩张。阉割后在外周预期出现几个长期变化，包括，最重要的是TCR所有组成成分由于胸腺输出增加而多样化。阉割没有影响其它白细胞，包括B细胞、巨噬细胞和粒细胞的外周恢复。
实施例4给出阉割对同基因和同类系骨髓移植的影响。Starzl等(1992)报道，在淋巴和非淋巴组织中明显的微嵌合体是同种异体移植是良好的预后指示。也就是说，假定它们是诱导对移植物的耐受所必需的(Starzl等，1992)。源于供者的树突细胞存在于这些嵌合体中，并被认为在避免移植物排斥反应中起全部作用(Thomson和Lu，1999)。已知树突细胞胸腺的阴性选择过程中的重要作用者，如果源于供者的树突细胞存在于受体胸腺中，那么移植反物应性T细胞可以被去除。
为了确定阉割是否能够增加嵌合体形成，用同基因胎肝移植进行研究。结果表明增强了阉割小鼠的胸腺再生。当用同类系(Ly5)小鼠重复试验时，仍发现这些趋势。由于同类系标记的存在，可能评价小鼠的嵌合体状态。在胎肝重构后两周，胸腺中就有可检测到的源于供者的树突细胞，在阉割小鼠中的数目是在未阉割小鼠中的四倍。重构后四周，未阉割小鼠没有用源于供者的细胞重构，表明实际上阉割可以增加嵌合体形成的可能性。阉割不仅在致死放射和胎肝重构后增加胸腺再生，而且其还增加胸腺中源于供者的树突细胞的数目，该方法与干细胞移植一起，增加了移植物接受的可能性。
本领域技术人员将会理解，在不背离所广泛描述的本发明的实质或范围的前提下，可以对具体实施方案中给出的本发明作大量改变和/或修饰。因此，目前的实施方案在所有方面均被认为是说明性的而非限制性的。
参考文献Aspinall，R.1997.小鼠中与年龄有关的胸腺萎缩胸腺是由于胸腺中T细胞发育期间影响TCR重排的缺陷，J.Immunol.1583037.Berzins，S.P.，Boyd，R.L.和Miller，J.F.A.P.1998.胸腺和新近的胸腺迁移物在成体外周淋巴细胞库的维持中的作用，JExp.Med.1871839.Boyd，R.L.，Tucek，C.L.，Godfrey，D.I.，Wilson，T.J，Davidson，N.J.，Bean，A.G.D.，Ladyman，H.M.，Ritter，M.A.和Hugo，P.1993.胸腺的微环境，ImmunologyToday 14445.Bruijntjes，J.P.，Kuper，C.J.，Robinson，J.E.和Schutirman，H.J.1993.大鼠胸腺皮质中的无上皮细胞区，Dev.Immunol.3113.Carayon，P.，和Bord，A.1992.用新方法识别DNA复制的淋巴细胞亚群以标记引入DNA的溴脱氧尿苷，J.Imm.Methods147225.Douek，D.C.，McFarland，R.D.，Keiser，P.H.，Gage，E.A.，Massey，J.M.，Haynes，B.F.，Polis，M.A.，Haase，A.T.，Feinberg，M.B.，Sullivan，J.L.，Jamieson，B.D.，Zack，J.A.，Picker，L.J.和Koup，R.A.1998.胸腺功能随年龄以及在HIV感染治疗期间的变化，Nature 396690.Fredrickson，G.G.和Basch，R.S.1994.放射后早期的胸腺再生，Development and Comparative Immunology 18251.George，A.J.和Ritter，M.A.1996.胸腺随老化的衰退退化还是良好的保管？Immunol.Today 17267.Godfrey，D.I，Izon，D.J.，Tucek，C.L.，Wilson，T.J.和Boyd，R.L.1990.小鼠胸腺基质细胞的表型异质性Immunol.7066.Godfrey，D.I，和Zlotnik，A.1993.早期T细胞发育中的控制点，Immunol.Today 14547.Hirokawa，K.1998.免疫和老化，In Principles andPractice of Geriatric Medicine.M.Pathy，ed.JohnWiley and Sons Ltd.Hirokawa，K.和Makinodan，T.1975.胸腺退化对T细胞分化的影响，J.Immunol.1141659.Hirokawa，K.，Utsuyama M.，Kasai，M.，Kurashima，C.，Ishijima，S.和Zeng，Y.-X.1994.理解胸腺功能随年龄的变化促进T细胞分化的机理，Immunology Letters 40269.Hobbs，M.V.，Weigle，W.O.，Noonan，D.J.，Torbett，B.E.，McEvilly，R.J.，Koch，R.J.，Cardenas，G.J.和Ernst，D.N.1993.来自幼年和老年小鼠的CD4+T细胞的细胞因子基因表达模式，J.Immunol.1503602.Homo-Delarche，R.和Dardenne，M.1991.神经内分泌免疫轴，Seminars in Immunopathology.Huiskamp，R.，Davids，J.A.G.和Vos，O.1983.全体中子裂变或X-射线放射对CBA小鼠胸腺的短期和长期影响，Radiation Research 95370.Kendall，M.D.1988.影响胸腺微环境的解剖学和生理学因素，In Thymus Update I，第1卷.M.D.Kendall，和M.A.Ritter编著.Harwood Academic Publishers，p.27.Kurashima，C，Utsuyama，M.，Kasai，M.，Ishijima，S.A.，Konno，A.和Hirokawa，A.1995.胸腺在Th细胞亚群的老化中和这些细胞产生细胞因子的与年龄有关的改变中的作用，Int.Immunol.797.Mackall，C.L.等.1995.强烈化学治疗后的年龄、胸腺生成和CD4+T淋巴细胞再生，New England J.Med.332143.Mackall，C.L.和Gress，R.E.1997.胸腺老化和T细胞再生，Immunol.Rev.16091.Penit，C.和Ezine，S.1989.在亚致死放射后的小鼠中的细胞增殖和胸腺细胞亚群重构内源和胸腺内转移前体(progenitors)的比较动力学，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.865547.Penit，C.，Lucas，B.，Vasseur，F.，Rieker，T.和Boyd，R.L.1996.胸腺髓质上皮细胞通过有丝分裂后成熟获得特异性标记，Dev.Immunol.525.Plosker，G.L.和Brogden，R.N.1994.亮丙瑞林其在前列腺癌、子宫内膜异位症和其它与性激素有关的疾病的治疗中的药理学和治疗学用途的综述，Drugs 48930.Randle-Barrett，E.S.和Boyd，R.L.1994.胸腺微环境和对亚致死放射的淋巴反应，Dev.Immunol.41.Scollay，R.G.，Butcher，E.C.和Weissman，I.L.1980.胸腺细胞的迁移小鼠中从胸腺到外周的细胞传输的数量方面，Eur.J.Immunol.10210.Shortman，K.，Egerton，M.，Spangrude，G.J.和Scollay，R.1990.胸腺细胞的产生和命运，Seminars in Immuno.23.Starzl，T.E.，Demetris，A.J.，Murase，N.，Ricardi，C.和Truce，M.1992.细胞迁移、嵌合体和移植物接受，Lancet3391579.Suda，T.，和Zlotnik，A.1991.IL-7维持CD3-CD4-CD8-胸腺细胞的T细胞前体潜能；J.Immunol.1463068.Timm，J.A.和Thoman，M.L.1999.CD4+淋巴细胞在老化微环境中的成熟导致富记忆群，J.Immunol.162711Thomson，A.W.和Lu，L.1999.树突细胞是肝移植的关键吗？Immunology Today2020.Tosi，R.，Kraft，R.，Luzi，P.，Cintorino，M.，Fankhause，G.，Hess，M.W.和Cottier，H.1982.人类胸腺的衰退模式1、皮质区大小作为年龄的函数，Clin.Exp.Immunol.47497.van Ewijk，W.，Rouse，R.V.和Weissman，I.L.1980.小鼠胸腺中H-2微环境的分布，J.Histochem.Cytochem.281089.von Freeden-Jeffry，U.，Vieira，P.，Lucian，L.A.，McNeil，T.，Burdach，E.G.和Murray，R.1995.白细胞介素(IL)-7基因缺失的小鼠中淋巴细胞减少将IL-7识别为非冗余细胞因子，J.Exp.Med.1811519.Wiles，M.V.，Ruiz，P.和Imhof，B.A.1992.小鼠胸腺发育期间的白细胞介素-7表达，Eur.J.Immunol.221037.Zlotnik，A.和Moore，T.A.1995.T细胞发育期间细胞因子产生和需要，Curr.Opin.Immunol.7206.
权利要求
1.改变患者T细胞群组成或者增加其T细胞数目的方法，所述患者具有被抑制的或异常的T细胞群或功能，该方法包括破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺。
2.根据权利要求1的方法，其中T细胞群组成的改变的特征在于由功能和/或特性分子的表达定义的T细胞亚群的性质和/或比率的改变，其中特性分子选自T细胞受体、CD4、CD8、CD3、CD25、CD28、CD44、CD62L和CD69。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中增加患者T细胞数目导致与其它淋巴样细胞相比，T细胞数目的相对增加。
4.根据权利要求3的方法，其中其它淋巴样细胞是B细胞。
5.根据权利要求1至4中的任一权利要求的方法，其中具有被抑制的或异常的T细胞群或功能的患者患有选自癌症、人免疫缺陷病毒感染、自身免疫疾病、过敏疾病或子宫内膜异位症的疾病。
6.根据权利要求5的方法，其中癌症患者已接受化学治疗和/或放射治疗和/或骨髓移植。
7.根据权利要求5的方法，其中人免疫缺陷病毒感染的患者患有艾滋病。
8.根据权利要求1至7中的任一权利要求的方法，其中患者是青春期后的。
9.治疗患有自身免疫疾病的患者的方法，所述方法包括去除患者的固有T细胞群，以及破坏性类固醇信号传导至胸腺。
10.根据权利要求9的方法，其中该方法另外包括使个体接受骨髓移植。
11.根据权利要求9或权利要求10的方法，其中通过使个体接受化学治疗或放射而去除T细胞群。
12.增强患者对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺，以及给予抗原。
13.权利要求12的方法，其中抗原来自感染物或肿瘤细胞。
14.权利要求13的方法，其中患者患有癌症。
15.权利要求13的方法，其中患者患有感染。
16.根据权利要求12至15中的任一权利要求的方法，其中抗原在给药前与佐剂混合。
17.降低器官移植后患者的宿主抗移植物反应的方法，所述方法包括以下步骤去除患者的T细胞；破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺；以及将器官从供者移植到患者。
18.根据权利要求17的方法，另外包括将骨髓从供者移植到患者的步骤。
19.根据权利要求1至18中的任一权利要求的方法，其中通过抑制性类固醇的产生或阻断胸腺内的性类固醇受体而破坏性类固醇信号传导至胸腺。
20.根据权利要求19的方法，其中抑制性类固醇的产生通过阉割或给予性类固醇类似物而实现。
21.根据权利要求20的方法，其中性类固醇类似物选自氟他米特、戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、dioxalan衍生物如曲普瑞林、美它瑞林、布舍瑞林、组氨瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林和促黄体生成激素释放激素类似物。
22.根据权利要求21的方法，其中性类固醇类似物是促黄体生成激素释放激素类似物。
23.根据权利要求22的方法，其中促黄体生成激素释放激素类似物是地洛瑞林。
24.根据权利要求1至23中的任一权利要求的方法，其中性类固醇类似物通过缓释肽配方给予。
25.增强患者对抗原的免疫应答的组合物，所述组合物包含佐剂、抗原和促黄体生成激素释放激素类似物。
26.根据权利要求1至24中的任一权利要求的方法，其中患者是哺乳动物。
27.根据权利要求26的方法，其中哺乳动物是人。
全文摘要
本发明提供改变患者T细胞群的组成或者增加其T细胞数目的方法,所述患者具有被抑制的或异常的T细胞群或功能,该方法包括破坏患者的性类固醇信号传导至胸腺。本发明可以用于治疗多种疾病,如癌症、HIV感染、自身免疫和过敏的患者。另外,本发明提供用以增强对抗原的免疫应答、治疗自身免疫疾病,以及减少移植供者中的宿主抗移植物反应的方法。
文档编号A61K38/09GK1364093SQ00808966
公开日2002年8月14日 申请日期2000年4月17日 优先权日1999年4月15日
发明者理查德·伦诺克斯·博伊德 申请人:莫纳希大学