一种白介素6的检测方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于激素检测技术领域，尤其涉及一种白介素6的检测方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]白细胞介素-6，简称白介素6(IL_6)，是一种细胞因子，属于白细胞介素的一种。它是由纤维母细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞、以及多种瘤细胞所产生。IL-1、TNF-a，PDGF、病毒感染、双链RNA及cAMP等，均可诱导正常细胞产生白介素6。白介素6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。白介素6(IL-6)是肝细胞产生急性期蛋白的最重要的调节物，天然状态下是分子量为23-30KD的蛋白质，有不同程度的糖基化和多聚化，这种不匀性与活力及组织特异性有一定关系。除巨噬细胞外，IL-6可由许多其他细胞分泌，如纤维母细胞、内皮细胞等。人IL-6与C-反应蛋白(急性反应蛋白之一)、血清淀粉酶A、纤维蛋白原、肌球蛋白、铜兰蛋白相互联系。IL-6在肝外亦有广泛作用，在肝脏，IL-6的作用是通过与其高亲和力的特异性细胞表面受体结合而完成的。IL-6受体(IL-6R)属免疫球蛋白超家族，IL-6R中仅一 80KD的部分为与I1-6结合所必需，配体/受体复合物与膜糖蛋白(gpl30)结合，参与生长信号的信息转导。IL-6对肝细胞蛋白质合成的分子效应发生在RNA转录水平。星状细胞是肝脏中IL-6的主要来源。细菌脂多糖是其有效的刺激剂。慢性肝病中IL-6水平上升，可导致一系列免疫功能紊乱及免疫病理反应，如上所述，IL-6又可称为肝细胞刺激因子，可促进多种细胞增殖和分化，并通过白分泌负反馈环路抑制细胞增殖。
[0003]目前，国内白介素6的检测主要采用进口试剂和免疫组化试剂，国内开发的试剂盒多采用化学发光方法和酶联免疫法，这些方法检测步骤多，引进的影响因素较多，检测结果易造成偏差。
[0004]荧光层析免疫分析方法是一种微量分析方法，根据荧光强度，对物质进行定性或定量分析，具有高灵敏度、选择性强、需样量少和操作简便等优点。中国专利公布号为CN104330551A的发明专利，公布了一种基于化学发光法的免疫荧光定量检测白介素6的试剂盒，以异硫氰酸荧光素标记的白介素6包被抗体和碱性磷酸酶标记的白介素6标记抗体制备抗试剂，以抗异硫氰酸荧光素抗体偶联羧基磁珠制得磁微粒试剂，双夹心法结合白介素6，以新型化学发光底物ALPS为底物，用化学发光仪检测发光强度进行定量。然而该试剂盒的制备步骤较复杂，需要成本较高，检测时需要水浴、分离等过程，操作多，耗时长。中国专利公布号为CN103969438A的发明专利，采用定量夹心酶联免疫方法检测白介素6。然而该方法检测步骤有酶标板的包被及封闭、标准品或被检血清的处理、单克隆抗体检测，检测过程中孵化时间长、洗板次数多，需要配套设备和专业人员。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种白介素6的检测方法及其试剂盒，具有灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低等优点。
[0006]本发明通过如下技术方案实现上述目的:
[0007]—种白介素6的检测方法，包括以下步骤:
[0008]I)探针垫的制备:在荧光胶乳微粒溶液中加入活化剂反应，离心、洗涤后得到活化的荧光胶乳微粒；
[0009]将白蛋白和羊抗兔IgG分别与活化的荧光胶乳微粒偶联反应，得到白蛋白荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒;将白蛋白荧光胶乳微粒溶液加入活化剂反应，离心、洗涤后得到活化的白蛋白荧光胶乳微粒；
[0010]将白介素6单克隆抗体与活化的白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应，得到白介素6单克隆抗体荧光胶乳微粒；
[0011]将白介素6单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒混合得到混合荧光胶乳微粒，随后用荧光探针微球稀释液稀释，均匀喷在玻璃纤维上，烘干得到探针垫；
[0012]2)免疫层析试纸条的制备:将样品垫、探针垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将白介素6单克隆抗体和兔IgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线和控制线上，经干燥、切割后得到免疫层析试纸条；
[0013]3)样品稀释液的制备:样品稀释液为含有白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的缓冲液；
[0014]4)样品检验:取待检测的血清、血浆或全血样品加入至样品稀释液中，待混合均匀后加入至免疫层析试纸条上进行免疫层析反应;随后在荧光检测器下采用与荧光胶乳微粒相对应的发射光波长进行荧光检测。
[0015]进一步的，所述步骤I)中，在发射光波长为500nm?590nm的带有羧基或氨基的荧光胶乳微粒溶液中加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下反应0.5h?2h，离心、洗涤后得到活化的荧光胶乳微粒，其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的重量比为1:6?1:1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为1:100?5:100;优选的，所述步骤I)中，在发射光波长为500nm?590nm的带有羧基或氨基的荧光胶乳微粒溶液中加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温下反应lh，离心、洗涤后得到活化的荧光胶乳微粒，其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基硫代琥珀酰亚胺的重量比为1:3，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为I: 100。
[0016]进一步的，所述白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、羊血清白蛋白和鼠血清白蛋白中的任意一种。
[0017]进一步的，所述步骤I)中，白蛋白与活化的荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100?0.2:100，混合后室温下偶联反应Ih?5h，得到白蛋白荧光胶乳微粒;羊抗兔IgG与活化的荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100?0.2:100,混合后室温下偶联反应Ih?5h，得到羊抗兔IgG荧光胶乳微粒；白介素6单克隆抗体与活化的白蛋白荧光胶乳微粒的混合比例为
0.05:100?0.2:100,混合后室温下偶联反应Ih?5h，得到白介素6单克隆抗体荧光胶乳微粒;优选的，所述步骤I)中，白蛋白与活化的荧光胶乳微粒的混合比例为0.12:100，混合后室温下偶联反应3h，得到白蛋白荧光胶乳微粒;羊抗兔IgG与活化的荧光胶乳微粒的混合比例为0.12:100，混合后室温下偶联反应3h，得到羊抗兔IgG荧光胶乳微粒；白介素6单克隆抗体与活化的白蛋白荧光胶乳微粒的混合比例为0.12:100，混合后室温下偶联反应3h，得到白介素6单克隆抗体荧光胶乳微粒。
[0018]进一步的，所述步骤I)中，按2:1?6:1的比例混合白介素6单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒，得到混合荧光胶乳微粒，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2?6倍，以2μ1/αιι?6μ1/αιι的速度均匀喷在宽度为0.7cm?1.3cm的玻璃纤维上，在37°C下干燥2h?6h得到探针垫。
[0019]进一步的，所述步骤I)中，所述荧光探针微球稀释液为包括蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液;所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tr i s缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。
[0020]进一步的，所述步骤3)中，所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种;所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇;所述防腐剂为叠氮钠或procline;所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。
[0021]进一步的，所述步骤2)中，将样品垫、探针垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，采用划膜喷金机将白介素6单克隆抗体和兔IgG分别包被在层析试纸的检测线和控制线上，37°C干燥12h?36h后经切条机切割得到3mm?5mm宽度的免疫层析试纸条;优选的，将样品垫、探针垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，采用划膜喷金机将白介素6单克隆抗体和兔IgG分别包被在层析试纸的检测线和控制线上，37°C干燥24h后经切条机切割得到4mm宽度的免疫层析试纸条。
[0022]—种应用上述的白介素6的检测方法的试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括PVC衬板以及固定在所述PVC衬板上的样品垫、探针垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫搭接在所述探针垫上，所述探针垫和所述吸水纸分别搭接在所述硝酸纤维素膜的两侧，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和控制线，所述检测线和控制线内分别包被有白介素6单克隆抗体和兔IgG ；所述稀释液瓶中存放有样品稀释液。
[0023]进一步的，还包括壳体，所述壳体上设置有加样孔、检测窗口、编码区域和把手，所述加样孔位于所述样品垫处，所述检测窗口位于所述检测线和控制线处，所述编码区域位于检测窗口和把手之间，所述把手位于所述吸水纸处。
[0024]与现有技术相比，本发明的一种白介素6的检测方法及其试剂盒的有益效果是:
[0025]I)本发明利用荧光免疫层析方法，实现了白介素6的体外定性定量检测；
[0026]2)本发明的荧光免疫层析方法中，检测线区域包被有能与白介素6形成复合物的白介素6单克隆抗体，配套探针则使用2种荧光胶乳微粒标记的白介素6单克隆抗体;控制线区域包被有兔IgG抗体，配套探针使用羊抗兔IgG抗体标记的2种荧光胶乳微粒，控制线与检测线独立反应，互不影