使用疾病特异性启动子治疗心血管疾病的组合物和方法

使用疾病特异性启动子治疗心血管疾病的组合物和方法
【专利摘要】本发明的方法和系统提供一种表达载体，该表达载体具有与编码治疗剂诸如蛋白质、微RNA、siRNA或其他治疗分子例如其他寡核苷酸的基因连接的疾病特异性启动子。各种不同的启动子可以用于本发明，只要启动子优先在疾病部位而不是在体内更全面地表达与其连接的基因。疾病特异性启动子可以是LOX1基因的启动子。治疗剂可以是白细胞介素10(IL10)。
【专利说明】使用疾病特异性启动子治疗心血管疾病的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年10月7日递交的美国临时申请号61/887,704的优先权，将其通 过引用W其全文并入本文。
[0003] 政府许可权利
[0004] 本发明是在由国立卫生研究院授予的资助号R56AI093695和由美国退伍军人事务 部授予的Merit Review资助下的政府支持完成的。政府在本发明中拥有某些权利。 发明领域
[0005] 本发明设及治疗屯、血管疾病和其他病况的方法和组合物。特别地，本发明设及在 治疗癌症中使用疾病特异性启动子的基因治疗。
[0006] 发明背景
[0007] 基因治疗的标志性目的是递送治疗基因，其随后起到对抗患者或动物模型内的阴 性表型或疾病的作用。虽然有许多类型的疾病要治疗，每种疾病多少有些不同，并且存在多 种可采取的递送/表达策略。可用于驱动基因表达的基因表达方法有两种主要类型：（i)组 成型和（ii)组织特异性。问题是许多（也许所有）治疗基因在表达时将有可能具有负面后 果，即不良反应，特别是如果高水平表达基因。尽管如此，基因治疗剂必须是安全的，并且不 诱发广泛的非故意损伤。
[000引第一种主要表达方法是"组成型"方法，诸如使用巨细胞病毒(CMV)立即早期启动 子（"pr")。该方法可能最适合于治疗遗传综合征。遗传综合征是由有缺陷的蛋白质引起的， 该蛋白质在组织或器官内对于正常功能是重要的。对于遗传综合征，基因治疗的目的简单； 使该治疗基因及其蛋白质递送至并表达于患者、器官或组织的尽可能多的细胞W回复正常 功能。该策略通常用于最大基因递送和基因表达。
[0009] 但是，许多（如果不是绝大多数)治疗基因实际上在高水平表达时由于其固有的功 能和不良反应而具有生理上的不利面(down-side)。例如，在炎性疾病(诸如屯、血管疾病）的 情况下，已经被用于治疗动脉粥样硬化的治疗剂，特别是白细胞介素10(IL10，IL-10)(尽管 其为强免疫抑制性的），也与在临床环境中和一些动物模型中显示的许多不良反应相关。运 些不良反应包括增加的细菌、真菌和病毒感染、癌症、头痛和贫血(8-16)。一般而言，最强的 治疗基因很可能也是最危险的，它们必须被严格调控。
[0010] 组成型方法的主要精修(refinement)是"组织特异性"方法。在运里，递送的转基 因仅在特定细胞类型内表达，从而限制其总体表达（17)。尽管该方法代表了对组成型方法 的改进（improvement)，它似乎是组成型方法的改良（modified)形式，但是，被限制于特定 的细胞类型。
[0011] 第Ξ种方法是"疾病特异性"方法(4)。疾病特异性方法的目的是在正在向疾病相 关表型变化的细胞中将治疗转基因的表达限制于疾病部位。运种疾病特异性方法对于基因 治疗抵抗来自强效的治疗转基因（诸如IL10)的过表达的不良反应赋予基因治疗重要的安 全性特征。
[0012]由于疾病特异性方法的潜在优势，所W持续需要开发和测试新的表达系统。
[001引概述
[0014] 本发明提供用于治疗屯、血管疾病(例如动脉粥样硬化)的表达载体。本发明的表达 载体的启动子是疾病特异性启动子。
[0015] 本发明还提供治疗受试者(患有屯、血管疾病，例如动脉粥样硬化)的屯、血管疾病的 方法，其包括向受试者施用治疗有效量的表达载体的步骤。
[0016] 载体可W包含启动子，该启动子包含与SEQ ID NO: 1的核巧酸序列具有大约80% 至大约100%同一性的核巧酸序列(或者由上述核巧酸序列组成）。
[0017] 载体的启动子可W包含凝集素样氧化低密度脂蛋白受体l(LOX-l)基因的启动子 的核巧酸序列(或者由所述核巧酸序列组成）。在一个实施方案中，启动子包含SEQ ID NO: 1 的核巧酸序列。
[0018] 载体还可W包含治疗基因，其在启动子的控制下编码对于治疗屯、血管疾病是治疗 上有效的治疗剂。治疗剂可W是蛋白质、微RNA或siRNA。例如，治疗剂可W是白细胞介素10 (化-10)。在一个实施方案中，治疗剂是由包含SEQ ID N0:2的核巧酸序列的基因编码的白 细胞介素10。
[0019] 表达载体可W是腺相关病毒(AAV)载体(衍生自AAV)。例如，AAV载体可W是AAV2或 AAV8载体。AAV载体可W包含AAV8衣壳基因，其可W为野生型或突变型。在一个实施方案中， AAV载体的AAV8衣壳基因包含沈Q ID N0:3;SEQ ID N0:5;或者（iii)SEQ ID N0:7。
[0020] 附图简述
[0021] 图1:AAV载体的结构和实验方案。A.是显示在该研究中使用的Ξ种AAV载体的基本 结构的图。B.显示实验方案和收集的数据。
[0022] 图2:AAV丄OXlpr-hlLlO载体质粒的更详细的结构。该图更详细地显示了用于产生 该病毒的AAV2丄OXlpr-hlLlO载体质粒的基本结构的结构。注意，在启动子序列内显示 Angll、0x-LDL和PMA的Ξ个应答元件的相对位置。但是，全长LOXlpr可能也应答许多其他刺 激。
[0023] 图3:动物组的身体特征。显示的数据为平均值+/-SE"A.显示总胆固醇水平。注意， 所有接受HCD的动物的胆固醇水平具有显著高于ND动物的胆固醇水平。B.显示实验结束时 的动物体重。底部的图例用于运两个图。
[0024] 图4:动物组中hILlO的表达。通过实时定量PCR从每组中6只小鼠的主动脉测定与 内源性β-肌动蛋白相比所递送的hILlO基因的相对表达。对于QRT-PCR，每个载体转基因的 mRNA的数量相对于相同样品中的朗几动蛋白进行归一化。显示的数据为平均值+/-SE。注意， 尽管CM化r-IL10(CMV启动子-IL10)和LOXlpr-ILlO的处理在统计学上是相似的，但是 LOXlpr-ILlO倾向于不到CMVpr-ILlO表达水平的一半。在各种器官中hILlO的疾病特异性表 达:L0X-1启动子主要在主动脉(疾病部位）中被表达(57)。
[0025] 图5:收缩血液速度。使用高分辨率超声化RUS)来测量每组8-10只动物主动脉的腹 部区域的腔中屯、的血流速度。显示量化的结果。注意，CMVpr-hILlO和LOXlpr-hlLlO-肥D处 理的动物均比AAV/Neo-HCD处理的动物具有显著更低的血液速度，类似于ND对照。但是， CMVpr-hILlO-HCD和LOXlpr-hlLlO-HCD处理的动物彼此在统计学上是相似的。
[0026] 图6:通过高分辨率超声化RUS)分析主动脉腔。使用HRUS来测量每个动物组的8-10 只动物的主动脉的胸部区域的横截面面积。显示主动脉腹部/胸部区域的横截面面积的量 化结果。注意，CMVpr-hILlO和LOXlpr-hlLlO-肥D处理的动物均比AAV/化0-HCD处理的动物 具有显著更大的横截面面积，表明显著的效力。但是，CM化r-hILlO-HCD和LOXlpr-hlLlO- HCD处理的动物彼此在统计学上是相似的。
[0027]图7:通过皿US分析主动脉壁厚度。使用HRUS来测量主动脉的壁厚度。显示每个动 物组的8-10只动物的主动脉的胸部区域的量化结果。注意，CMVpr-hILlO和LOXlpr-hlLlO- HCD处理的动物均比AAV/化0-肥D处理的动物具有显著更薄的主动脉壁，表明显著的效力。 但是，CMVpr-hILlO-HCD和LOXlpr-hlLlO-HCD处理的动物彼此在统计学上是相似的。
[002引图8.由AAV2和经修饰的AAV2-EYH转导培养中的人原代胎盘厮带静脉环。体外用 108AAV2-CMV-EYH/eGFP病毒感染静脉环。感染后2天进行显微照相。注意，AAV2-EYH修饰的 衣壳强烈祀向平滑肌细胞。
[0029]图9.用于改进的动脉平滑肌细胞的转导的AAV8衣壳的特异性变化，包括任务1和 2。将在pDG8)中进行所示的变化。第447和733位的酪氨酸将被苯丙氨酸置换，而在第590位 之后将插入EYH肤（具有屯个氨基酸的肤）。运些修饰可W增强AAV2/8 (cvd 1) . LOXlpr- ILIODNA递送至血管平滑肌细胞中。
[0030] 详述
[0031] 本发明的方法和系统提供一种表达载体，该表达载体含有与编码治疗剂(诸如蛋 白质、微RNA、siRNA或其他治疗分子，例如其他寡核巧酸）的基因连接的疾病特异性启动子。 各种不同的启动子可W用于本发明，只要启动子优先在疾病部位而不是在体内更全面地表 达与其连接的基因。
[0032] 由于使用某些治疗剂可引起的不良反应，它们的总产量必须受到限制。使用疾病 特异性转录启动子是给出运样的减少的且选择性的表达的一种方法。运样的疾病特异性基 因表达应当引导表达至最需要其的疾病部位，同时限制总产量。治疗剂的疾病特异性表达 能够降低明显的不良反应的可能性（17-23)。
[0033] 本发明提供用于治疗各种病况包括屯、血管疾病(例如动脉粥样硬化)的表达载体。 该表达载体可W是腺相关病毒(AAV)载体(衍生自AAV)。在一个实施方案中，疾病特异性启 动子是L0X-1基因的启动子化0X-1启动子、L0X1启动子或者L0Xlpr)α7,4)。治疗剂可W是 白细胞介素 lO(ILlO)。
[0034] 疾病特异性启动子
[0035] 本发明的表达载体含有疾病特异性启动子。疾病特异性启动子可W确保在其控制 下的基因表达基本上被限制于患病组织或患病组织周围的组织。在疾病期间上调的任何基 因的启动子可W被用作本发明的疾病特异性启动子。在正常情况(非疾病状态）下，基因在 其启动子的控制下W低水平表达，该水平可W是可检测的或者可W是不可检测的。在疾病 期间，启动子被疾病相关刺激(例如血液剪切应力、血脂异常(dislipidemia)、免疫细胞运 输、其他激活等)激活，并且启动子/基因被强烈上调。使用疾病特异性启动子也是对在其控 制下的治疗剂的不良作用的固有防护。一旦疾病变弱，疾病刺激将会被消除或减少(例如基 因治疗之后）。作为响应，在疾病特异性启动子的控制下，治疗剂的表达应当被下调，引起自 然负反馈。
[0036] 凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(L0X1，L0X-1，氧化LDL受体1，化R1)是清道夫受 体，该受体在细胞变为活化时被表达，并结合许多配体。LOXl也是识别氧化低密度脂蛋白 (Ox-LDL)的受体之一。此外，它在许多细胞类型中被表达，包括内皮细胞、平滑肌细胞和巨 隧细胞(被认为是在动脉粥样硬化中设及的主要细胞类型）（23-28)。它在动脉粥样硬化斑 块内被大量表达。L0X-1还被认为是活化的内皮最早的标记物之一，其早于动脉粥样硬化的 开始（17,24)。1^)乂1似乎在动脉粥样化形成期间被转录上调。许多物质（诸如0义-1化和 Angll)诱导它的上调。
[0037] 在本发明的一个实施方案中，L0X-1转录启动子化0X1基因的启动子，LOXlpr)被用 作用于表达对抗屯、血管疾病(例如对抗动脉粥样化形成）的治疗基因的表达载体的疾病特 异性启动子。L0X-1启动子可W来自人或来自其他物种(4,17)。
[0038] 在另一个实施方案中，本发明的表达载体含有启动子，其包含W下核巧酸/由W下 核巧酸序列组成(或基本上由W下核巧酸序列组成）：与SEQ ID NO: 1的核巧酸序列具有大 约60 %至大约100 %、大约70 %至大约100 %、大约80 %至大约100 %、大约85 %至大约 100%、大约90%至大约100%、大约95%至大约100%、大约98%至大约100%、大约60%、大 约70%、大约80%、大约85%、大约90%、大约95%、大约98%或大约100%同一性的核巧酸 序列。
[0039] 疾病特异性启动子的非限制性实例还包括载脂蛋白E(apoE)、超氧化物歧化酶2 (5002)、癌胚抗原、肥3-2/11611、0。3/]\11](：(0日油3,61日1.1997.011。〇1.1^3.9:313-25)、酪氨酸 酶、甲胎蛋白、白蛋白、CC10或前列腺特异性抗原的基因的启动子;tet应答元件或Myc-Max 应答元件。还可W用于本发明的启动子包括在W下文献中公开的启动子:Eyster et al.， Gene expression signatures differ with extent of atherosclerosis in monkey iliac artery,Menopause,2011,18(10):1087-95；Wilcox et al.,Local expression of inflammatory cytokines in human atherosclerotic plaques,J Atheroscler T虹omb.l994;lSuppl l:S10-3。运两篇文献的公开内容过引用w其全文并入本文。
[0040] 启动子可W是野生型或突变体。可W通过引入一个或多个核巧酸取代、添加或缺 失来建立突变体。例如，可W通过标准技术引入突变，诸如定点诱变和PCR介导的诱变。
[0041] 在疾病特异性启动子的控制下，在被治疗的病况所设及的组织中治疗基因（编码 治疗剂）的表达水平可W低于在组成型启动子控制下的治疗基因的表达水平。在一个实施 方案中，在血管(例如主动脉、动脉、动脉壁等）中治疗基因（编码例如IL-10)的表达水平可 W是在组成型启动子(例如巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子)控制下的治疗基因的表达水 平的大约90%、大约80%、大约70%、大约60%、大约50%、大约40%、大约30%、大约20%、 小于大约90%、小于大约80%、小于大约70%、小于大约60%、小于大约50%、小于大约 40%、小于大约30%或小于大约20%。
[0042] 在另一个实施方案中，在被治疗的病况未设及的组织中治疗基因（编码治疗剂）的 表达水平可W低于在组成型启动子控制下的治疗基因的表达水平。例如，在被治疗的病况 未设及的组织(例如肺或肝）中治疗基因（编码例如IL-10)的表达水平可W是在组成型启动 子(例如巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子)控制下的治疗基因表达水平的大约90%、大约 80%、大约70%、大约60 %、大约50%、大约40%、大约30%、大约20%、大约10%、大约5%、 大约2%、大约1 %、小于大约90%、小于大约80%、小于大约70%、小于大约60%、小于大约 50 %、小于大约40 %、小于大约30 %、小于大约20 %、小于大约10 %、小于大约5 %、小于大约 2%或小于大约1 %。
[0043] 可W通过任何合适的测定法来测定蛋白质的水平，包括但不限于在蛋白质印迹、 酶联免疫吸附测定巧LISA)、流式细胞术、免疫细胞化学或免疫组织化学中使用对于该蛋白 质为特异性的抗体。
[0044] 可W通过任何合适的方法来测定基因表达水平，包括但不限于测量mRNA水平和/ 或蛋白质水平。可W通过RT-PCR、Nodhern印迹、下一代测序等定量测量mRNA的水平。
[0045] 治疗基因
[0046] 本申请的载体可W进一步包含在所述启动子控制下的异源基因。该基因可W是编 码治疗剂的治疗基因。本文使用的短语"治疗剂"是指帮助治疗或预防疾病的任何分子或化 合物。
[0047] 可W在所述疾病特异性启动子控制下进行表达的治疗剂可W是蛋白质、多肤、多 核巧酸（例如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、核酶或反义分子）、抗体或其抗原结合部 分、或任何其他分子。治疗剂可W是细胞因子、免疫球蛋白（例如1邑6、1邑1、1邑4、1曲或1邑6)、 整合素、白蛋白或任何其他潜在的治疗相关的分子。通过特定疾病的病理学确定特定分子 的选择。治疗剂的非限制性实例包括白细胞介素1(比-1)、比-2、比-3、比-4、比-5、比-6、比- 7、比-8、比-9、比-10、比-11、比-12、GM-CSF 和G-CSF。
[0048] 在一个实施方案中，用于治疗动脉粥样硬化的治疗剂包括下调免疫系统的药剂、 控制血脂异常(例如高胆固醇）的药剂W及下调抗活性氧(抗R0S)的药剂。例如，本发明的治 疗剂可W包括转化生长因子01(了6。01)、514〇3、白细胞介素1〇(化-1〇)、5了4了3、神经生长因 子1(化trin-1)、血管紧张素 II 2型受体(AT2R)、抗活性氧(抗R0S)剂(例如过氧化物氧化还 原酶6(peroxiredoxin 6)(P畑X6)，其为抗琉基R0S蛋白）、影响血脂异常的载脂蛋白A1米兰 突变体(apolipoprotein AlMilano，ApoAl米兰突变体）。在一个实施方案，用于本发明的载 体的比-10基因由569 10^:2的核巧酸序列组成/包含569 10^:2的核巧酸序列。
[0049] 治疗剂的非限制性实例还包括细胞因子、趋化因子、免疫调节分子、前药转换酶、 血管形成抑制剂、血管形成促进剂、毒素、抗肿瘤剂、有丝分裂抑制蛋白、抗有丝分裂剂、转 运蛋白、组织因子、酶、血液衍生物、激素、淋己因子、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、生 长因子、神经递质或其前体或合成酶、营养因子(诸如抓NF、CNTF、NGF、IGF、GMF、α-FGF、β- FGF、NT3、NT5和HARP/多效蛋白）、载脂蛋白（诸如4口〇41、4口〇41￥、4口〇6、肌营养不良蛋白或微 小肌营养不良蛋白）、与囊性纤维化相关的CFTR蛋白、细胞内抗体（intrabody)、肿瘤抑制基 因（诸如p53、肺、1^)14、00：、4-'6￥)、凝血因子(诸如因子￥11、￥111、巧）、0酷修复因子、导致 细胞死亡的自杀剂、胞喀晚脱氨酶和促调亡剂。
[0050] 编码治疗剂的治疗基因可W来自人或其他物种。
[0051] 治疗基因可W是野生型或突变体。可W通过引入一个或多个核巧酸取代、添加或 缺失来建立突变体。例如，可W通过标准技术诸如定点诱变和PCR介导的诱变引入突变。当 治疗剂是蛋白质时，可W在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。 "保守氨基酸取代"是其中该氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。本领域 已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。运些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、 精氨酸、组氨酸）、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺）、不带电荷的极性 侧链(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半脫氨酸）、非极性侧链(例如丙氨酸、鄉氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-分支的侧链(例如苏氨酸、鄉氨 酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可选地，诸 如通过饱和诱变，可W沿着全部或部分编码序列随机地引入突变，并可W对所得突变体进 行生物学活性筛选W鉴定保留活性的突变体。诱变之后，可W通过重组表达编码的蛋白质 并可W测定该蛋白质的活性。
[0052] 对于治疗动脉粥样硬化，抗炎细胞因子(诸如转化生长因子m(TGFm)或白细胞介 素10(比-10))可W用于治疗作用。但是，运些特定药剂具有明显的不良反应(23,24)。例如， TGFm的表型十分多形并且与纤维化的诱导高度相关(26-28)。相比之下，1-10具有更少的 并发症，但仍然与许多不良反应诸如头痛、贫血和增加的感染相关(25-30)。由于与使用IL- 10相关的不良反应，它的总产量必须受到限制。使用疾病特异性转录启动子是给出运样的 减少的和选择性的表达的一种方法。运样成功的疾病特异性基因表达应当引导表达至最需 要其的疾病部位，并同时限制总产量。可W预期IL-10的疾病特异性表达降低如已经报道发 生的明显的不良反应(22,27)的可能性。
[0053] 可W使用治疗剂的变体、类似物或融合蛋白。在一个实施方案中，治疗剂包含SEQ ID NO: 2的核巧酸序列或由SEQ ID NO: 2的核巧酸序列组成。在另一个实施方案中，治疗剂 包含W下核巧酸序列/由W下核巧酸序列组成:与SEQ ID N0:2的核巧酸序列具有大约60% 至大约100 %、大约70 %至大约100 %、大约80 %至大约100 %、大约85 %至大约100 %、大约 90%至大约100%、大约95%至大约100%、大约98%至大约100 %、大约60%、大约70%、大 约80%、大约85%、大约90%、大约95%、大约98%或大约100%同一性的核巧酸序列。
[0054] 治疗剂可W是小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)DsiRNA或shRNA可W降低或 抑制治疗目标的表达。siRNA可W具有16-30个核巧酸，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29或30个核巧酸。S iRNA可W具有小于16个核巧酸或大于30个核巧酸。
[0055] 在另一个实施方案中，治疗剂是反义多核巧酸。反义多核巧酸可W与治疗祀点结 合。反义寡核巧酸的长度可W是例如大约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80或更多个核巧酸。
[0056] 在另一个实施方案中，治疗剂是核酶。美国专利号8,592,368和5,093,246。 化se化off et al.,Na1:ure 334:585-591(1988)。
[0057] 治疗剂可W是对治疗祀点为特异性的抗体或其抗原结合部分。抗体或其抗原结合 部分可W为W下：（a)全免疫球蛋白分子；（b)scFv;(c)Fab片段；W及(d)F(ab'）2等。抗体或 其抗原结合部分可W是单克隆的、多克隆的、嵌合的和人源化的。
[005引莖化
[0059] ?;使用的术语"载体"是指能够转运已与其连接的另一核酸的多核巧酸。本发明 的载体可W是例如质粒载体、单链或双链隧菌体载体或者单链或双链RNA或DNA病毒载体。 运样的载体包括但不限于染色体载体、游离型载体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质 粒、隧菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒(诸如杆状病毒、乳头多瘤空泡病毒、SV40、 痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和反转录病毒）的载体，W及衍生自其组合的载 体，诸如那些衍生自质粒和隧菌体遗传成分、粘粒和隧菌粒的载体。
[0060] 表达载体可W用于在祀哺乳动物细胞中复制和/或表达编码治疗剂的核巧酸序 列。可用于向细胞引入本发明的多核巧酸的各种表达载体是本领域众所周知的。病毒载体 包括但不限于腺相关病毒载体、腺病毒载体、痘苗病毒载体、甲病毒载体、反转录病毒载体 和瘤疹病毒载体。
[0061] 在一个实施方案中，载体是腺病毒相关病毒(AAV)载体。不希望受到任何具体理论 或机制的束缚，据信由于在AAV末端反向重复序列内缺乏强启动子元件，上述启动子可W疾 病特异性方式在AAV载体内发挥功能（35,36)。还参见例如Walsh et al.，1993， Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300;美国专利号5,436,146。自从1984年已知AAV是有效 的载体(31，32，33-38)，包括在小鼠动脉粥样化形成模型中递送ILIO基因（26，27)。
[0062] 可 W 使用任何AAV 血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAV10、AAm 等。
[0063] 本发明的载体可W包含由AAV cap开放阅读框(0RF)编码的野生型或突变型AAV衣 壳(例如AAV2、AAV8等）。
[0064] 在一个实施方案中，突变型AAV衣壳可W具有至少一个突变的酪氨酸残基(例如缺 失，被其他氨基酸残基取代或邻近于酪氨酸具有插入的氨基酸残基）。在另一个实施方案 中，有至少一个氨基酸残基插入到cap 0RF或衣壳基因中。突变型AAV衣壳可W具有上述突 变中的两种或更多种的组合。
[0065] 例如，AAV2衣壳的第444位酪氨酸可W被苯丙氨酸置换，和/或第730位酪氨酸可W 被苯丙氨酸置换。AAV8衣壳的第447位酪氨酸可W被苯丙氨酸置换，和/或第733位酪氨酸可 W被苯丙氨酸置换。SEQ ID N0:4显示第447位和第733位的酪氨酸残基均被苯丙氨酸残基 取代的AAV8衣壳的氨基酸序列。SEQ ID NO: 3显示第447位和第733位的酪氨酸残基均被苯 丙氨酸残基取代的AAV8衣壳的核巧酸序列。
[0066] 在另一实例中，具有序列EYHHYNK(SEQ ID ^):13)的7-氨基酸肤（本文中被称为 巧YH"肤)被插入到AAV衣壳中。AAV2衣壳可W具有在第588位氨基酸之后插入序列EYHHYNK 的肤。AAV8衣壳可W具有在第590位氨基酸之后插入序列EYHHYNK的肤(例如参见该实施方 案的核巧酸序列SEQ ID NO: 5; W及其氨基酸序列SEQ ID NO:6)。
[0067] 在第Ξ实施方案中，AAV衣壳可W具有上述修饰中的两种或更多种的组合。SEQ ID NO:7显示修饰的AAV8衣壳核巧酸序列（SEQ ID NO:8显示修饰的AAV8衣壳氨基酸序列），其 具有（l)Tyr447和Tyr733突变为化e残基，和（2)在第590位之后被插入的7-氨基酸肤 化YHHYNK)，W及相邻变化。
[0068] 本发明的载体可W包含W下序列中的一种或多种：SEQ ID NO:9、沈Q ID NO: 10、 沈Q ID NO: 11 和沈Q ID NO: 12。
[0069] 腺病毒被描述于例如Rosenfeld et al. ,1991，Science 252:431-434;Rosenfeld et al.,1992,Cell 68:143-155；Mastrangeli et al.,1993,J.Clin.Invest.91:225-234； Kozarsky和Wilson,1993,Curr.Opin.Genetics Develop.3:499-503;Bout et al.,1994, Human Gene Therapy 5:3-10;PCT 公开号 WO 94/12649;和 Wang et al.，1995，Gene Therapy 2:775-783;美国专利号7,244,617。
[0070] 更多关于反转录病毒载体的详细信息可在Boesen et al. , 1994,Biotherapy 6: 291-302中获得。在一个实施方案中，本发明的表达载体是慢病毒（包括人免疫缺陷病毒 化IV))，其是反转录病毒的亚型。
[0071] 可W被用作本发明的表达载体的质粒包括但不限于pGL3、pCDM8(Seed，1987，"An LFA-3cDNA encodes a phospholipid-linked membrane protein homologous to its receptor CD2",Nature.840-842)和pMT2PC化aufman et al.,1987,"Translational efficiency of polycistronic mRNAs and their utilization to express heterologous genes in mammalian cells",EMBO J.6:187-193)。在本发明中可W使用任 何合适的质粒。
[0072]某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如游离型哺乳动物载体）。 其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中时被整合进入宿主细胞的基 因组，并由此随宿主基因组一起进行复制。
[007；3] 基因治疗
[0074] 本发明的表达载体、组合物和方法可W用于基因治疗。基因治疗是指通过向受试 者施用经表达的或可表达的核酸进行的治疗。因此，本发明提供用于治疗或预防病况(包括 屯、血管疾病)的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的本发明的表达载体。
[0075] 描述用于通过基因治疗施用的任何组合物除了可用于基因治疗方法之外，也可用 于体外或离体操作。
[0076] 根据本发明可W使用本领域可用的用于基因治疗的任何方法（参见例如 Goldspiel et al.,1993,Clinical Pharmacy 12:488-505;G;rossman和Wilson,1993, Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114;Salmons和Gunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129-141;Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217;Mulligan, 1993,Science 260:926-932;ToIstoshev,1993,Ann.Rev.曲armacol.Toxicol.32:573- 596; W及Clowes et al.,1994,J.Clin.Invest.93:644-651;Kiem et al.,1994,Blood 83:1467-1473,各自通过引用并入本文）。可W通过例如静脉注射(参见例如美国专利号5， 328,470)或通过立体定向注射（参见例如化en et al.，1994，Proc化tl Acad Sci.91: 3054-57)将基因治疗载体全身或局部施用于受试者。
[0077] 基因治疗载体的药物制剂可W包含在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可 W包含基因递送载体嵌入其中的缓释基质。可选地，当可W从重组细胞完整生产完全型基 因递送载体时，药物制剂可W包括生产该基因递送系统的一种或多种细胞。
[0078] 基因治疗设及在组织培养物中或在体内向细胞引入基因构建体。用于在体外向细 胞引入本发明的多核巧酸的方法包括但不限于电穿孔、脂转染、憐酸巧介导的转染和病毒 感染。通常，转移的方法包括向细胞转移可选标记物。然后根据选择放置细胞W分离已被摄 取和正在表达转移基因的那些细胞。然后将那些细胞递送给受试者。在另一个实施方案中， 本发明的多核巧酸可W作为植入物例如在聚合物制剂中被引入到祀组织(参见美国专利号 5，702，717)。在另一个实施方案中，可W将本发明的多核巧酸祀向于所期望的细胞或组织。
[0079] 可W将表达载体直接递送至受试者。在一个实施方案中，可W将本发明的多核巧 酸直接注射至祀组织或细胞衍生部位(derivation site)。可选地，首先用表达构建体体外 转染受试者的细胞，之后施用转染的细胞回到该受试者（即离体基因治疗）。因此，可W将本 发明的多核巧酸在体内或离体递送至祀细胞。已经开发了几种方法用于将本发明的多核巧 酸递送至祀细胞或祀组织。
[0080] 在一个特定实施方案中，体内引入载体，使得它被细胞摄取并指导本发明的治疗 剂的表达。运样的载体可W保持游离型或可W染色体整合。
[0081] 在一个具体实施方案中，直接体内施用表达载体，在体内表达载体W生产编码的 产物。运可W通过本领域已知的众多方法中的任意方法完成，例如通过将本发明的核酸置 于合适的表达载体中，使得施用时，载体变成细胞内的并表达治疗剂。可W通过使用例如缺 陷型或减毒逆转录病毒载体或能够感染哺乳动物细胞的其他病毒载体内化运样的载体(参 见例如美国专利号4,980,286)。
[0082] 可选地，可W直接将包含本发明的核酸的表达构建体作为裸DNA注射到祀组织。在 另一个实施方案中，可W使用微粒轰击将表达载体引入细胞内，例如通过使用Biolistic基 因枪(Dupont)。在另一个实施方案中，可W将包含本发明的核酸的表达构建体用脂质、或细 胞表面受体、或转染剂包被，使得在脂质体、微粒或微胶囊中包囊有利于接近祀组织和/或 进入祀细胞。在又一个实施方案中，将包含本发明的核酸的表达构建体与多肤连接，该多肤 被内化在细胞亚群中或其祀向于特定细胞区室。在进一步的实施方案中，连接的多肤是核 祀向序列，其将该载体祀向于细胞核。在另一个实施方案中，连接的多肤是配体，其通过表 达该配体的各自受体的细胞中的受体介导的胞吞进行内化（参见例如Wu和Wu，1987， J.Biol.Chem.262:4429-4432)。
[0083] 在另一个实施方案中，可W形成核酸-配体复合体，使得该配体包含破坏内体的融 合病毒肤，从而使得核酸避免溶酶体降解。在另一个实施方案中，可W通过细胞特异性受体 使本发明的核酸在体内被祀向，导致细胞特异性摄取和表达（参见例如国际专利公开W0 92/06180、W0 92/22635、W0 92/20316、W0 93/14188和W0 93/2022)。在又一个实施方案中， 将本发明的核酸引入细胞内并(通过同源重组)可W将其瞬时或稳定地整合至宿主细胞DNA 内，运进而允许其表达化oiler和Smithies, 1989，Proc Natl Acad Sci.86:8932-8935; Zijlstra et al.,1989,Na1:ure 342:435-438)。
[0084] 在该实施方案中，在体内施用所得重组细胞之前将表达载体引入到细胞中。可W 通过本领域已知的任何方法进行运样的引入，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用包 含多核巧酸的病毒载体或隧菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导 的基因转移和原生质球融合。本领域已知许多用于将外源基因引入细胞的技术(参见例如 Maniatis et al.,1989；Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons, 2000 ;Loeffle;r 和 Behr, 1993, Me th. Enzymol .217:599-618; Cohen et al.,1993, Meth.Enzymol. 217:618-644;Cline ,1985 Jharmacol.Ther. 29:69-92)，并可 W 根据本发明 进行使用。
[0085] 可W通过本领域已知的各种方法将所得重组细胞递送给受试者，并且本领域技术 人员将理解合适的施用方式。例如，静脉施用可W是用于重组造血干细胞的优选施用方式。 类似地，待施用于受试者的重组细胞的数量可W由本领域技术人员来确定，并会包括考虑 因素，诸如所期望的作用、疾病状态和施用方式。
[00化]治疗的病况
[0087]本发明的表达载体、组合物和方法可W被用于治疗或预防屯、血管疾病，诸如动脉 粥样硬化、狭窄、再狭窄、高血压、屯、力衰竭、左屯喧肥大(LVH)、屯、肌梗死、急性冠脉综合征、 卒中、短暂性脑缺血发作、循环损害、屯、脏病、胆固醇与斑块形成、缺血、缺血再灌注损伤、外 周血管疾病、屯、肌感染(myocardial infection)、屯、脏疾病(例如胸痛的风险分层和介入手 术）、屯、肺复苏、肾衰、血栓形成（例如静脉血栓形成、深静脉血栓形成、Π 静脉血栓形成、肾 静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、脑静脉窦血栓形成、动脉血栓形成等）、血栓的形成、血栓 性事件或并发症、己-希二氏（Budd-Chiari)综合征、Paget-Schroetter病、冠状动脉屯、脏 病、冠状动脉病、需要冠状动脉重建术、外周动脉病、肺循环病、肺栓塞、脑血管疾病、细胞增 殖与内皮功能障碍、移植物闭塞或移植失败、需要外周旁路移植术或者外周旁路移植术后 不良临床结果、需要冠状动脉搭桥(CABG)术或者冠状动脉搭桥术后不良临床结果、血管成 形术失败或血管成形术后不良结果、乳内动脉移植失败、静脉移植失败、自体静脉移植、静 脉移植物闭塞、缺血性疾病、血管内凝血、脑血管疾病或任何其他与肥胖或超重病况有关的 屯、血管疾病。
[0088] 还可W使用本发明的组合物和方法治疗的病况包括由于衰老或增加的炎症而更 突出的疾病，诸如卒中、关节炎和痴呆。Schwarz et al.,Identification of differentially expressed genes induced by transient ischemic stroke，Brain 民es Mol Brain 民es.2002;101(1-2):12-22DSimopoulou et al.,Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1(LOX-1) express ion in human articular chondrocytes.Clin Exp Rheumatol.2007,25(4):605-12〇Kakinuma et al.,Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor Imediates matrix metalloproteinase Ssynthesis enhanced by oxidized low-density lipoprotein in rheumatoid arthritis cartilage，Arthritis 民heum.2004，50(11):3495-503dLi et al.，The new role of LOX-1in hypertension induced neuronal apoptosis,Biochem Biophys Res Commun.2012S邱 7:425(4):735-40。
[0089] 本发明的表达载体、组合物和方法可用于治疗或预防的病况的非限制性实例包括 类风湿性关节炎、腺骨脱氨酶缺乏症、血友病、囊性纤维化和过度增生性病症（例如癌症 等）、骨吸收、骨质疏松症、骨关节炎、牙周炎、胃酸过少和视神经脊髓炎、膜岛素抵抗、葡萄 糖耐受不良、糖尿病、高血糖症、高脂血症、血脂异常、高胆酱醇血症、高甘油Ξ醋血症、高膜 岛素血症、糖尿病血脂异常、HIV相关脂肪营养不良、外周血管病、胆固醇胆结石、月经异常、 不育、多囊卵巢、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、代谢综合征(X综合征）、11型糖尿病、糖尿病并发 症包括糖尿病性神经病变、肾病变、视网膜病变、白内障、与肥胖有关的任何其他哮喘和肺 部疾病和类似于HIV-1感染相关疾病的任何其他病毒感染。
[0090] 药物组合物
[0091] 本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的表达载体。
[0092] 本发明的药剂或药物组合物可W通过任何途径进行施用，包括但不限于口服、透 皮、眼、腹膜内、静脉内、ICV、脑池内注射或输注、皮下、植入、舌下、皮下、肌内、静脉内、直 肠、粘膜、眼用、銷内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管和淋己施用。本发明的组合物可W 胃肠外或全身性施用。
[0093] 本发明的药物组合物可W是例如固体、半固体或液体制剂的形式。可W作为喷雾 剂或W滴剂的形式递送鼻内制剂;可W使用雾化器或类似装置递送吸入制剂;外用制剂可 W是凝胶剂、软膏剂、糊剂、洗剂、乳膏剂、泥敷剂(poultice)、己布剂(cataplasm)、硬膏剂、 皮肤贴剂、气雾剂等的形式;透皮制剂可W经由透皮贴剂或离子透入（ionto巧horesis)施 用。组合物也可W采用片剂、丸剂、胶囊剂、半固体剂、粉剂、缓释制剂、溶液、乳状剂、混悬 剂、馳剂、气雾剂、巧嚼棒或任何其他合适的组合物的形式。
[0094]组合物可W经由植入已经吸收或包封了所期望的分子的膜、海绵或另一适当的材 料进行局部施用。当使用植入装置时，该装置可W被植入任何合适的组织或器官，并且所期 望的分子的递送可W经由扩散、延时释放推注或连续施用。
[00%]为了制备运样的药物组合物，可W根据常规药物配混技术将本发明的一种或多种 化合物与药学上可接受的赋形剂(例如载体、佐剂和/或稀释剂)混合。
[0096] 可W用于本发明的组合物中的药学上可接受的载体包括任何标准药物载体，诸如 憐酸盐缓冲盐水溶液、水和乳状液，诸如油/水或水/油乳状液，W及各种类型的润湿剂。组 合物可W另外含有固体药物赋形剂，诸如淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、薦糖、明胶、麦 芽、米、面粉、白聖、硅胶、硬脂酸儀、硬脂酸钢、单硬脂酸甘油醋、氯化钢、脱脂奶粉等。液体 和半固体赋形剂可W选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物、植物或合成来 源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。液体载体，特别是用于可注射溶液，包括 水、盐水、葡萄糖水溶液和二醇。对于载体、稳定剂、防腐剂和佐剂的实例，参见Remington's Pharmaceutical Sciences，其由E.W.Martin编车茸(Mack Publishing Company,18th ed., 1990)。还可W存在另外的赋形剂，例如增甜剂、调味剂和着色剂。
[0097] 药学上可接受的赋形剂可W选自填充剂，例如糖和/或糖醇，例如乳糖、山梨糖醇、 甘露糖醇、麦芽糖糊精等;表面活性剂，例如月桂基硫酸納、Brij96或吐溫80;崩解剂，例如 淀粉径乙酸钢、玉米淀粉或其衍生物;粘合剂，例如聚维酬、交聚维酬(crosspovidone )、聚 乙締醇、径丙基甲基纤维素;润滑剂，例如硬脂酸或其盐;流动性增强剂，例如二氧化娃;增 甜剂，例如阿斯己甜；和/或着色剂。药学上可接受的载体包括任何和所有的临床上可用的 溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
[0098] 药物组合物可W含有用于改变、维持或保持例如组合物的抑、容积渗克分子浓度 (osmolar ity )、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌度、稳定性、溶出度或释放度、吸附或 穿透的赋形剂。合适的赋形剂包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酷胺、天冬酷胺、精氨 酸或赖氨酸）；抗微生物剂;抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钢或亚硫酸氨钢）；缓冲剂(诸 如棚酸盐、碳酸氨盐、Tris HC1、巧樣酸盐、憐酸盐、其他有机酸）；增量剂(诸如甘露糖醇和 甘氨酸），馨合剂(诸如乙二胺四乙酸化DTA)、乙二醇四乙酸化GTA));络合剂(诸如咖啡因、 聚乙締化咯烧酬、β环糊精或径丙基β环糊精）；填充剂;单糖;二糖和其他碳水化合物(诸如 葡萄糖、甘露糖或糊精）；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白）；着色剂;调味剂和 稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(诸如聚乙締化咯烧酬）；低分子量多肤;成盐抗衡离子(诸如 钢）；防腐剂(诸如苯扎氯锭、苯甲酸、水杨酸、硫柳隶、苯乙醇、对径基苯甲酸甲醋、对径基苯 甲酸丙醋、氯己定、山梨酸或过氧化氨）；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇）；糖醇(诸如甘 露糖醇或山梨糖醇）；悬浮剂;表面活性剂或润湿剂(诸如普朗尼克(pluroniCS)、PEG、脱水 山梨醇醋、聚山梨酸醋诸如聚山梨酸醋20、聚山梨酸醋80、曲拉通(triton)、氨基下Ξ醇、卵 憐脂、胆固醇、四下酪醒(tyloxapal));增强稳定剂(薦糖或山梨糖醇）；增强张力剂(诸如碱 金属的面化物(在一方面，氯化钢或氯化钟，甘露糖醇，山梨糖醇）；递送载体;稀释剂;赋形 剂和/或药物佐剂。（Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition, A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company,1990)。
[0099] 口服剂型可W是片剂、胶囊剂、棒剂(bars)、囊剂（sachets)、颗粒剂、糖浆剂和水 性或油性混悬剂。片剂可W通过已知方法由活性化合物与填充剂例如憐酸巧;崩解剂，例如 玉米淀粉，润滑剂，例如硬脂酸儀;粘合剂，例如微晶纤维素或聚乙締化咯烧酬和本领域已 知的允许将混合物压片的其他任选成分形成的混合物形成。类似地，可W通过已知方法制 备含有活性化合物的胶囊剂，例如硬或软明胶胶囊剂。可W使用已知方法配制胶囊的内容 物W缓释活性化合物。其他用于口服施用的剂型包括例如含有在水性介质中在无毒助悬剂 (诸如簇甲基纤维素钢）的存在下的活性化合物的水性混悬剂，W及含有在合适的植物油 (例如花生油）中的活性化合物的油性混悬剂。可W在存在或者不存在另外的赋形剂的情况 下将活性化合物配制成颗粒剂。颗粒剂可W由患者直接摄入或者可W在摄入之前将它们添 加至合适的液体载体(例如水）。颗粒剂可W含有崩解剂，例如由酸和碳酸盐或者碳酸氨盐 形成的泡腾对（effervescent pair) W有助于在液体介质中的分散。美国专利号8,263， 662。
[0100] 静脉内形式包括但不限于推注和滴注。静脉内剂型的实例包括但不限于注射用水 USP;水性载体包括但不限于氯化钢注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖与氯化钢注 射液W及乳酸林格注射液;水溶混性载体包括但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；W及非 水载体包括但不限于玉米油、棉巧油、花生油、芝麻油、油酸乙醋、肉豆違酸异丙醋和苯甲酸 节醋。
[0101] 另外的组合物包括延缓或受控递送形式的制剂，诸如使用脂质体或胶束载体、生 物溶蚀性微粒或多孔珠和胆库注射剂。
[0102] 本发明的化合物或组合物可W作为单次剂量、或者随时间作为两次或更多次剂量 (其可W含有或者可W不含有相同量的所期望的分子）、或者经由植入装置或导管作为连续 输注进行施用。药物组合物可W W单个单位剂型制备。
[0103] 可W由本领域技术人员确定合适的施用频率并且可W每天施用一次或几次（例 如，每天两次、Ξ次、四次或五次）。可W每天一次或者每隔一天一次施用本发明的组合物。 还可W-周两次、每周、每月或者每半年给予组合物。在急性施用的情况下，通常W小时或 天的时间段进行治疗，而长期治疗则可W进行数周、数月或者甚至数年。美国专利号8,501， 686。
[0104] 可W使用若干标准方法中的任何一种进行本发明的组合物的施用，包括但不限于 连续输注、推注、间歇输注、吸入或者运些方法的组合。例如，可W使用的一种施用形式设及 连续静脉输注。如果需要，可W在本发明的组合物的输注之前进行推注。
[0…引试剂盒
[0106] 本发明还提供用于治疗或预防屯、血管疾病或其他病况的试剂盒。根据本发明的试 剂盒包括包含本发明的药剂或组合物的包装(例如容器(vessel))。试剂盒可W包括本发明 的表达载体。表达载体可W W单位剂型存在。
[0107] 药物包装材料的实例包括但不限于瓶(bottle)、管、吸入器、累、包、小瓶(vial)、 容器（container)、注射器、瓶和适用于所选制剂和预设的施用和治疗模式的任何包装材 料。
[0108] 试剂盒可W含有用于向患者施用本发明的药剂或组合物的说明书。试剂盒还可W 包含使用本发明的药剂或组合物的说明书。试剂盒还可W含有用于本发明的表达载体或组 合物的标签或产品说明书(product insed)。试剂盒还可W包括用于制备用于实施方法的 溶液的缓冲剂。试剂盒的说明书可W说明表达载体驱动治疗剂的疾病特异性表达。
[0109] 可根据本发明进行治疗的受试者包括可W从本发明的药剂的施用而获益的所有 动物。运样的受试者包括哺乳动物，优选人，但也可W是动物，诸如狗和猫，农场动物诸如 牛、猪、绵羊、马、山羊等和实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等）。
[0110] 提供W下用于实施本发明的具体方面的实施例仅用于举例说明的目的，并且不W 任何方式限制本发明的范围。 实施例
[0111] 实施例1用于屯、血管疾病的疾病限制性白细胞介素10(IL10)-AAV基因治疗
[0112] 许多治疗基因（诸如转化生长因子m(TGFm)和白细胞介素 lO(ILlO))具有某种程 度的不良作用。使用疾病特异性启动子可W将运些基因的"不利面"最小化，还能在疾病部 位提供足够的局部表达W达到治愈。凝集素样氧化低密度脂蛋白受体l(LOXl)(氧化LDL受 体1，化R1)在疾病进程早期被许多细胞类型转录上调，提早并预测未来疾病的部位。在该研 究中，产生使用AAV8衣壳并含有全长L0X1启动子化0Xlpr;2.4kb)的腺相关病毒载体(AAV2 主链)并测定其在接受高胆固醇饮食化CD)的敲除低密度脂蛋白受体化DLR K0)小鼠中表达 具有抗动脉粥样硬化作用的人白细胞介素10化IL10)的能力。在具有类似结构的载体中使 用巨细胞病毒立即早期(CMVpr)启动子进行比较。通过主动脉收缩血液速度、主动脉横截面 面积和主动脉壁厚度所测量的结果发现，AAV2/8丄OXlpr-hlLlO和AAV2/8. CMVpr-hILlO均 给出了统计学上相等的下调动脉粥样化形成的效力。运是在治疗情形下组成型启动子 (CMVpr)与疾病特异性启动子(LOXlpr)的直接比较。
[0…]材料与方法
[0114] 重组AAV病毒的产生
[0115] 我们采用之前已被表征（23-31)的全长2.4扣的1^0乂1启动子。为了产生4八￥/ LOXlpr-ILlO，通过PCR采用W下引物从人293细胞扩增全长Loxl启动子(nt-2402至+9):上 游引物5'-ATATGCATCTTTCTTATTTGGGGGAAG-3'（SEQ ID NO: 14)和下游引物5'- ATACGCGTACTAAAAATATGTGAGCTTCTG-3'（沈Q ID NO: 15)。在引物中包括化i I和Mlu I(加下 划线的)位点W允许在空壳(gutted)AAV2质粒dl3-97内容易连接在hILlO基因前面。W前已 经描述了 AAV/^eo和AAV/CMVpr-hILlO重组病毒的构建和产生（28,37,50)。为了进行对比， 我们采用了被充分研究的巨细胞病毒立即早期组成型启动子(CMVpr)(33,34)。如W前所述 生成病毒储液并通过点印迹杂交进行滴定（18，32，50)。经计算，滴度为大约1 X 109衣壳化 基因组/ml(eg/ml)。
[0116] 动物处理
[0117] 在运些研究中使用敲除低密度脂蛋白受体化化R)的小鼠（B6;129S7-LdlrtmiHe7 J)，其购自 Jackson Laboratories (Bar 化;rbo;r，ME，USA)。两组重16-20 克的雄性小鼠尾静 脉注射44￥2/8丄(^19'-}1比10、44￥2/8.〔1￥9尸}1化10或44￥2/8.5￥4化'-化〇病毒，每种^1又 109eg/ml的滴度经尾静脉注射200ul病毒/小鼠，接着W大约5天的间隔进行两次加强注射。 然后，在第一次注射当天提供4%胆固醇和10%可可脂饮食的高胆固醇饮食化CD)化arlan Teklad，Madison，WI，USA)，并维持连续二十周。该高脂肪水平HCD饮食用于确保发展成动脉 粥样硬化。另一个对照组包括饲喂正常饮食的小鼠。在注射后16周时开始每周对所有动物 进行称重。
[0118] 高分辨率超声成像
[0119] 使用Vevo 770高分辨率成像系统(Visualsonics，多伦多，加拿大)进行超声成像， 使用RMV 707B传感器(transducer )，具有30MHz的中屯、频率。如早先所述准备动物(50)。简 而言之，通过补充氧气并放平成仰邸于恒溫加热平台上，将来自每组的八至十只小鼠用 1.5%异氣酸（Isothesia，At)bot Laboratories，Qiicago，USA)进行麻醉。将它们的腿绑到 ECG电极W监测屯、脏功能。使用剌刀与化学除毛剂(化urch&Dwi曲t Co，Inc.，NJ，USA)-起 去除腹部的毛，然后将预溫育的US凝胶(Medline Industries , Inc.，Mundelein，USA)涂在 皮肤上作为传感器的禪合介质。对主动脉的胸部/腹部区域进行可视化，主动脉弓之下至隔 膜。WB模式开始图像采集，其中使用长轴视图对主动脉长度进行可视化。然后将扫描头探 针转90°用于短轴视图W获得主动脉横截面的照片。还在主动脉的所有水平W长轴和短轴 视图获取个别帖和电影回放(cine loops)(300帖），并在主动脉的整个长度上Wlmm的距离 进行记录。通过倾斜平台并用传感器探针使小鼠的头W向下朝着小鼠的足和尾实现接受超 声的腹部主动脉的流速、定向。所述定位确保多普勒角小于60° W脉冲波多普勒(PW)模式准 确测量主动脉内的血流速度。使用自定义版本的Vevo770分析软件对纵向和横向图像离线 进行测量和数据分析。对每只小鼠进行完整的成像过程需要花费大约25-30分钟。
[0120] 血浆胆固醇的测量
[01別]退伍军人动物实验室（Veterans Animal Laboratory,VAMU)通过VetScan VS2 (ABAXIS，化ion City，CA)测量来测定动物组的总胆固醇的血浆水平。
[0122] 使用实时定量逆转录PCR (QRT-PCR)的h IL10基因表达分析
[012引每组处死六只小鼠并根据制造商的说明书用TRIzol提取法（Invitrogen Carlsbad，CA)提取总主动脉RNA。使用随机六聚体引物和RNase Η-逆转录酶（Invitrogen， Carlsbad,CA)产生cDNA。然后如（33)所述使用Applied Biosystems Fast 7900HT实时PCR 系统（A卵lied Biosystems .i^ster City ,CA)进行QRT-PCR。我们使用基于网络的Probe- Finder(http://www.roche-applied-science com)软件从Roche Applied Science的人和 小鼠通用探针库化uman and Mouse Universal ProbeLibrary)设计了用于分析人ILIO的 qRT-PCR特异性引物。使用SDS 2.3相对定量(39)管理器软件进一步分析结果。针对朗几动蛋 白参考基因对比较阔值循环(Ct)值进行归一化，然后通过方法用校准器进行比较。
[0124] AAV2/8 递送 hILlO
[0125] 为了研究使用疾病特异性启动子限制全身性IL-10表达的不良反应的可能性，在 LDLR K0小鼠中将AAV2/8丄OXlpr-ILlO的效力与AAV2/8.CMVpr-IL10递送进行比较，然后将 其置于接受高胆固醇饮食化CD)。还将AAV/新霉素抗性基因（化0)载体(AAV2/8 . SV40pr- 化0)用作非治疗性空白对照。图1A显示了载体结构，图1B显示了总体实验方案。图2显示了 AAV丄OXlpr-hlLlO载体质粒的更详细的视图。收获时，一部分小鼠被处死W通过使用qRT- PCR分析法分析主动脉中hILlOmRNA的表达来确定成功的基因递送。该分析采用在第20周收 获的从每组6只小鼠主动脉分离的mRNA。图3显示了LOXlpr-和CMVpr-hILlO处理的小鼠的代 表性结果，观察到运两个载体在主动脉中we-肌动蛋白的大约0.1-0.2%的水平高表达。此 夕h尽管由CMVpr和LOXlpr控制的表达在统计学上类似，但很明显LOXlpr表达倾向更低的表 达，与CMVpr的表达相比不足50 %。
[01%] 治疗性CMVpr-hILlO和LOXlpr-hlLlO转基因递送均W相等的效力抑制主动脉血流 速度。
[0127] 已经证实了 CMVpr-hILlO或LOXlpr-hlLlO二者的显著的基因递送/表达，我们然后 研究了转基因的作用。图3A显示CMVpr-hILlO和LOXlpr-hlLlO-转基因-HCD-处理的动物具 有类似水平的总胆固醇水平，并且与化0-处理的HCD饲养的动物相当，但是h比-10处理的动 物倾向于略低，如W前已经见到的那样。至于动物体重，所有的处理组在统计学上与正常饮 食(ND)对照是相同的，但在两个hILl0-处理的动物组中倾向于略低（图3B)。
[0128] 我们分析了动脉血流速度作为简单的技术来计算小鼠组中动脉粥样硬化的程度。 通过高分辨率超声化RUS)成像系统Vevo 770对八至十只动物得到的测量结果来定量主动 脉的胸部/腹部区域中收缩血液速度。图5显示来自对每只动物的五次单独的测量的量化收 缩血液速度。可W看到，Neo-HCD-处理的动物表现出在其主动脉中显著更高的血流速度，与 缩小的主动脉腔一致。此外，CMVpr-和L0X Ipr-驱动的对HCD的基因治疗化化-10)均比化0- HCD-处理组具有显著更低的流速，并且十分类似于ND饲养的对照动物的流速。因此，如较低 的血液速度所提示的，CMVpr-和LOXlpr-处理均表现出抗动脉粥样硬化作用并且它们的效 力程度在统计学上类似。
[0129] 治疗性CMVpr-hILlO和LOXlpr-hlLlO基因递送均W相等的效力抑制与动脉粥样硬 化相关的主动脉结构变化。
[0130] 然后，我们通过首先测量主动脉横截面分析了各个实验组的主动脉内的结构变 化。在每组中从八至十只动物中获得多个测量结果。在相同的胸部/腹部部位进行测量(参 见材料与方法部分）。图6显示对主动脉的胸部/腹部区域的定量结果。可W看到，AAV/化0- HCD-处理的阳性对照动物具有最小的腔横截面面积，与较高的动脉粥样硬化程度一致。与 之相比，均接受HCD的两个治疗性处理，LOXlpr-hlLlO-HCD和CM化r-ILlO二者，具有比化0- 处理的-HCD对照大得多的腔，并且运种差异是统计学上显著的。ND组倾向于具有最大的腔。
[0131] 还测量了主动脉的胸部区域的壁厚度。图7显示对主动脉的胸部区域的定量结果。 化0-肥D-处理的动物表现出最厚的主动脉壁，而CMVpr-和LOXlpr-hlLlO载体-肥D-处理均 是有效的(P = <.05)，并且彼此是统计学上类似的(p = NS)。与预期的一样，ND组具有最薄的 主动脉壁。因此，通过皿US获得的所有Ξ种测量结果(主动脉收缩血液速度、腔大小和壁厚 度)显示LOXlpr驱动的载体与CMVpr驱动的载体同等有效。
[0132] 讨论
[0133] 运里我们证实AAV2/8丄OXlpr-hlLlO载体有效抑制接受肥D的LDLR K0小鼠的动脉 粥样化形成，并且与来源于AAV2/8. CMV-IL10载体递送的抑制在统计学上是相等的。运是疾 病特异性启动子与通用表达启动子的直接比较用于确定效力水平。巨细胞病毒立即早期启 动子可能是基因递送实验中最常使用的启动子。因此，该研究确定了疾病特异性启动子仍 然能够表达治疗性转基因至有效水平。已经显示，与野生型L0X-1启动子一样，2.4化L0X1 启动子片段对于疾病相关刺激具有显著的活性和应答性。正常情况下，基础水平的L0X1启 动子活性非常低(44-48)。将来，我们还将利用非分泌的标记物基因来观察载体结合的疾病 特异性启动子的活性。很可能化LDL仍具有作用，因为我们用HCD增强该药剂，但是其他刺激 也是可能的，诸如血管紧张素 II。最近已对L0X1启动子进行了综述(35)。
[0134] 另外，除了 L0X-1作为动脉粥样化形成活性启动子之外，还存在大量的被类似上调 的基因。DNA微阵列实验用被发现受调控的许多基因必定解决运一问题(52-56)。动脉粥样 化形成期间与动脉壁一起存在的细胞的环境也随时间发生改变(57-59)。当考虑要使用的 确切的疾病特异性启动子、它的强度、时序和可能的细胞偏好时应当考虑运个问题。在正常 动脉中，在动脉壁内存在低单核细胞群体，而随着内皮的活化和另外的单核细胞的募集，运 一数量显著升高。但是，在HCD引发疾病之前全身性递送我们的AAV载体。因此，很可能发生 某种水平的一般单核细胞群体的转导，包括一些最终将迁移进入动脉壁的群体。关于运一 问题，我们在运里利用一种动脉粥样硬化模型，其中动脉粥样化形成是由HCD诱导的、从零 点(null S化ndpoint)开始的主动的、正在进行的过程。另一个相关模型是对所建立的斑块 的消退的观察。
[0135] 我们已经研究了AAV/IL10和下游的STAT3的限制LDLR K0小鼠的动脉粥样化形成 的治疗用途。运一系列的研究(37,59,60)连同其他研究（36,37)已经显示了 IL10(和IL10信 号传导途径)有益于通过基因治疗限制动脉粥样化形成。使用被表达于AAV2自身的p5启动 子的IL10的第一研究证实，IL10有效抑制接受HCD的LDLR K0小鼠的斑块发展（18)。在第二 部分中，我们证实STAT3(IL10信号传导通过其发挥作用的基因）也起到抗动脉粥样化形成 的作用（59)"STAT3的基因递送可W用作IL10的替代基因，希望其比IL10具有更少的不良反 应。第Ξ研究考察了IL10加上STAT3双基因递送，研究了 W下假设:在同一抗炎信号转导途 径中的两个基因可能协同作用W限制动脉粥样硬化(60)。最后，回到单独使用原始IL10基 因，运里我们证实AAV2/8丄OXlpr-ILlO递送与AAV2/8.CM化r-ILlO递送在限制动脉粥样化 形成的发展方面同等有效。图2中的LOXlpr结构显示化-U)L和Angll应答所需的DNA元件仅 代表全长2.4kb的启动子的一小部分。运表明可W对L0X1启动子进行一些缩合W使该疾病 特异性启动子更短并更有用于更多种转基因。运很重要，因为当基因组的大小上升到大于 4.化b，AAV基因组的包装变得更成问题(61)。但是，也可W研究对IL10或者除了 STAT3之外 的其他下游基因的其他疾病特异性启动子和改变。该研究还固化了腺相关病毒载体用于屯、 血管基因治疗(37-40，59，60) W及其他疾病(34-37)的可用性和效用。
[0136] 实施例2用于屯、血管疾病的疾病限制性白细胞介素10(IL10)-AAV基因治疗-- AAV载体的修饰
[0137] 为了安全设计带有运样强效基因的载体，我们已经在基因治疗中开创了"疾病特 异性启动子"基因表达方法。疾病特异性启动子将限制IL10的表达和"不良反应"，但是会在 疾病部位提供足够的表达W给予治疗。在CVD(屯、血管疾病)早期在许多细胞类型(包括平滑 肌细胞)中L0X1基因被转录上调，提早并预测未来CVD的部位。
[0138] 我们通过研究腺相关病毒载体(AAV2主链），使用AAV8衣壳并含有驱动人化）IL10 的表达的L0X1全长启动子化0Xlpr;2.4化），对接受高胆固醇饮食化CD)的敲除低密度脂蛋 白受体(LDLR K0)小鼠的抗动脉粥样硬化作用，来检验运种疾病限制性基因治疗假设。我们 比较了含有驱动 hILlO 表达的 LOXlpr 的 AAV2/8 丄 OXlpr-hlLlO 与 AAV2/8.CMVpr-hIL10。 CM化r是用于比较的强组成型启动子(对所有时间，阳性对照）。如通过主动脉横截面面积、 主动脉壁厚度和主动脉收缩血液速度所测量的，LOXlpr载体在下调动脉粥样化形成中给出 与CMVpr载体统计学上相等的效力，但是使用LOXlpr,总体IL10表达显著更低。总之，疾病特 异性LOXlpr给出IL10的治疗性表达，但同时保持总体更低的IL10表达。
[0139] 用能够在充分考虑(well respected)的动物模型中抑制动脉粥样硬化的疾病限 制性AAV2-L0Xlpr-hIL10DNA载体主链，我们的目标是产生用于增强AAV2-L0Xlpr-IL10载体 主链的递送的改进的AAV技术，并在大的动物模型中测试其安全性。在此研究中，我们有Ξ 个任务。在任务1中，我们将对上述已经过证明的治疗技术进行两点具体改进W产生更有效 的AAV2/8(cvdl)。改进包括在AAV8衣壳中的ΕΥΗ基序和酪氨酸修饰，诸如酪氨酸取代和ΕΥΗ 插入到AAV8衣壳基因中。然后将在外植的人动脉中对LOXlpr-ILlO载体测试改进的基因递 送。在任务2中，将在小鼠模型(例如巧7BL/6LDLR K0小鼠）中对运一相同的载体分析达到对 抗HCD诱导的动脉粥样硬化的效力所需的滴度，在任务3中，在兔模型(例如家族性高胆固醇 血症W扭正兔）中分析达到效力所需的滴度。运些任务的完成将允许我们在最终进行I期患者 临床试验之前进一步对我们的抗动脉粥样硬化基因治疗剂进行毒理学分析。
[0140] 具体目的
[0141] 我们将通过两个修饰对AAV8衣壳进行修饰并证实其改进的基因递送能力，然后测 定疾病特异性LOXlpr-hlLlO基因盒通过基因递送至两个动脉粥样硬化动物模型LDLR K0小 鼠和WHHL兔的效力。
[0142] 我们将进行W下任务。
[0143] 1)产生单修饰和双修饰(组合的）酪氨酸-负、EYH-阳性AAV8衣壳并测试在人胎盘 厮带血管中基因递送的改进。
[0144] 2)测定AAV2/8(cvdl)丄OXlpr-ILlO载体对抗LDLR K0小鼠的肥D诱导的动脉粥样 硬化的效力所需的滴度。
[0145] 3)测定AAV2/8(Cvd 1)丄0X1 pr-IL10载体对抗WHHL兔的肥D诱导的动脉粥样硬化的 效力所需的滴度。
[0146] 结果可W包括如下内容：
[0147] 1)W高于野生型AAV8衣壳载体至少大约3倍改进基因递送至厮带血管平滑肌细胞 中。
[014引 2)抑制LDLR K0小鼠的HCD诱导的动脉粥样硬化达至少70%。
[0149] 3)抑制WHHL兔的HCD诱导的动脉粥样硬化达至少70%。
[0150] 研究策略
[0151 ]动脉基因递送的祀点包括表达L0X-1的平滑肌细胞。
[0152] 使用在疾病部位中度表达的L0X1启动子的疾病限制性IL10表达
[0153] 使用L0X1转录启动子化OXlpr)作为用于表达对抗动脉粥样化形成的治疗基因的 疾病特异性启动子，我们比较了 AAV2/8丄OXlpr-hlLlO基因递送与AAV2/8.CMVpr-hIL10基 因递送，并发现二者提供统计学上类似的效力。
[0154] 第一技术将要用两个修饰改进AAV血清型8(AAV8)衣壳蛋白W增强基因递送至动 脉中。运些是用于衣壳存活的氨基酸酪氨酸修饰，W及用于非常高频感染平滑肌细胞的EYH 肤插入。
[01巧]方法
[0156] AAV载体用于CVD祀向的基因治疗的额外优点。
[0157] 我们和其他人(28-34)已经显示，通过AAV的基因表达能够稳定保持许多个月。另 夕h AAV被屯、血管组织有效摄取(28-34，27，29) sRichter等人(50)显示在颈动脉中有效转导 W及平滑肌细胞(SMCs)是主要祀点。经单次静脉内注射，我们在肝、肺、肾和血管中发现了 类似摄取结果(参见图8)。实际上，AAV具有高安全性和长期表达运两种优点。
[015引通过插入ΕΥΗ修饰AAV改进平滑肌细胞转导。我们通过插入肤ΕΥ皿YNK(EYH)修饰 AAV2衣壳，该肤促进培养中的人血管平滑肌细胞(VSMCs)的感染(66-69)。我们通过在氨基 酸(AA)第588位将作为DNA序列的EYH肤序列插入AAV衣壳基因来重复一般性AAV衣壳修饰。 然后，我们测定其在培养中的人胎盘厮静脉环内转导人VSMCs的能力。如图8所示，我们观察 到AAV2衣壳的EYH修饰增强了 VSMCs的转导。
[0159] 采用AAV2/EYH修饰所带来的运种增强启示我们在提出的研究中采用运种AAV衣壳 代替我们最近最常使用的AAV8。我们还进行了另外的衣壳修饰，如果它们证明是更优的，我 们可用其代替AAV2/EYH。例如，当被苯丙氨酸取代时，AAV2衣壳基因内的一系列酪氨酸突变 显示出允许10-50倍更高的转导(69)。运些中最重要的是第730位的氨基酸(aa)(69)。尽管 AAV2是最常使用的载体并且是历史上第一个被用于基因递送的AAV血清型，我们已经广泛 使用AAV8用于动脉基因递送(60-62)。在运个阶段我们的目标是将将运两个修饰均翻译至 AAV8,并产生AAV8/Y730F/EYH基础载体。运些修饰应当给我们带来高度有效的屯、血管基因 治疗载体，我们会使用它递送我们的治疗转基因 LOXlpr-ILlO。
[0160] AAV2/8丄OXlpr-hlLlO证实IL10的疾病限制性表达提供对抗动脉粥样化形成的效 力，但比使用CMVpr时具有显著更低的总体表达。
[0161] 该研究固化了疾病特异性基因治疗方法的重要性。运也是重要的，因为大多数基 因治疗方法使用组成型启动子，其随时随地"的方法表达基因。运是危险的。
[0162] 研究设计和方法
[0163] 任务1是产生新的衣壳、蛋白质外壳，一种修饰的AAV8,其给出了更高的动脉中平 滑肌细胞转导。我们的目标是W高于野生型AAV8衣壳载体至少5倍改进基因递送至厮带血 管中。运将给我们一种新的、改进的用于基因递送至动脉中的修饰AAV8载体。运种改进的 CVD基因递送载体将被称为AAV2/8(cvdl)丄OXlpr-ILlO。任务2是测定AAV2/8(cvdl) 丄OXlpr-ILlO载体达到对抗LDLR K0小鼠的HCD诱导的动脉粥样硬化的效力所需的滴度。任 务2的发现将决定在II期毒理学研究中测试所需要的病毒水平，作为进入临床研究之前的 序幕。任务3是测定在任务1中产生的AAV2/8(cvdl)丄OXlpr-ILlO载体达到对抗WHHL兔的 HCD诱导的动脉粥样硬化的效力所需的滴度。
[0164] 任务1:通过置换特定酪氨酸和插入EYH肤修饰AAV8。任务1包括AAV8衣壳的两个修 饰。一个修饰将是插入EY胡太，其改进对人血管平滑肌细胞的感染(参见图8)。平滑肌细胞在 正常主动脉W及晚期粥样斑中是丰富的。而且，L0X-1在动脉平滑肌细胞中通过各种损伤 (insults)诸如氧化低密度脂蛋白和促炎细胞因子(73-74)被上调。另一个修饰将是去除某 些酪氨酸氨基酸，其被用于不成熟的AAV衣壳降解的细胞蛋白酶系统祀向。因此在运里我们 的目标是将运两个有价值的修饰均转移至AAV8,并产生AAV8/Y730F/EYH基础载体。运些修 饰应当带给我们高度有效的屯、血管基因治疗载体，我们将能够使用它递送我们的治疗转基 因 LOXlpr-ILlOeAAV载体的实际DNA序列将不会改变。因此，AAV/LOXlpr-ILlO载体的疾病限 制性表达将如实施例1中所示特异性发挥功能。唯一的变化将是衣壳修饰将导致更高的递 送运些AAV载体至动脉中的速率。
[01化]我们将如我们对AAV2衣壳所做的那样通过插入EYHHYNK化YH)肤来修饰AAV8衣壳， 该肤促进与培养中的人血管平滑肌细胞（VSMCs)的结合和感染（68-70)。我们将利用 GenScript在AAV8辅助质粒pDG8内产生修饰。尽管原始工作是用培养的人VSMCs的AAV2感染 进行的，我们通过在氨基酸(AA)第590位将作为DNA序列的ΕΥΗ肤序列插入到AAV衣壳基因中 来重复AAV8中的一般性AAV衣壳修饰(75)。然后，我们测定其在培养中的人胎盘厮带静脉环 内转导人VSMCs的能力。如图8所示，我们观察到EYH增强了 VSMCs的转导。
[0166] 通过插入EYH和通过用F/苯丙氨酸置换特定酪氨酸修饰AAV8。然后，我们将使用 GenScript修饰AAV8衣壳W携带运两个修饰，并再次测试运两个修饰一起的改进的转导培 养中的人胎盘厮带静脉环内的人VSMCs的能力。
[0167] 通过用F/苯丙氨酸置换特定酪氨酸修饰AAV8。我们还将进行除了 AAV8/EYH之外的 另外的衣壳修饰(Genscript)。当被苯丙氨酸取代时，AAV2衣壳基因内的一系列酪氨酸突变 已被报道允许10-50倍更高的转导（69)。运些取代中最重要的是第444位和第730位的氨基 酸（aa)(69KAAV8衣壳蛋白中与AAV2的aa444和730类似的位置是aa447和733(参见图9) (76)。然后，我们将产生AAV8/Y447F/Y733F/590-EYH病毒，其包括增强型绿色巧光蛋白 (eGFP)并测定其转导培养中的人胎盘厮带静脉环内的人VSMCs的能力。
[0168] 在下文AAV2/8(cvdl)是指来源自任务1的修饰的AAV2/8-Y730F-EYH衣壳。
[0169] 任务2:测试在LDLR K0小鼠中的效力。任务2的目标是测定给出效力所需的AAV2/8 (cvdl)丄OXlpr-ILl(KKcardi〇-l)的量、滴度。我们将使用LDLR K0小鼠模型来测定运一有 效滴度dS种不同的剂量1〇8、1〇哺lO^eg(衣壳化基因组）的AAV2/8(cvdl)丄OXlpr-ILlO。 我们的目标将是当置于接受高脂肪高胆固醇饮食化CD)时使LDLR K0小鼠模型的动脉粥样 硬化抑制70 %。然后，关于效力所需的病毒量的信息将被用于2期毒理学研究。方法被更详 细地描述于我们W前的出版物(26-31，33，35，48，48，70-72)中。
[0170] 病毒基因组构建和AAV生产。我们已经利用由我们实验室描述的标准操作步骤来 开发AAV递送载体AAV2/8(cvdl)丄OXlpr-ILlO，其示于图2中。
[0171] 动物数量的调整。对我们早先的实验的强力分析表明我们将需要12组动物。
[0172] 动物、组织和转基因表达分析。在屯个治疗组的每组中的巧7BL/化化R K0小鼠 (18-20克)将包括:AAV2/8(cvdl)是指来源自任务1的修饰的AAV2/Y730F/EYH载体衣壳。 [017引 l)AAV2/8(cvdl)/化 0-正常饮食(ND)，
[0174] 2)AAV2/8(cvdl)Afe〇-HCD，
[01巧]3)八4￥2/8(趴(11)/空（没有基因）-肥0,
[0176] 4)108eg的AAV2/Wcvdl)丄OXlpr-ILlO-肥D，
[0177] 5)109eg的AAV2/Wcvdl)丄OXlpr-ILlO-肥D，
[017引 6) 101 日eg的AAV2/Wcvdl)丄OXlpr-ILlO-肥D，^及
[0179] 7)ND对照小鼠（每组12只动物）〇
[0180] 化0-和IL10-基因处理的动物将在第一次注射当天饲喂由4%胆固醇和10%可可 脂组成的高胆固醇饮食化CD)化arlan Teklad，Madison，WI)。将包括饲喂正常饮食的小鼠 作为对照。将每周对动物进行称重。
[0181] 通过定量实时逆转录酶-PCR(qRT-PCR)分析主动脉中的标记物和细胞因子。运将 通过标准方法学来进行。待分析的基因包括巨隧细胞标记物诸如CD68、CD36、ITGAM和EMR。 我们预期当递送AAV/IL10时运些将显著下降。其他待研究的基因包括CD4、CD8、CD14、CD25、 CD56、白细胞介素（IL)-2、干扰素（IFN)-丫、比-4、比-7、比-10、化-17、转化生长因子(TGF)- m和β-肌动蛋白（管家基因对照）。
[0182] 通过免疫组化分析标记物和细胞因子。将利用标准方法可视化并测量所述的各自 祀点（28，29，54，64，63)。特别地，将研究巨隧细胞标记物诸如CD68、CD36、ITGAM和EMR。
[0183] 通过油红0染色分析动脉粥样化形成。运将如我们已用苏丹红IV进行的那样通过 标准方法来进行。
[0184] 通过组织学横截面切片分析动脉粥样硬化。将获得的主动脉固定于福尔马林中。 将十张切片置于载片上并通过成像软件（Image Pro Plus,Media切bernetics)进行分析 W定量斑块形成。
[0185] 高分辨率超声（HRUS)成像。通过标准方法用Vevo 770高分辨率成像系统 (Visualsonics，多伦多，加拿大)和具有30MHz中屯、频率的RMV 707B传感器来进行超声成像 (27,54,63,64,72-91)〇
[01化]血浆胆固醇的测量。在退伍军人动物实验室（VAMU)通过VetScan VS2(ABAXIS， 化ion City)测量各个处理组的小鼠的总胆固醇的血浆水平。
[0187] 通过直接观察分析动脉粥样化形成。整个解剖的主动脉将被固定于10%缓冲的福 尔马林中，并在解剖显微镜下检查，照相，并通过Image J软件（ImageJ，US化tional Institutes of Health,Bethesda,MD)进行数字图像分析。
[0188] 统计学分析。用Windows下11.5版的用于社会科学的统计程序（Statistical Program for Social Sciences，SPSS Inc,Qiicago)通过非参数AN0VA分析进行统计学分 析。如果在手段之间检测到差异，那么将使用化wman-Keuls检验进行多重比较。P<0.05的差 异将被认为是显著差异。
[0189] 任务3 :测试在WH化兔中的效力。任务3的目标是测定给出效力所需的AAV2/8 (cvdl)丄0Xlpr-ILl(KKcardi〇-l)的量、滴度。我们将使用第二种动物模型来测定效力滴 度，即瓦塔纳贝遗传性高脂血症（W皿L)兔化化受体缺乏ΚΞ种不同的剂量l〇w、l〇ii和 l〇i2eg(衣壳化基因组）的AAV2/10(cvdl)丄OXlpr-ILlO病毒。我们的目标将是当置于接受高 脂肪高胆固醇饮食化CD)时使WHHL兔模型的动脉粥样硬化抑制70%。在发展成动脉粥样硬 化之前(不需要HCD)在2个月大时感染WHHL兔，并当预计动脉粥样硬化覆盖大约35%的主动 脉表面时在6个月时进行分析。然后，关于效力所需的病毒量的信息将W10X/体重(十倍水 平)被用于II期毒理学研究。动物组将是：l)AAV2/8(cvdl)/Neo-正常饮食(ND)，2)AAV2/8 (。￥(11)/空，3)1〇1日6邑的44￥2/8((；￥(11)丄0乂1口'-化10,4)1〇116邑的44￥2/8((；￥(11)丄0乂1口'- IL10,5)l〇i2eg的AAV2/Wcvdl)丄0乂19尸比10，^及6作0对照兔(每组5只动物）。所有实验研 究将与采用LDLR K0小鼠的任务2类似地进行，并相对于运些小鼠的大小（18-24克），对于大 小增大的兔(1500-2000克)成比例放大测定和读数。
[0190] 本发明的保护范围并不局限于上文已经具体示出和描述过的内容。本领域技术人 员将会认识到，对于所描述的材料、配置、构建和尺寸的实例存在合适的替代方式。在本发 明的说明中引用并讨论了许多参考文献，包括专利和各种出版物。提供运些参考文献的引 用和讨论仅仅是为了阐述本发明的说明，并不是承认任何参考文献是本文所述的发明的现 有技术。在本说明书中引用和讨论的所有参考文献通过引用将其全文并入本文。本文所述 的变化、修改或其他实施是本领域普通技术人员在不偏离本发明的精神和保护范围的情况 下可W想到的。尽管已经显示并描述了本发明的某些实施方案，可W在不偏离本发明的精 神和保护范围的情况下进行改变和修改对于本领域技术人员来说是明显的。前面的描述和 附图中所列的内容仅通过举例说明的方式予^提供并不作为任何限制。
[0191] 引用
[0192] 1)Hermonat PL,and Muzyczka N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470，1984.
[0193] 2)Hermo打at PL.The first ade打o-associated virus gene transfer experiment，1983.In press Human Gene Therapy,2014.
[0194] 3)Buchlis，G，Podsakoff GM，Radu A，Hawk SM，Flake AW，Mingozzi F，High KA.Factor IX expression in skeletal muscle of a severe hemophilia B patient lOyears after AAV-mediated gene transfer.Blood，2012Mar 29:119(13):3038-41.
[019日] 4)Zhu H，Cao M，Chriva-Internati M，Hermonat PL.Comparison of efficacy of human interleukin 10,expressed from the disease-specific LOXlor constitutive cytomegalovirus promoters,against atherosclerosis in mice using adeno-associated virus 2/8delivery. in press PLoS ONE,2014.
[0196] 5)Zhu H，Cao M,Figueroa JA'Cobos E'Uretsky BF'Qiiriva-Internati M, Hermonat,PL.(2014)AAV2/8-hSMAD3gene delivery attenuates aortic atherogenesis， enhances Th2response,without inducing C0LlA2/2Aland CTGF(fibrosis)in LDL民一KO mice on high cholesterol diet.In press J Translational Medicine.
[0197] 6)Zhu H,Cao M,Straub KD,Hermonat PL.(2013)Systemic delivery of thiol- specific antioxidant hP民DX6gene by AAV2/8inhibits atherogenesis in LDL民 KO mice on HCD.In press Genetic Syndromes and Gene Therapy
[0198] 7)Damdindorj L，Karnan S，0ta A，Hossain E，Konishi Y，Hosokawa Y，Konishi H.A comparative analysis of constitutive promoters located in adeno- associated viral vectors.PLoS 0ne.2014Aug 29；9(8):el06472
[0199] 8)Filippi CM,von Herrath MG.IL-lOand the resolution of infections.High levels of ILlOare associated with increased viral,bacterial, and fungal infections,as well as cancer.J Pathol 214:224-230,2008.
[0200] 9)Zobel，Katrin.Martus，Peter.PIetz，Mathias W.Ewig,Santiago.Prediger, Michael.Weite,Tobias.Buhling,Frank.Interleukin 6,lipopolysaccharide-binding protein and interleukin 10 in the prediction of risk and etiologic patterns in patients with community-acquired pneumonia: results from the German competence network CAPNETZ.BMC Pulmonary Medicine.12:6,2012.
[0201] 10)Clemons KV.Grunig G.Sobel RA.Mirels LF.Rennick DM.Stevens DA.Role of IL-10 in invasive aspergillosis:increased resistance of IL-10 gene knockout mice to lethal systemic aspergillosis.Clinical&Experimental Immunology·122(2):186-91,2000·
[0202] ll)Brooks，D.G.，A.lVLLee，H.Elsaesser，D.B.McGavern，andM.B.01dstone.IL- 10 blockade facilitates DNA vaccine-induced T cell responses and enhances clearance of persistent virus infection.J.Exp.Med.205:533-541,2008.
[0203] 12)Brooks，D.G.，Μ·J.Trifilo，K.H.Edelmann，L.Teyton，D.B.McGavern，and M.B. Oldstone . Interleukin-10 determines viral clearance or persistence in vivo.Nat.Med.12:1301-1309,2006..
[0204] 13)Ejrnaes，M.，C.M.Filippi，M.M.Martinic，E.M丄ing，L.M.To組er，S.Crotty， and M.G.von Herrath.民esolution of a chronic viral infection after interleukin-10 receptor blockade.J.Exp.Med.203:2461-2472,2006.
[020日]14 ) Zeni E，Maz ze 11 i L，Mi o t to D，Lo Case io N，Mae s tr e 11 i P，e t al.Macrophage expression of interleukin-10 is a prognostic factoir in nonsmall cell lung cancer.Eur 民espir J 30:627-632,2007.
[0206] 15)Maris，C.H.，C.P.Chappell，a打d J.Jacob. Interleukin-10 plays an early role in generating virus-specific T cell anergy.BMC Immunol.8:8.2007.
[0207] 16)舶计过的11 H，Sch0lmericllJ· IL-10 therapy in Crohn's disease:at the crossroads.Gut 50:146-147.
[020引 17)Hermonat PL，Zhou H，Cao M,Mehta JL丄OX-1 transcription.Cardiovase Drugs Ther.，2012.
[0209] 18)Flotte TR'Afione SA'Solow R'Drumm ML'Markakis D,加 ggino WB'Zeitlin PL,Carter BJ.Expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from a novel adeno-associated virus promoter.J Biol Chem 268:3781- 3790,1993.
[0210] 19)Haberman 民P，McCown TJ,Samulski 民J.Novel transcriptional regulatory signals in the adeno-associated virus terminal repeat A/D junction element.J Virol 74:8731-8739,2000.
[0211] 20)Libby，P,民 idker，PM，Maseri，A. (2002)Inflammation and Atherosclerosis.Circulation.105:1135-1143.
[0212] 21 )Libby，P，民idker，PM，Hans son，GK. Inf 1 animation in atherosclerosis . (2009)J Amer Coll Card 54:2129-2138.
[0213] 22 ) Ludewi g B，Laman JD · ( 2004 ) The i n and out of monocyte s in atherosclerotic plaques:Balancing inflamination through migration.Proc Natl Acad Sci U S A.101:11529-11530.
[0214] 23)Woollard KJ，Geissmann F.(2010)Monocytes in a化erosclerosis:subsets and functions.Nat 民ev Cardiol.7:77-86.
[0215] 24化acolley P'Regnault V'Nicoletti A,Li Z,Michel JB.T'he vascular smooth muscle cell in arterial pathology:a cell that can take on multiple roles.C^rdiovasc Res 95:194-2004,2012.
[0216] 25)Rebsen SSM , Doevendans PAFM,van Eys GJJM . Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.Neth Hea:rt J. 15:100-108,2007.
[0217] 26)Liu Y，Li D，Chen J，Xie J'Bandyopadhyay S，et al·(2006)Inhibition of atherogenesis in LDL民 knockout mice by systemic delivery of adeno-associated virus type 2-hIL-lO.Atherosclerosis 188:19-27.
[0218] 27)Khan JA'Cao M'Kang BY'Liu Y'Mehta JL'Hermonat PL.AAV/IL-10 plus STATS anti-inflammatory gene delivery lowers atherosclerosis in LDL民 KO mice, but without increased benefir.Int J Vase Med 2012:52435,2012.
[0219] 28)Chen S，Kap化rezak MH，Wasserfall C，Glushakova OY，Campbell-Thompson M，et al.(2006) Interleukin 10 attenuates neointimal proliferation and inflamination in aortic allografts by a heme oxygenase-dependent pathway.Proc Natl Acad Sci 102:7251-7256.
[0220] 29)Yoshioka T，0kada T，Maeda Y,Ikeda U，Shimpo M，et al·(2004)Aden〇- associated virus vector-mediated interleukin-10 gene transfer inhibits atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.Gene Therapy 11:1772-1779.
[0221] 30)Sun J，Li X'Feng H，Gu H'Blair T，Li J'Soriano S'Meng Y'Zhang F'Feng Q，Yang X.Magnetic resonance imaging of bone marrow-cell mediated interleukin- 10 gene 化erapy of a化erosclerosis.PloS One 6(9):e24529,2011
[0222] 31)Han X，Kitamoto S，Wang H,Boisvert WA.Interleukin-lOoverexpression in macrophages suppresses atherosclerosis in hyperlipidemic mice.FASEB J 24: 2869-2880,2010.
[0223] 32)Li，D.，et al. Suppression of Atherogenesis by Delivery of TGF lACT Using Adeno-Associated Virus Type 2 in LDL民 Knockout Mice·Biochem·Biophys·Res·Commun·344:701-707，2006.
[0224] 33)Dandapat A,··，Hermonat 化，Mehta JL.Over-e邱ression of TGFbeta(l)by adeno-associated virus type 2 vector protects myocardium from ischemia- reperfusion injury.Gene Ther.15:415-23,2008.
[02巧]34化etterio JJ,Roberts AB.(1998)Regulation of immune responses by TGF-beta.Annu 民ev Immunol 16:137-161.
[0226] 35)de Vries JE.(1995)Immunosuppressive and anti-inflammatory properties of interleukin 10.Ann Med.27:537-41.
[02巧]36)Byfield SD,Roberts AB.(2004)Lateral signaling enhances TGF-beta response complexity.Trends Cell Biol 14:107-111.
[0228] 37)Attisano L'Wrana JL.(2002)Signal Transduction by the TGF-beta Superfamily.
[02巧]Science 296:1646-1647·
[0230] 38)Kopp JB，Factor VM，Mozes M，Nagy P，Sanderson N，et al·(1996) Transgenic mice with increased plasma levels of TGF-beta 1 develop progressive renal disease.Lab Invest 74:991-1003.
[0231] 39)Gressner AM,Weiskirchen R，Breitkopf K,Dooley S.(2002)Roles of TGF- beta in hepatic fibrosis.Front Biosci 7:793-807.
[0232] 40)Filippi CM,von Herrath MG.IL-10 and the resolution of infections.High levels of ILIO are associated with increased viral,bacterial, and fungal infections,as well as cancer.J Pathol 214:224-230,2008.
[0233] 41)Zobel，Katrin.Martus,Peter.Pietz，Mathias W.Ewig,Santiago.Prediger, Michael.Weite,Tobias.Buhling,Frank.Interleukin 6,lipopolysaccharide-binding protein and interleukin 10 in the prediction of risk and etiologic patterns in patients with community-acquired pneumonia: results from the German competence network CAPNETZ.BMC Pulmonary Medicine.12:6,2012.
[0234] 42)Clemons KV.Grunig G.Sobel RA.Mirels LF.Rennick DM.Stevens DA.Role of IL-10 in invasive aspergillosis:increased resistance of IL-10 gene knockout mice to lethal systemic aspergillosis.Clinical&Experimental Immunology·122(2):186-91,2000 Nov.
[0235] 43)Brooks，D.G.，A.M.Lee，H.Elsaesser，D.B.McGavern，and M.B.Oldstone.2008.IL-10 blockade facilitates DNA vaccine-induced T cell responses and enhances clearance of persistent virus infection.J.Exp.Med.205: 533-541
[0236] 44)Brooks,D.G.,M.J.Trifilo,K.H.Edelmann,L.Teyton,D.B.McGavern,and M.B.Oldstone.2006. Interleukin-10 determines viral clearance or persistence in vivo.Nat.Med.12:1301-1309.
[0237] 45)Ejrnaes，M.，C.M.Filippi，M.M.Martinic，E.M丄ing，L.M.To組er，S.Crotty， and M.G.von Herrath.2006.民esolution of a chronic viral infection after interleukin-10 receptor blockade.J.Exp.Med.203:2461-2472
[0238] 46)Maris,C.H.,C.P.Chappell,and J. Jacob.2007. Interleukin-10 plays an early role in generating virus-specific T cell anergy.BMC Immunol.8:8.
[0239] 47化erfai^th H，Sch0lmerich J. (2002)IL-10 化erapy in Oohn's disease:at the crossroads Gut 50:146-147.
[0240] 48)Asadullah K，Sterry W,Volk 册·（2003)Interleukin_10 Therapy-Review of a New Approach Pharmacological Reviews 55:241-269.
[0241] 49)Hermonat PL'Muzyczka N.(1984)Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc Natl Acad Sci USA 81:6466-6470.
[0242] 50)Tratschin JD，West MH,Sandbank T，Carter BJ·(1984)A human p过rvovirus，过deno-过ssoci过ted virus，过s 过 eukaryotic vector:transient expression and encapsidation of the prokaryotic gene for chloramphenicol acetyltransferase,Molec Cell Biol 4:2072-2081.
[0243] 51)Hermonat P，Labow，LM，R.Wright，Berns KI，Muzyczka N.(1984)Genetics of adeno-associated virus: isolation and preliminary characterization of mutants in adeno-associated virus type 2.J Virol 51:329-339.
[0244] 52)Liu Y，Chiriva-Internati M，Grizzi F,Salati E,民oman JJ，Lim S，et al. (2001)民apid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16 E6 antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Can Gene Ther 8:948-957.
[0245] 53)Chiriva-Internati M,Liu Y'Weidanz JA'Grizzi F,You H,Zhou W，et al · (2003)Testing recombinant adeno-associated virus-gene loading of dendritic cells for generating potent cytotoxic T lymphocytes against a prototype self- antigen，multiple myeloma HMl.24.Blood.102:3100-3107.
[0246] 54)You CX，Shi M，Liu Y，Cao M，Luo RC，et al.(2012)AAV2/化-12 gene delivery into dendritic celIs(DC)enhances CTL stimulation above other IL- 12applications:evidence for IL-12 intracrine activity in DC.Oncoimm 2012:1: 847-855.
[0247] 55)Jiang H.'Pierce GF'Ozelo MC，de Paula EV'Vargas JA，et al.(2006) Evidence of multiyear factor IX expression by AAV-mediated gene transfer to skeletal muscle in an individual with severe hemophilia B.Molec Ther 24:452- 455.
[0248] 56)￥θ??θ^Γθη EE,Gussing F'Quintino 1，11111化6巧 C. (2012)Novel disease- specific promoters for use in gene therapy for Parkinson's disease.Neurosci Lett 530:29-34
[0249] 57)Kim HA，Mahato RI，Lee M.(2009)Hypoxia-specific gene e邱ression for ischemic disease gene therapy Adv Drug Del 民ev 61:614-622
[0巧0] 58)Sawamura T，Kume N，Aoyama T，Morlaki H，Hoshikawa H，et al·(1997)An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein.Nature 386:73-77.
[0巧 1] 59)0ka K，Sawamura T，Kikuta K,Itokawa S，Kume N，et al·(1998)Lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1 mediates phagocytosis of aged/ apoptotic cells in endothelial cells.Proc Natl Acad Sci USA 95:9535-9540.
[02己2] 60)Mehta JL，Li D.(1998)Identification and autoregulation of receptor for OX-LDL in cultured human coronary artery endothelial cells.Biochem Biophys 民es Commun 248:511-514.
[0巧3] 61)Kakutani M，Masaki T，Sawamura T.(2000)A platelet-endothelium interaction mediated by lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1.Proc Natl Acad Sci USA.97:360-364.
[0巧4] 62)0gura S'Kakino A，Sato Y'Fujita Y'lwamoto S'Otsui K，et al·(2009) LOX-1:the multifunctional receptor underlying cardiovascular dysfunction.Circ J 73:1993-1999.
[0巧引 63)Aoyama T,Sawamura T，Furutani Y，Matsuoka 民，Yoshida MC，Fujiwara H，et al. (1999)Structure and chromosomal assignment of the human lectin-like oxidized low-density-lipoprotein receptor-1(LOX-1)gene.Biochem J.339:177-184. [0256] 64)陆anJA'Cao M'Kang BY'Liu Y'Mehta JL'Hermonat PL.(2010)AAV/hSTAT3- gene delivery lowers aortic inflammatory cell infiltration in LDL民 KO mice on high cholesterol diet.Atherosclerosis 213:59-66.
[0巧7] 65)Richter M'lwata A,Nyhuis J'Nitta Y,Miller AD'Halbert CL,Allen MD.Ade打o-associated virus vector transduction of vascular smooth muscle cells in vivo.Physiol Genomics 2:117-127,2000.
[02日引 66)Li Q，Muruve DA.Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors.Gene Tlier 10:935-940,2003.
[02日9] 67)Jooss K，Chirmule N.Immunity to adenovirus and adeno-associated viral vectors: implications for gene therapy.Gene Ther 10:9550963,2003.
[0260] 68)Work LM，Nicklin SA, Brain NJR，Dishart KL,von Seggern DJ，et al.Development of efficient viral vectors selective for vascular smooth muscle cells.Mol Ther 9:198-208,2004.
[0261] 69)Zhong L,Li B，Mah CS'Govindasamy L'Agbandje-McKenna M,Cooper M，et al. Next generation of adeno-associated virus vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses.Proc Natl Acad Sci USA 105:7827-7832,2008.
[0262] 70)Wang Z，Zhu T,Qiao C,Zhou L,Wang B，et al.Adeno-associated virus serotype 8 efficiently delivers genes to muscle and heart.Nat Biotechno1 23: 321-328,2005.
[0263] 71)Effic过cy 过nd safety of 过deno-过ssoci过ted vir过1 vectors based on serotype 8 and 9 vs lentiviral vectors for hemophilia B gene therapy .Vandendriessche T ,Thorrez L，Acosta-Sanchez A,Petrus I,Wang L，et 过1.Efficacy 过nd safety of 过deno-过ssoci过ted vir过1 vectors based on serotype 8 and 9 vs lentiviral vectors for hemophilia B gene therapy.J Thromb Haemost 5: 16-24,2007.
[0264] 72)Hermonat PL,Quirk JG,Bishop BM,Han L.Packaging capacity of adeno- associated virus and the potential for wild type-plus AAV gene therapy vectors.FEBS Letters 407:78-84,1997.
[0265] 73)Hofnagel 0，Luechtenborg B，Stolle K，Lorkowski S'Eschei^t H，Plenz G, 民obenek H.Proinflammatory cytokines regulate LOX-1 expression in vascular smooth muscle cells.Arterioscler Tromb Vase Biol 24:1789-1795,2004.
[0266] 74)Sun Y，Chen X.Ox-LDL-induced LOX-1 expression in vascular smooth muscle cells:role of reactive oxygen species.Fundam Clin Pharmacol 25:572- 579,2011.
[0267] 75)Michelfelder S,Varadi K,民aupp C,Hunger A,Korbelin J,Pahrmann C，et al.Peptide ligands incorporated into the threefold spike capsid domain to re? direct gene transduction of AAV8 and AAV9 in vivo.PlosOne 6:e23101,2011.
[0268] 76)Kay CN，Ryals RC，Aslanidi GV，Min SH，Ruan Q，Sun J，et al?T'argeting photoreceptors via intravitreal delivery using novel capsid-mutated AAV vectors.PlosOne 8:e62097,2013.
[0269] 77)Shiomi M,Koike T，Ito T.Contribution of the WHHL rabbit,an animal model of familial hypercholesterolemia,to elucidation of the anti- atherosclerotic effects of statins.Atherosclerosis 231:39-47,2013.
[0270] 78)Liu Y，Li D，Chen J，Xie J'Bandyopadhyay S，et al·(2006)Inhibition of atherogenesis in LDL民 knockout mice by systemic delivery of adeno-associated virus type 2-hIL-lO.Atherosclerosis 188:19-27.
[0271] 79)Qien J,Liu Y,Liu H'Hermonat PL,Mehta JL.(2006)Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1(LOX-1)transcriptional regulation by Oct-1 in human endothelial cells : implications for atherosclerosis. Biochemical J 393:255-265.
[0272] 80)Qien J,Liu Y,Liu H'Hermonat PL,Mehta JL.(2006)Molecular dissection of angiotensin Il-activated human LOX-1 promoter.Arterioscler Thromb Vase Biol.26:1163-1168.
[0巧3] 81)Qin JY'Zhang L'Clift KL,加 lur I，Xiang AP，et al · (2010)Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycyline-inducible promoter.PLOSone 5:el0611
[0274] 82)Zarrin AA，Malkin L，Fong I，Luk 邸，Ghose A，et al·(1999)Comparison of CMV,民SV，SV40 viral and V lambda 1 cellular promoters in B and T lymphoid and non-lymphoid cell lines.Biochim Biophys Acta 1446:135-139.
[0275] 83)Faber BC'Cleutjens KB'Niessen I?L，Aarts PL'Boon W，et al·(2001) Identification of genes potential ly involved in rupture of human atherosclerotic plaques.Circ 民es 89:547-554.
[0276] 84)Armstrong PJ，Johanning JM，Calton Jr WC,Delators JR,化过扯1;!_11 DP,et al.(2002)Differential gene expression in human abdominal aorta:aneurysmal versus occlusive disease.J Vase Surg 35:346-355.
[0277] 85)Hiltunen MO'T'uomistoBrasen JH，Rissanen TT，et al · (2002)Qianges in gene expression in atherosclerotic plaques analyzed using DNA array.Atherosclerosis 165:23-32.
[0巧8] 86)Martinet W，Schrijvers DM，De Meyer CR'lliielemans J，Knaapen MW，et al.(2002)Gene expression profiling of apoptosis-related genes in human atherosclerosis:upregulation of death-associated protein kinase.Arterioscler Thromb Vase Biol 22:2023-2029.
[02巧]87)Woodside KJ，Hernandez A,Smith FW，Xue XY，Hu M，et al·(2003) Differential gene expression in primary and recurrent carotid stenosis.Biochem Biophys Res Commun 302:509-514.
[0280] 88)Stary HC.(2000)Na化ral History and Histological Classification of Atherosclerotic Lesions:An Update,Arterioscler Thromb Vase Biol 20:1177-1178.
[0281] 89)Stone GW，Maehara A，Lansky AJ，de Bruyne B，Cristea E，et al·(2011)A prospective natural-history study of coronary atherosclerosis.N Engl J Med 364:226-235.
[0282] 90)Cao M，Khan JA，Kang BY，Mehta 化，Hermonat PL.(2012)Dual AAV/IL-10 plus STATS anti-inflammatory gene delivery lowers atherosclerosis in LDL民 KO mice,but without increased benefit.Int J Vase Med.2012:524235.
[0283] 91)Hermonat PL,Quirk JG,Bishop BM,Han L.(1997)Packaging capacity of adeno-associated virus and the potential for wild type-plus AAV gene therapy vectors.FEBS Letters 407:78-84.
【主权项】
1. 用于治疗心血管疾病的表达载体，所述载体包含： 启动子，其包含与SEQ ID NO: 1的核苷酸序列具有大约80%至大约100%同一性的核苷 酸序列，以及 治疗基因，其在所述启动子的控制下编码对于治疗所述心血管疾病是治疗上有效的治 疗剂。2. 权利要求1所述的表达载体，其中所述启动子是疾病特异性启动子。3. 权利要求1所述的表达载体，其中所述启动子是凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1 (L0X-1)的启动子，其包含SEQ ID N0:1的核苷酸序列。4. 权利要求1所述的表达载体，其中所述治疗剂是蛋白质、微RNA或siRNA。5. 权利要求1所述的表达载体，其中所述治疗剂是白细胞介素10(IL-10)。6. 权利要求1所述的表达载体，其中所述治疗剂是由包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列的 基因编码的白细胞介素10。7. 权利要求1所述的表达载体，其中所述表达载体是腺相关病毒(AAV)载体。8. 权利要求1所述的表达载体，其中所述AAV载体包含AAV8衣壳基因。9. 权利要求8所述的表达载体，其中所述AAV8衣壳基因包含选自以下的核苷酸序列： (i)SEQ ID N0:3;(ii)SEQ ID N0:5和（iii)SEQ ID N0:7。10. 权利要求1所述的表达载体，其中所述疾病是动脉粥样硬化。11. 用于治疗心血管疾病的表达载体，所述载体包含： 凝集素样氧化低密度脂蛋白受体l(LOX-l)基因的启动子，以及 治疗基因，其在所述启动子的控制下编码对于治疗所述心血管疾病是治疗上有效的治 疗剂。12. 权利要求11所述的表达载体，其中所述启动子包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列。13. 权利要求11所述的表达载体，其中所述治疗剂是蛋白质、微RNA或s i RNA。14. 权利要求11所述的表达载体，其中所述治疗剂是白细胞介素10(IL-10)。15. 权利要求11所述的表达载体，其中所述表达载体是腺相关病毒(AAV)载体。16. 权利要求11所述的表达载体，其中所述疾病是动脉粥样硬化。17. 治疗心血管疾病的方法，其包括施用治疗有效量的表达载体的步骤，所述表达载体 包含： 启动子，其包含与SEQ ID NO: 1的核苷酸序列具有大约80%至大约100%同一性的核苷 酸序列，以及 治疗基因，其在所述启动子的控制下编码对于治疗所述心血管疾病是治疗上有效的治 疗剂。18. 权利要求17所述的方法，其中所述启动子是疾病特异性启动子。19. 权利要求17所述的方法，其中所述启动子是凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1 (L0X-1)的启动子，其包含SEQ ID N0:1的核苷酸序列。20. 权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂是蛋白质、微RNA或s i RNA。21. 权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂是白细胞介素10(IL-10)。22. 权利要求17所述的方法，其中所述表达载体是腺相关病毒(AAV)载体。23. 权利要求17所述的方法，其中所述疾病是动脉粥样硬化。
【文档编号】A61K48/00GK106029107SQ201480066787
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2014年10月7日
【发明人】M·基里瓦-因特奈提
【申请人】基罗米克有限责任公司