一种用于心脏疾病和心血管疾病检测的试剂盒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及神经调节蛋白适配子在制备检测上尿路 上皮癌试剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 神经调节蛋白（neuregulin, NRG ;heregulin, HRG),又叫神经胶质生长因子 (glial growth factor, GGF), neu 分化因子(new differentiationf actor, NDF),为 分子量在44KD左右的糖蛋白，它们在细胞间传递信号，是酪氨酸激酶受体ErbB家族的配体。 神经调节蛋白（neuregulin)是一种表皮生长因子(EGF)类的生长因子。它能激活EGF受体族 中erbB受体，并涉及到其他的一些生物反应:如刺激乳房癌细胞分化和乳蛋白的分泌;诱导 神经脊细胞分化为Schwann细胞;刺激骨胳肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细 胞成活和DNA合成。用神经调节蛋白基因严重缺陷的小鼠胚胎做的活体研究证明神经调节 蛋白对于心脏和神经发育是必需的。然而，关于神经调节蛋白如何控制细胞分化和其下游 信号途径的信息是有限的。已知神经调节蛋白家族含4个成员:NRG1，NRG2，NRG3，NRG4。 对后三者的生物学功能相对来讲知之甚少。NRG1在神经系统、心脏和乳腺中起着重要作用， 还有证据显示NRG1信号传递在其他一些器官系统的发育、功能以及人类疾病(包括精神分 裂症和乳腺癌）的发病机理中起作用。NRG1有很多异构体。对基因突变小鼠（基因敲除小鼠） 的研究说明在N末端区或表皮生长因子(EGF)类似区不同的异构体，其在体功能也不一样。
[0003] 神经调节蛋白1β为一跨膜蛋白。膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白类似区（Ig-likedomain)和EGF类似区（EGF-likedomain)，膜内部分是C末端。在细胞外基质的金属蛋白 酶作用下，神经调节蛋白的膜外部分可被酶切下来而呈游离状态，从而有利于和周围细胞 表面的ErbB受体结合，激活相应的细胞信号传递。
[0004] 神经调节蛋白对心脏的发育尤其重要。在胚胎发育早期，神经调节蛋白的表达主 要局限于心内膜，随后通过旁分泌途径释放到周围心肌细胞并与细胞膜上的蛋白酪氨酸激 酶受体ErbB4膜外部分结合，ErbB4进而与ErbB2形成异源二聚体。ErbB4/ErbB2复合物的形 成及激活对早期海绵样心脏形成小梁是必须的。神经调节蛋白、ErbB4和ErbB2三个蛋白基 因中的任何一个缺失都会使胚胎在发育早期死于子宫。在早期发育的心脏中，神经调节蛋 白和ErbB受体各自在心内膜衬里和心脏肌肉内表达，因为这二层分开很宽，神经调节蛋白 必须穿过二层细胞中的空间，再激活ErbB受体。激活这些心肌细胞中的受体对于促进肌肉 细胞生长或迀移到心内膜，从而在二层细胞中形成手指型结构是必须的。已知神经调节蛋 白可用于检测、诊断和治疗各种心血管疾病。
[0005] 因此针对神经调节蛋白的研究显得尤为重要。特别是特异性识别或者检测神经调 节蛋白。现有技术中，针对蛋白检测通常是采用抗体进行识别，但是抗体由于制备复杂，成 本高，检测复杂使得其并不适合大面积推广。核酸适配子(aptamer)是一种生物大分子的人 工单链寡核苷酸配体，通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。SELEX技术（即系统进化指数富集 技术)是20世纪90年代初研制/发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡 核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮 筛选，获得亲和力高、特异性强的核苷酸适配子(aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分 子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法 具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肤/肽库、抗体库和噬菌体表面展示 文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势:a.本身是寡核苷酸，分子量较 小，可以化学合成，节约成本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不 同部位有选择性的标记。d.重复性好，稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因 此，寡核苷酸适配子/SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX 技术是识别癌与非癌细胞间微小差异、筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。
[0006] 核酸适配子筛选的基本步骤如下：设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与 靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗 脱寡核酸，以洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始 下一轮筛选;重复数轮孵育-洗脱-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将从 文库中筛选出来并被指数富集;对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及 两端序列与文库相符者即为核酸适配子;测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和 力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种DNA适配子，能够特异性结合神经调节蛋白蛋白，可以来 实现心脏病和心血管疾病的检测。
[0008] 本发明采用以下技术方案： 体外合成一个含有39个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链DNA适配子 随机文库;采用NRG蛋白为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的表面抗原特异性DNA 适配子;通过结构预测软件RNA Structure Program分析预测适配子的二级结构;通过膜结 合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了多个与表 面抗原亲和力高、特异性强的适配子。所述的适配子都能形成各自的特异茎环结构。所述适 配子能特异性、高亲和力地结合NRG蛋白。所述适配子序列如下：
这些序列分别序列表的SEQ ID NO: 1-55所示。
[0009] 本发明的有益效果：（1)获得了一种能够特异高效结合NRG蛋白的适配子。该适配 子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。（2)以核酸适配子为基础可以制备成为特异性 结合NRG蛋白的药物。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 NRG蛋白特异性结合DNA适配子的SELEX筛选 根据人NPG蛋白的序列，Genbank: NP_039250，设计相应的引物，以人基因组DNA作为模 板，通过常规的PCR，扩增得到相应的目的基因，经鉴定，产物大小为1900bp左右。选用 PET22b作为表达质粒，用氯化钙沉淀法将人神经调节蛋白基因克隆至PET22b表达质粒中， 构建成重组人神经调节蛋白表达质粒(PET22b-人神经调节蛋白），此蛋白在T7启动子的驱 动下，尚效表达。表达基因 N端从Ndel位点插入，C端有终止子紧接在最后个氣基酸处，所 得蛋白不与任何氨基酸形成融合蛋白。经酶切切出约1900bp的正确片段。转化子经酶切鉴 定后，提取双链DNA进行核甘酸序列测定。结果证实，表达载体上的人神经调节蛋白序列完 全正确。取经PCR和酶切鉴定的工程菌克隆(BL21-PET22b_A神经调节蛋白），随机挑选一系 列单菌落接种于2mlLB-Amp液体培养基，置37°C、250rpm培养过夜，然后按一定比例接种于 20ml LB-Amp培养液中，37°C培养至0D达1. 0时加入IPTG诱导4h，收集菌体。破菌后收集包 涵体，15% SDS-PAGE电泳、薄层扫描分析、Western-blotting鉴定，经反复筛选获得一株稳定 高表达目的蛋白神经调节蛋白的工程菌(BL21-PET22b-人神经调节蛋白）。该菌株表达的目 的蛋白占菌体总蛋白的10%左右。经尚压勾楽破菌后，获得了相应的目的蛋白。
[0011] 化学合成初始寡核苷酸随机文库及引物，序列如下：（5 7 -CATGACCTTGGACAAGTCAGC--N39--TTGACAGTGATATGGTCAC-3')，其中N39为40个随机寡核 苷酸； 引物P1: CATGACCTTGGACAAGTCAGC; 引物 P2: GTGACCATAGCACTGTCAA。
[0012] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。80 μ g RNA文库 经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与3ug NPG蛋白37°C孵育40min，反应 液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L尿素，0. 7mol/L醋酸铵，1.6mmol/L EDTA，0. 15% SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20 μ 1 DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文 库用于下一轮筛选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转 录出RNA适配子库，筛选共进行15轮。
[0013] 实施例2特异性高亲和力的NPG结合适配子的获得 将DNA适配子分别取1.5yg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 37°C消化lh，纯化回收去磷酸 化的DNA ;通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放 射性标记的RNA适配子分别与不同浓度（1-200ηΜ)的NPG蛋白37°C孵育30min，各组反应液 经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样 品平行做两次测定。计算各个适配子与NPG蛋白的解离常数。结果如下：
实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析 从以上结果可以看出，本发明的55个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中也没 有所述结合特性的适配子能够结合NPG蛋白。
[00M]分别采用人血白蛋白，人IgG抗体，ErbB4蛋白，H-FABP蛋白分别与55条适配子进行 特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与NPG蛋白结合 保持较高的特异性。
[0015]实施例4降解活性分析 将所述的适配子，取〇.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置四周。通过RT-PCR检 测，发现四周的放置所有55个适配子其结构稳定，没有被降解。比现有技术的适配子都具有 更长的稳定性。
【主权项】
1. 一种检测心脏疾病和心血管疾病的试剂盒，其特征在于:包括特异性识别特异性NPG 蛋白的适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述适体序列为包括SEQ ID No. 1-55任一 条序列所示。3. 序列为SEQ ID No. 1-55任一条所示的适体在制备检测NPG蛋白的试剂盒中的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种用于心脏疾病和心血管疾病检测的试剂盒及其用途，其包含的适体具有较强的结合特性和稳定性；该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以NPG蛋白为靶蛋白，从单链DNA随机文库中筛选出了能与NPG蛋白特异性结合的DNA适配子。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105572385
【申请号】CN201610043558
【发明人】查文娟
【申请人】查文娟
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月24日