心血管病治疗的制作方法

专利名称：心血管病治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗受损的血管和心脏功能的方法和药剂。本发明还 提供用于治疗各种与血管功能障碍和心功能障碍相关的生理学和病理学表 现的方法和药剂。
背景技术：
糖尿病血管并发症具有破坏性，可以影响每一个主要器官。糖尿病患 者有更高的动脉粥样硬化、心血管、外周血管以及脑血管疾病发病率。血 管并发症和血管病是大多数糖尿病人的死亡和发病的主要原因。很多因素导致在糖尿病患者中发生血管病，包括高血糖、高血压、肥 胖和血脂异常。例如，增高的血糖水平(即高血糖)被认为是微血管并发症 (包括视网膜病变、肾病和神经病)的主要原因，亦被认为与过早和加速发 展的大血管并发症(如心血管疾病及外周血管疾病)有关。增高的血糖水平 和氧化应激作为糖尿病微环境的特征，都会加速晚期糖基化终产物(AGE) 的形成。高血糖和AGE可引起内皮的正常结构和功能的变化(如损伤)， 并能导致内皮功能障碍。此外，高血糖和AGE与各种血管并发症(包括对 人体的微血管系统及大血管系统的损伤)相关。再者，高血糖和血脂异常 与内膜中层厚度相关，内膜中层厚度是公认的心血管和脑血管疾病的标 记。糖尿病心血管并发症是严重的，并且是该病发病率和死亡率的主要原因。这些并发症包括冠心病(CHD)、充血性心力衰竭、中风、外周动脉疾 病、心肌病、肾病、视网膜病变和神经病。血管病在糖尿病患者中可以与其它并发症(例如糖尿病肾病)一并发 生，糖尿性肾病是一种常见且通常很严重的病症。心血管疾病是患有终末 期肾病(ESRD)的糖尿病患者的主要死因(McMillan et al. (1990) BMJ 301:540-544; Hirschl et al. (1992) Am J KidneyDis, 20:564-568和Rischen-Vos et al, (1992) Nephrol Dial Transplant 7:433-437.)。糖尿病患者有严重的充血性心力衰竭风险。若干因素促成糖尿病性心 肌病的高发病率，包括长期高血压、慢性高血糖、严重的冠状动脉粥样硬 化等。糖尿病患者与无糖尿病的患者相比较，中风导致的死亡率增加接近 3倍(Stamleretal. (1993) Z)/W"esO^ 16:434-444.)。此外，糖尿病会增加 严重颈动脉粥样硬化的可能性(Folsom et al. (1994) Stroke 16:434-444.及 O，Leary et al.(1992) Stroke 25:66-73.)。糖尿病患者患外周血管疾病(PVD)的发病率比无糖尿病的患者高大约 4 f咅(参见，例如H.E. Lebovitz, ed., Therapy for diabetes mellitus (3rd edition): pp.290画302.中的Gibbons (1998) Peripheral vascular disease)。外周血管疾病 是由于动脉粥样硬化导致腿部动脉，有时导致臂部动脉变窄的病症。它导 致下肢溃疡、伤口愈合不良及抵御感染的能力降低。其原因包括延迟或阻 止将氧(局部缺血)、营养素和抗生素运送到受感染的区域，以及免疫应答 受损(参见前述Gibbons)。其它与糖尿病相关的病症，如高血压、肥胖和 血脂异常会进一步增加糖尿病患者发生PVD的机会。目前以治疗或减少糖尿病血管并发症的进展和严重性或以预防所述并 发症的发生为目标的治疗策略运用了多种方法，包括优化血糖控制(通过 改变饮食和/或胰岛素治疗)、高血压控制(包括施予血管紧张素转换酶 (ACE )抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂(ARB)以降低高血压)、降胆固醇 治疗等。但是，所述疗法并非普遍成功，而且往往在逆转与糖尿病相关的 血管并发症及病状(例如，损伤)或在改善受影响血管、器官及组织的功能 方面是无效的。再者，由于例如人口老龄化，以及肥胖和静坐式生活方式 在美国和全球人口中流行性增加等因素，全世界的糖尿病流行性都在增 加。因此，糖尿病是血管病的一个全球性的主要风险因素。因此，在所述 技术领域中有对治疗糖尿病血管并发症的方法的需求，也有对减少这些血 管并发症的进展和严重性的方法的需求，以及对预防这些并发症的发生的 方法的需求。此外，在所述技术领域中对有效逆转与糖尿病相关的血管并 发症的方法和药剂也有需求，包括逆转病状及对血管的损伤，并改善受与 糖尿病相关的血管并发症影响的血管、器官和组织的功能。本发明首次证实在糖尿病动物模型中，对CTGF的特异性抑制既 能减轻血管功能障碍又能显著地改善血管功能，从而可以满足上述需要。 特别地，本发明证实在糖尿病动物模型中施用抗CTGF抗体能有效地减轻 血管硬度、血管通透性、外渗(例如水肿)及血管钙化。本发明的方法和药 剂也可有效地逆转与糖尿病相关的病状及对血管的损伤。本发明还证实对CTGF的特异性抑制可改善心脏功能。特别地，本发 明证实施用抗CTGF抗体可显著改善心脏功能，这通过以下参数的改善得 以证实心室舒张、心室收縮、舒张末压、舒张末容积、射血分数、动脉 弹性、每搏输出量和心输出量。


图1显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地提高心射血 分数。图2显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地降低左心室 舒张末压。图3显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地提高心肌收 縮力。图4显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地改善心室舒张。图5显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地减轻颈动脉 轴向硬化。图6显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地减轻颈动脉 周向硬化。图7显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地减轻和逆转卜、胞FF 、r^ +口 A^rViXTS^+tfa/^r+irfnTi^YI/巧"3^j^ [Aj/m:a:口'j工j/^^yj/w^寸m i"j y又Tu。图8显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地减轻和逆转 与糖尿病相关的颈动脉周向硬化。图9显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地逆转体内轴 向拉伸率的降低。图10显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地逆转大动 脉环张开角的增加。图11显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地减轻血管 外水肿。图12显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地降低血管 通透性。图13显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地减少和逆 转与糖尿病相关的血管通透性及血管外水肿。图14显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地减轻血管 钙化。图15显示了本发明的方法和药剂在糖尿病动物模型中有效地减少心 脏重量。图16显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地條低心脏 重量与体重的比率。
图17显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地降低血液 中低密度脂蛋白(LDL)水平。
图18显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地降低血液 中HbAlc水平。
图19显示了本发明的方法和药剂在哺乳动物对象中有效地降低血液 中HbAlc水平。
图20显示了在哺乳动物对象中抗-CTGF抗体结合血管紧张素受体阻 滞剂(ARB)疗法增加了血液中高密度脂蛋白(HDL)水平。
发明概述
本发明提供用于改善对象的心脏功能的方法，所述方法包括给所述对 象施用有效量的抗CTGF试剂，从而改善对象的心脏功能。
在各实施方式中，所述对象是患有糖尿病或有具有患糖尿病的风险的 对象。
在一些实施方式中，本发明的方法特别可用于提高射血分数、增加每 搏输出量、增加心输出量、改善心室舒张、改善心室收縮力、增加舒张末 压、或增加舒张末容积。
本发明的方法可特别用于治疗或预防心脏并发症。例如，心脏并发症 可选自心脏肥大、充血性心力衰竭或心肌病。在特定的实施方式中，所述 方法通过降低血液中低密度脂蛋白(LDL)水平治疗或预防心脏并发症。
所述方法的对象可以是哺乳动物对象。特别地，所述对象可以是人。
用于本发明的方法中的抗CTGF试剂可以例如是多肽、多核苷酸或小 分子。特别地，所述抗CTGF试剂可以是与CTGF结合的抗体或其片段、 反义分子、siRNA、或小分子化合物。在特定的实施方式中，所述抗 CTGF试剂是针对CTGF的单克隆抗体或其片段。在其它特定的实施方式 中，所述抗CTGF试剂是在WO 2004/108764中描述的CLN-1或其片段。
发明详述
应当理解，本发明不限于本申请中所描述的特定的方法、方案、细胞 系、测定和试剂，因为它们可以发生改变。也应理解本申请所用术语意在 描述本发明的特定实施方式，而不是为了限制如权利要求书所示的本发明 的范围。
必须注意，除非上下文有清楚指示，否则本申请和权利要求书中所用 的单数形式"一种"和"所述"包括复数形式。因此，例如"一种片段" 包括了众多这类片段， 一种"抗体"指一或多个抗体及本领域技术人员己 知的该抗体的等价物，等等。
除非另有说明，本申请中所使用的所有技术和科学术语具有本发明所 属领域普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管与本申请中描述的方法 和材料类似或等价的任何方法和材料均可在实施和测试本发明中使用，但 是在本申请中描述的是优选的方法、装置和材料。本申请引用的所有出版 物以其全文引入本申请作为参考，其目的是描述和公开出版物中报道的可 用于本发明的方法、试剂和手段。本申请中的任何内容均不应被视为承认 本发明不先于根据在先发明的这种公开。
除非特别指明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、 细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学领域中的常规方法。这些技术在文
献中有充分解释。参见，例如Gennaro， A.R.， ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed" Mack Publishing Co.; Colowick, S. et al.， eds.， Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell， eds.， 1986， Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel， F.M. et al.， eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al.， eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, AcademicPress); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds.， 1997， Springer Verlag)。
本发明部分涉及一项发现，所述发现指结缔组织生长因子(CTGF)在 心血管疾病，包括血管功能受损(即血管功能障碍)和心脏功能受损(即心 功能障碍)的特定方面，发挥关键作用。
本发明部分基于发现CTGF的抑制在治疗血管功能障碍和心功能障碍 的多个具体方面有意料不到的好处。本发明提供的数据证实，CTGF的抑 制减少了以前认为与CTGF无关的各种心血管疾病的病状。在某些方面， 本发明提供的证据表明，通过抑制CTGF提供了一种用以治疗或预防血管 功能障碍和心功能障碍的特定的生理和病理状况的治疗方法。
本发明提供用于减少、改善或逆转对象中与多种不同的病理过程相关 的并发症的方法和药剂，所述多种不同的病理过程与受损的血管功能和受 损的心脏功能相关。在一些实施方式中，所述对象是动物，优化地是哺乳 动物，最优化地是人。
本发明还提供用于本发明的方法的药剂。所述药剂可包括小分子化合 物、肽和蛋白质(包括抗体或其功能活性片段)、及多核苷酸(包括小干扰 核糖核酸(siRNA)、小RNA (miRNA)、核酶及反义序列)。(参见，例如 Zeng (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:9779-9784;及Kurreck (2003) Eur J Biochem 270:1628-1644.)
受损的血管功能(例如，血管功能障碍)可由各种异常所导致，包括例 如血管系统的结构和/或功能受到干扰或损伤。受损的血管功能与血管的 各种病变和损伤相关，造成有害的变化，并导致例如动脉硬化、血管通透 和血管钙化。
动脉硬度包括例如血管膨胀性、顺应性和弹性模量等特性，并己被证 明能很好地预测冠心病和心血管疾病死亡率(参见，例如O'Rourke et al
(2002) Am J Hypertens 15:426-444; Boutouyrie et al (2002) Hypertension 39:10-15; Blaeher et al (1999) Circulation 99:2434-2439)。 一般而言，动脉 硬度增加可导致收縮压增加、心室质量增加及舒张期冠脉灌注降低。动脉 硬度增加亦与下肢动脉流量减少相关(参见，例如Suzuki et al (2001) Diabetes Care 24:2107-2114)。
动脉硬度增加(即动脉硬化)与包括糖尿病和慢性肾病在内的许多疾病 状态相关，同时也是衰老过程的标志。动脉硬化在糖尿病或代谢综合征患 者中特别受关注，在这些疾病中，动脉硬化在所有年龄组一致出现。动脉 硬化也是患心血管疾病风险增加的标记，所述心血管疾病包括例如心肌梗 死、心力衰竭、总死亡率、中风、痴呆和肾病。
动脉硬化与对血管和心脏的结构和功能的有害作用相关。在动脉中， 动脉硬化影响机械性血管刺激的变化，导致内皮功能障碍及血管病。在心 脏中，动脉硬化影响心室工作负荷、心脏射血效率及心脏本身的灌注。
动脉硬化的临床替代终点标记包括单纯收縮期高血压和脉压增大。脉 压差是收縮压和舒张压之间的差。动脉硬化与脉压增大相关。脉压增大到 高于正常值指示存在动脉硬化。脉搏波速度(PWV)测量也可评估动脉硬 度(参见，例如Lehman etal (1992) Diabetic Med 9:114-119.)。脉搏波速度 是心室射血压力波离开心脏沿动脉前进的速度。脉搏波沿动脉前进速度依 该动脉的硬度而定。测量脉搏波速度通常在颈动脉和股动脉之间进行。慢 波速表示动脉有可塑性，而快波速表示动脉硬化；因此，脉搏波速度越 高，血管壁的刚度和硬度越高而膨胀性越低(参见，例如Nichols and O'Rourke in McDonald's blood flow in arteries. Theoretical, experimental and clinical principles. Fourth Edition, London, Sydney, Auckland: Arnold E. 1998.)。这些方法及其它用于测定动脉硬度的方法在本技术领域是众所周 知的并是本领域技术人员随时可得到的。
血管钙化(包括冠状动脉钙化、瓣膜钙化、主动脉钙化及动脉钙化)对 血管功能和心脏功能有直接影响。血管钙化与大血管(例如主动脉和颈总
动脉)的壁的硬化和膨胀相关，并通过削弱血管的收縮和舒张而影响血管 功能。血管钙化是冠状动脉疾病和血管病已确定的指标，在心血管疾病 (包括血管功能受损和心脏功能受损)的发生和发病机制中占重要角色，因而与较高风险的心肌梗死和死亡相关(参见，例如Doherty et al (2004) Endocr Rev 25:629-627.)。血管钙化在动脉内膜和动脉中膜中均可发生。本发明提供可用于治疗受损的血管功能的方法和药剂。在各实施方式 中，本发明的方法和药剂可用于治疗受损的血管功能，其中所述受损的血 管功能是动脉硬化、血管通透性、外渗及血管钙化。在某些方面，本发明涉及用于在患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的 对象中减轻血管功能障碍和改善血管功能的方法。此外，本发明涉及用于 在患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象中逆转与糖尿病或升高的血糖 水平相关的血管并发症、病状或损伤的方法。在以下说明的各方法的优选 实施方式中，优选的对象是人。本发明提供了一种用于在患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象中 减轻血管功能障碍的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的抗 CTGF齐IJ，从而减轻对象的血管功能障碍。术语"抗CTGF剂"在本申请 中是指任何抑制CTGF的表达或活性的药剂。本发明亦提供了一种在患有 糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象中改善血管功能的方法，所述方法包 括给所述对象施用有效量的抗CTGF剂，从而改善血管功能。本发明提供了一种用于在患有与糖尿病相关的血管并发症或具有患与 糖尿病相关的血管并发症的风险的对象中逆转血管并发症、病状或损伤的 方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的抗CTGF剂，从而逆转所述 对象的血管并发症、病状或损伤。由于本申请所描述的有些方法涉及患有糖尿病或具有患糖尿病的风险 的对象，在判定所述对象是否患有糖尿病或具有患糖尿病的风险时，可以 使用本领域技述人员所接受和使用的任何方法。例如，血糖水平在约 200mg/dL以上的人(通过例如空腹血糖试验、口服葡萄糖耐量试验或随机
血糖试验确定)可被视为患有糖尿病的对象。因此，从某种意义上讲，血糖水平在约200mg/dL以上的人是适于用本发明所提供的方法或药物的使 用进行治疗的对象。可以通过评估一或多个己知与糖尿病发生风险增加有 关的因素鉴定具有患糖尿病的风险的对象(例如具有患糖尿病的风险的 人)，所述因素包括家族中有糖尿病的家族史、某些人种群或种族群体、 妊娠糖尿病病史、肥胖(尤其是高水平的内脏或腹部脂肪)、静坐式生活方 式、年龄、高血压及精神分裂症等，还包括葡萄糖代谢改变(包括葡萄糖 耐量降低(IGT)或糖尿病前期)。在本发明的方法的各实施方式中，所述血管功能障碍是微血管功能障 碍或大血管功能障碍。在某些实施方式中，所述功能障碍是心血管功能障 碍，或脑血管功能障碍，或与肾病、视网膜病变或神经病相关的血管功能 障碍。在一个特定的实施方式中，所述功能障碍是心室功能障碍，优选左 心室功能障碍。在一个实施方式中，所述功能障碍是外周血管功能障碍。本发明亦包括改善血管功能的方法。 一方面，本发明提供了用于在患 有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象中改善血管功能的方法，所述方法 包括给所述对象施用有效量的抗CTGF齐U，从而改善所述对象的血管功 能。在本发明的各方面，所述血管功能是微血管功能或大血管功能。在某 些实施方式中，所述血管功能是心血管功能或脑血管功能，或是与肾病、 视网膜病变或神经病相关的血管功能。在某方面所述功能是心室功能，优 选左心室功能。 一方面，所述血管功能与外周血管相关。本发明进一步包括用于在患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象中 减轻内皮功能障碍的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的抗 CTGF齐U，从而减轻所述对象的内皮功能障碍。本发明亦提供在患有糖尿 病或具有患糖尿病的风险的对象中改善内皮功能的方法，所述方法包括给 所述对象施用有效量的抗CTGF剂，从而改善内皮功能。特别地，本发明 涉及逆转内皮功能障碍的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病或具有患 糖尿病的风险的对象中与糖尿病相关的血管并发症的方法，所述方法包括给所述对象施用抗CTGF剂，从而治疗所述血管并发症。抗CTGF剂是任 何抑制CTGF的活性和/或表达的药剂。本发明亦提供了在患有糖尿病或 具有患糖尿病的风险的对象中减缓血管并发症的进程或减轻其严重性的方 法，所述方法包括给所述对象施用有效量的抗CTGF剂，从而减缓所述血 管并发症的进程或减轻其严重性。本发明进一步提供预防或减慢患有糖尿 病或具有患糖尿病的风险的对象中的血管并发症的发生的方法，所述方法 包括给所述对象施用有效量的抗CTGF齐U，从而预防或减慢血管并发症的 发生。在另一个实施方式中，本发明提供了用于逆转患有与糖尿病有关的 血管并发症、病状或损伤的对象或具有患与糖尿病有关的血管并发症、病 状或损伤的风险的对象中与糖尿病有关的血管并发症、病状或损伤的方 法，所述方法包括给所述对象施用有效量的抗CTGF剂，从而逆转所述对 象中与糖尿病有关的血管并发症、病状或损伤。在某些实施方式中，所述血管并发症是大血管并发症；在其它实施方 式中是微血管并发症。在各实施方式中，所述并发症选自心脏病、肾病、 神经病及视网膜病变。在一个实施方式中，所述并发症是心血管并发症或 脑血管并发症。在另一个实施方式中，所述并发症是外周血管并发症。本发明还提供了用于治疗动脉硬化的方法，所述方法包括给患有糖尿 病或具有患糖尿病的风险的对象施用有效量的抗CTGF齐!J，从而治疗动脉 硬化。在各方面，所述动脉硬化选自轴向、径向和周向动脉硬化。本发明 包括减少血管通透性、减少外渗(例如水肿或组织水肿)、减轻内膜中层增 厚和减轻颈总动脉内膜中层增厚的方法。在每种情形中，所述方法包括给 患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象施用有效量的抗CTGF齐!j，从而 达到所述预期效果，例如分别为减少血管通透性、减少外渗(例如水肿或 组织水肿)、减轻内膜中层增厚和减轻颈总动脉内膜中层增厚。一方面，本发明涉及用于减轻患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对
象中的血管损伤或功能障碍的方法，所述方法包括给患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象施用有效量的抗CTGF剂，从而减轻所述对象的血管 损伤或功能障碍。在各方面，所述血管可能是大血管系统中的血管，例如 主动脉、冠状动脉、颈动脉、脑动脉血管、肾动脉、髂动脉、股动脉和胭 动脉等主要血管；或可能是微血管系统中的血管，例如视网膜小动脉、肾 小球小动脉、神经滋养血管、心脏小动脉、以及与眼、肾、心脏以及中枢 和外周神经系统相关的毛细血管床等的小血管。一方面，本发明提供了用于减少对象中的血管钙化的方法，所述方法 包括给所述对象施用有效量的抗CTGF剂，从而减少所述对象的血管钙 化。在某种意义上，如在前述方法中一样，所述对象是患有糖尿病或具有 患糖尿病的风险的对象。在一个优选的实施方式中，所述对象是哺乳动物，在最优选的实施方 式中，所述对象是人。在某些实施方式中，所述对象是患有糖尿病或具有 患糖尿病的风险的对象。心脏功能受损(例如心功能障碍)及心脏病可来自各种异常，包括例如 心脏和心肌的收縮和/或舒张受到干扰或损害。从临床角度来看，心脏功 能受损可视为任何心脏功能异常的状态，所述状态导致心脏泵血的速度不 能与组织代谢的要求相称和/或必须以异常偏高的心室舒张期容积才能使 其相称。心脏功能受损(例如心功能障碍、心力衰竭)可能是心脏收縮功能 障碍或心脏舒张功能障碍(又分别称为收縮性心力衰竭和舒张性心力衰 竭)。在心脏收縮功能障碍中，主要的异常是心室不能正常收縮及排出充足 的血液。心脏收縮功能障碍与心肌收縮力受损相关，心肌收縮力受损引起 心脏收縮减弱，因而导致每搏输出量和心输出量减少、心室排空不足、心 脏扩大以及常见的心室舒张压升高。成年人的心脏收縮功能障碍被定义为
左心室射血分数低于45%。在心脏舒张功能障碍中，主要的异常是心室不 能正常舒张和/或充盈。与舒张性心力衰竭相关的心室舒张和充盈受损会 导致在任何舒张期容积心室舒张压都升高。许多心脏功能受损患者的心室 收縮和心室舒张都呈现异常。有数种技术可让本领域技术人员得以在对象中鉴定、诊断或评估心脏 功能受损。 一般来说，这些技术包括例如心电图、超声心动图显像、心导 管插入术、血管造影术、和心脏核成像技术(包括放射性核素血管显像 术)。在某些情况中，当所述对象处于静止且心室舒张末期压正常或升高 时，在存在心功能障碍或心力衰竭的情况下可能呈现心输出量和每搏输出 量降低。在许多情况中，心脏功能在静止时可能足够而在作用时不足。通常通过测定射血分数评估心脏功能，即测定每次搏动过程中心脏泵 血的分数。射血分数是每搏输出量与舒张末期容积的比率，计算方法是从 心室射出的血液体积(称为每搏输出量，SV)除以心室充盈后的血液体积 (舒张末期容积，EDV)。成人对象射血分数的正常值是50-70%。心脏损伤 会损害心脏有效射血的能力，因而降低射血分数。射血分数将低在临床上 可表现为心功能障碍或心力衰竭。射血分数是与心功能障碍相关的预后最 重要的预测指标之一；典型地，射血分数降低的对象预后不良。射血分数通常以超声心动图显像进行测量，其中在心动周期中测量心 腔(例如心室)的容积。射血分数也可以用心脏MRI、快速扫描心脏轴向 断层扫描(CT)成像、心室造影术、门控SPECT、和放射性对照血管造影 术或放射性核素血管造影术来测量。正常左心室每搏射出其舒张末期容积的50-80%，即其射血分数为 0.50至0.80。在成年人中，左心室容积正常值如下舒张末期容积是 72士15mL/m、平均值士标准差)，收縮末期容积是20±8mL/m2。本发明还包括其他的方法，包括分别改善心脏功能、改善心室舒张、 增加心室收縮力、增加舒张末压、增加舒张末期容积、提高射血分数、提
高动脉弹性、增加每搏输出量及增加心输出量的方法。这些方法中的每一 种都包括给患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的对象施用有效量的抗CTGF齐!J，从而达到所期望的效果，例如分别在所述对象中改善心脏功 能、改善心室舒张、增加心室收縮力、增加舒张末压、期舒张末期容积、 提高射血分数、提高动脉弹性、增加每搏输出量及增加心输出量。在一个实施方式中，本发明提供了一种用于治疗或预防心脏并发症的 方法，所述方法包括给对象施用抗CTGF剂，从而治疗或预防心脏并发 症。在某些实施方式中，所述对象是患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的 对象。所述方法尤其是可用于治疗或预防选自于心脏肥大、充血性心力衰 竭和心肌病的心脏并发症。本发明的方法也可以通过降低血液中LDL水 平而治疗或预防心脏并发症。在一个优选的实施方式中，所述对象是哺乳动物，在最优选的实施方 式中，所述对象是人。在某些实施方式中，所述对象是患有糖尿病或具有 患糖尿病的风险的对象。在上文所描述的任何一种方法中，所述抗CTGF剂特别地可以是多 肽、多核苷酸或小分子，例如与CTGF结合的抗体、反义分子、siRNA及 小分子化合物等。特别地，抑制CTGF可以通过本技术领域内任何众所周 知的调节CTGF的表达和活性的方法而实现。优选的方法是使用抗CTGF 剂，例如针对CTGF的人单克隆抗体，然而任何抑制编码CTGF的基因的 表达的方法、抑制CTGF的产生的方法或抑制CTGF活性的方法也可用于 本发明。本发明所述方法中使用的示例性抗体在例如US5，408,040 、 WO99/07407、 W099/33878及WO00/35936中有描述。本发明所述方法中 使用的一个示例性抗体在WO2004/10874中有描述，通过引用将该文献全 文并入本申请。所述抗体或其片段可通过本领域技术人员熟悉的各种手段
施用。例如经常是通过静脉注射、腹膜内注射或皮下注射来注射抗体。本发明也描述了 CTGF表达和/或活性的小分子抑制剂；例如 W096/38172确认例如霍乱毒素和8Br-cAMP之类的cAMP调节物为 CTGF表达的抑制剂。因此，被确定为例如前列腺素和/或前列腺环素类似 物如Iloprost的化合物(参见，例如WO 00/02450; Ricupero et al. (1999) Am J Physiol 277:L1165-1171 ;也参见Ertl et al. (1992) Am Rev Respir Dis 145: A19)和潜在的磷酸二酯酶IV抑制剂(参见，例如Kohyama et al. (2002) Am J Respir Cell Mol Biol 26:694-701)，都可用于调节CTGF的表达。此 外，丝氨酸/苏氨酸促分裂原活化蛋白激酶抑制剂(尤其是p38)、细胞周期 蛋白依赖激酶(例如CDK2)、糖原合酶激酶(GSK)-3也可能与CTGF表达 的降低有关(参见例如，Matsuoka et al. (2002) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 283:L103-L112; Yosimichi et al. (2001) Eur J Biochem 268:6058-6065; WO 01/38532和WO 03/092584)。这些化合物可按本技术领域内既定程序 制备和施用。此外，多核苷酸包括小干扰核糖核酸(siRNA)、微核糖核酸 (miRNA)、核酶及反义序列，可用于本发明的方法中用以抑制CTGF的表 达禾口/或产生(参见例如Kondo et al. (2000) Biochem Biophys Res Commun 278:119-124.)。这些技术在相关领域技术人员中是众所周知的。靶向 CTGF表达的反义构建体已被描述并被用以降低不同类型细胞中CTGF表 达(参见例如WO 96/38172;WO 00/27868;WO 00/35936;WO 03/053340; Kothapalli et al. (1997) Cell Growth Differ 8(l):61-68; Shimo et al. (1998) J Biochem (Tokyo) 124(1 ):130-140;及Uchio et al. (2004) Wound Repair Regen 12:60-66.)。这种反义构建体可以用来降低CTGF的表达，从而减轻或预防 CTGF诱导的病理过程。这种构建体可以用适当的载体和表达调节物进行 设计用于细胞特异性或组织特异性表达以及组成型或诱导型表达。这种遗 传构建体可按本技术领域内既定程序制备和施用。因此，在本发明某些实施方式中，所述抗CTGF剂是CTGF抗体。在 一个优选实施方式中，所述抗体是CTGF单克隆抗体。在另一个优选实施 方式中，所述抗体是人或人源化CTGF抗体。在一个特定的实施方式中， 所述抗体是如在WO 2004/108764中所记载的CLN-1 。在另一实施方式 中，所述药剂是小分子。在另一实施方式中，所述药剂是核酸。在进一步 的实施方式中，所述核酸选自环状核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。在特定 的实施方式中，所述药剂是反义寡核苷酸或siRNA。本发明涉及本发明的方法结合其它疗法的应用。在一个实施方式中， 所述方法与另一疗法联合使用，例如用以进一步增强对某些病理状态的疗 效。两种治疗可同时实施或相继实施，例如在一个治疗时程期间，或是在 病情恶化和缓解之后。在另一实施方式中，所述方法与其它具有相似或不 同的作用模式的治疗方法(例如ACE抑制齐lj、 ARB、抑制素、高级糖基化 终产物(AGE)抑制剂等)联合使用。本领域技术人员熟悉治疗血管并发症 和血管病现有的治疗方法，包括例如ACE抑制剂、血管紧张素受体阻滞 剂、抑制素、高级糖基化终产物抑制剂、钙通道阻滞剂等。特别地，上述 任何治疗剂与本发明所述方法联合使用。已证明缓激肽可以调节CTGF表达，而缓激肽Bl受体拮抗剂降低糖 尿病动物的血管通透性(参见例如Ricupero et al. (2000) J Biol Chem 275:12475-12480; Lawson et al. (2005) Regul Pept 124:221-224; Tan et al. (2005) Am J Physiol Renal Physiol 288:F483-F492; Wilkinson-Berka and Fletcher (2004) Curr Pharm Des 10:3313-3330.)。因此，在某种意义上，本 发明提供了用于调节激肽释放酶-激肽(kallikrien-kinin系统的方法和药 剂，以调节CTGF介导的血管并发症，例如血管通透性和外渗。特别地， 单独使用调节激肽放酶-激肽系统的药剂和方法，或与抑制CTGF的药剂 和方法联合使用。激鄉方赠凝径正如本技术领域所熟悉，本发明的组合物可直接施用或于含赋形剂的 药物组合物中施用。本发明的治疗方法可包括给患有血管功能障碍或心功 能障碍(即血管功能受损或心脏功能受损)或具有患血管功能障碍或心功能 障碍的风险的对象施用有效量的本发明的化合物。在一个优选的实施方式 中，所述对象是哺乳动物，在最优选的实施方式中，所述对象是人。通过常规试验可容易地以确定化合物或药物的有效量(即，剂量)、有 效而方便的给药途径和适当的配方。现有技术中提供了各种配方和药物输送系统(参见例如上述Gennaro， ed. (2000) Remington's Pharmaceutical Sciences;及上述 Hardman, Limbird， and Gilman， eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics.)。合适的给药途径可以包括例如经口腔、直肠、局部、鼻、肺、眼、肠 内及肠胃外给药。主要的肠胃外给药途径包括静脉注射、肌肉注射及皮下 注射。次要的给药途径包括腹膜内、动脉内、关节内、心内、脑池内、皮 内、病灶内、眼内、胸膜内、鞘内、子宫内及心室内给药。待使用的配方 类型和给药途径以及是否优选局部给药或全身给药，根据待治疗的指征与 及药物的物理、化学和生物学特性而定。本发明化合物的药物剂型，可以以瞬间释放、控释、缓释或靶向给药 等系统提供。常用的剂型包括例如溶液和悬浮液、(微)乳剂、软膏、凝胶 和贴剂、脂质体、片剂、糖衣片、软或硬胶囊、栓剂、胚珠(ovule)、埋植 剂、无定形或结晶粉末、气雾剂和冻干制剂。根据所用的给药途径，可能 需用特定设备来施用所述药物，例如针筒和针头、吸入器、泵、注射笔、 涂药器或专用烧瓶。药物剂型往往由药物、 一或多种赋形剂和容器/封闭 系统所组成。可将一或多种赋形剂(也称作惰性成分)添加到本发明的化合 物中，令所述药物的生产、稳定性、给药和安全性得以改善或促进，并提 供获得所需的药物释放模式的手段。因此，待添加到药物中的赋形剂的类 型可取决于多种因素，例如药物的物理和化学特性、给药途径以及制造过 程。在本技术领域中，包括在各药典中，提供了制药学上可接受的赋形剂 (参见例如USP, JP， EP及BP, FDA网页(www.fda.gov), Inactive Ingredient Guide 1996及Handbook of Pharmaceutical Additives, ed. Ash; Synapse Information Resources, Inc. 2002.)。本发明化合物的药物剂型可以本技术领域中任何熟知的方法制成，例 如传统的混合、筛分、溶解、熔化、造粒、造糖衣片、压片、悬浮、挤 压、喷雾干燥、研磨、乳化、(纳/微)胶囊化、包埋或冷冻干燥方法。如上 所述，本发明的组合物可包括一或多个生理学上可接受的惰性成分，所述 惰性成分可促进活跃分子形成药用制剂的过程。适当的配方取决于所需的给药途经。例如在静脉注射时，所述组合物 可配制在水溶液中，如有必要可用生理学上相容的缓冲液(包括例如磷酸 盐、组氨酸或柠檬酸盐缓冲液)以调整配方的pH值，及张度剂(例如氯化 钠或葡萄糖)。在经粘膜或鼻腔给药时，优选半固态剂型、液态剂型或贴 剂，并可能含有穿透促进剂。这样的穿透剂在本技术领域是广为人知的。 在口服给药中，所述化合物可以配制成液体或固体剂型，制成瞬间释放剂 型、控释剂型或缓释剂型。合适的口服剂型包括片剂、丸剂、糖衣片、软 胶囊和硬胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液和乳剂。所述化合物也 可配制为直肠给药组合物，例如含有可可脂或其它甘油酯类等常规栓剂基 质的栓剂或保留灌肠剂。固体口服剂型可用赋形剂制成，所述赋形剂可包括填料、崩解剂、 (干、湿)粘合剂、溶解阻延剂、润滑剂、助流剂、抗粘着剂、阳离子交换 树脂、湿润剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂及调味剂。这些赋形剂可以是 合成的或是天然来源的。所述赋形剂的实例包括纤维素衍生物、柠檬酸、 磷酸二钙、明胶、碳酸镁、十二烷基硫酸镁/钠、甘露醇、聚乙二醇、聚 乙烯吡咯烷酮、硅酸盐、二氧化硅、苯甲酸钠、山梨醇、淀粉、硬脂酸或 其盐、糖(即葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、滑石、西黄蓍胶浆、(氢化)植物 油、以及蜡。乙醇和水可作为造粒辅佐剂。在某些情况下，需要用例如掩 味膜、抗胃酸膜或延释膜对片剂进行包衣。天然及合成聚合物结合色素、 糖和有机溶剂或水，经常用于对片剂进行包衣，制成糖衣片。当胶囊比片 剂优选时，药物的粉末、悬浮液或其溶液可以置于相容的硬或软胶囊中。 在一个实施方式中，本发明的化合物可局部施用，如通过皮肤贴剂、 半固体或液体制剂例如凝胶、(微)乳剂、软膏、溶液、(纳/微)悬浮液或发 泡剂。药物穿透入皮肤及深层组织中的过程可通过以下方法调节例如使 用穿透促进剂；通过亲脂性、亲水性或两亲性的赋形剂(包括水、有机溶 剂、蜡、油类、合成和天然聚合物、表面活性剂和乳化剂)的适当选择与 组合；通过pH值调节；以及使用络合剂。其它技术例如离子电渗疗法， 可用于调节本发明化合物的皮肤穿透。在例如希望药物最低限度的全身性 暴露而进行局部用药的情况中，优选经皮或局部用药。使用吸入剂或经由鼻部给药时，方便输送用于本发明的化合物的形式 有溶液、悬浮液、乳剂、或来自加压包或喷雾器的半固态气雾剂，所述加 压包或喷雾器通常会使用推进剂(例如由甲垸和乙烷、二氧化碳或任何其 它合适气体桁生的卤化炭)。对于局部气雾剂，可以使用碳氢化合物例如 丁垸、异丁烯和戊烷。使用加压喷雾剂时，可通过使用阀门输送经测量的 量来测定适当的剂量单位。可以制备用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊 或药筒。典型地，它们可含有所述化合物的粉末混合和合适的粉末基质 (如乳糖或淀粉)。配制成通过注射进行肠胃外给药的组合物通常是无菌的并可以单位剂 型提供，例如于安瓿、注射器、注射笔中或于多剂量容器中，后者通常含 有防腐剂。所述组合物可以是悬浮液、溶液、或是在油性或水性载体中的 乳剂，并可以含有配方药剂(formulatory agents)如缓冲液、张度剂、粘度 增强剂、表面活性剂、悬浮剂及分散剂、抗氧化剂、生物相容性聚合物、 螯合剂和防腐剂。根据注射部位，所述载体可能含有水、合成油或植物 油、和/或有机共溶剂。在某些情况下，例如在是冻干制品或浓縮物的情 况下，肠胃外给药的制剂在给药前需还原或稀释。提供控释或缓释本发明 化合物的长效制剂可包括纳/微颗粒、或纳/微或非微粉化晶体的可注射悬 浮液。除了本技术领域中熟悉的控释/缓释基质外，亦可使用聚合物例如
聚乳酸、聚乙醇酸、或其共聚物作为控释/缓释基质。其它长效输送系统 可以需要切口的埋植剂和泵的形式提供。用于静脉注射本发明的分子的合适的载体，在本技术领域中已为人熟 知，其包括水基溶液例如含有磷酸盐或组氨酸的缓冲液，该水基溶液含有 基质(例如氢氧化钠)以形成电离化合物、用作张度剂的蔗糖或氯化钠。可 加入共溶剂，例如聚乙二醇。这些水基系统可有效地溶解本发明的化合 物，并在全身用药时产生低的毒性。可以相当大地改变溶液系统中各成分 的比例，而不会对溶解度和毒性特征造成破坏。此外，成分的特性也可改 变。例如，可以用低毒性的表面活性剂，如聚山梨醇酯或泊洛沙姆，也可 以用聚乙二醇或其它共溶剂，可加入生物相容性聚合物如聚乙烯吡咯烷 酮，且其它糖和多元醇可代替葡萄糖。对可用于本发明的治疗方法的组合物，可通过本技术领域中为人熟悉 的各种技术来初步估计治疗有效剂量。动物研究中使用的初始剂量，可依 据细胞培养试验中确立的有效浓度而定。可以使用例如从动物研究和细胞 培养试验获得的数据来判定适合人类对象的剂量范围。本发明的化合物、药剂或药物的治疗有效剂量或量，是指所述化合 物、药剂或药物导致对象中的症状改善或生存期延长的剂量或量。所述分 子的毒性和治疗效果可通过标准制药程序在细胞培养物或实验动物中确定，例如测定LD50 (半数致死剂量)和ED50 (半数有效量)。毒性与疗效 的剂量比就是治疗指数，该指数可以用LD50/ED50的比率来表示。以具 有高治疗指数的药剂为优选。有效量或治疗有疗量是指在组织、系统、动物或人中引起研究员、兽 医、医生或其它临床医师期望的生物学或医学反应(例如血管功能改善和 心脏功能改善等)的量。剂量以包括ED50的循环浓度范围为佳，并以少有或没有毒性为佳。 剂量可以在这一范围内根据所用剂型和/或给药途经而有所不同。考虑对 象病况的具体细节，应根据本技术领域中已知的方法来选择确切配方、给
药途经、剂量和剂量间隔。剂量和剂量间隔可以个别调整，以提供足以达到预期效果(例如血管 功能改善、心脏功能改善等)的血浆中活性成分水平，即最小有效浓度(MEC)。 MEC会视乎每个化合物而有所不同，但可根据例如体外数据和动 物实验进行估计。达到MEC所必需的剂量取决于个体特征和给药途经。 在局部给药或选择性吸收的情况下，所述药物的有效局部浓度可能与血液 药物浓度不相关。施用的药剂或组合物的量可取决于多种因素，包括治疗对象的性别、 年龄和体重、疾病的严重性、给药方式及处方医师的判断。如果需要，本发明的组合物可在含有活性成分的一或多个单位剂型的 包装或配药装置中提供。所述包装或装置可包含例如金属箔片或塑料箔片 (例如水泡眼包装)，或玻璃和橡胶塞(例如于小瓶中)。所述包装或配药装 置可附带给药的说明书。也可以将包含本发明化合物的组合物的配制在一 个相容性的药物载体内，放置在适当的容器中，并贴上治疗适应症标签。这些实施方式和本发明的其他实施方式是本发明所属领域普通技术人 员考虑了本申请披露之后会容易地想到的。实施例本发明参照下述实施例进一步理解，这些实施例仅仅是本发明的示 例。这些实施例仅仅是为了对本发明进行说明。本发明的范围不限于仅用 于说明本发明的某一方面的示例性实施方式。任何功能等价的方法均在本 发明范围内。参照上述描述和附图，针对本发明的描述所做的各种修饰以 及本申请所公开的内容对于本领域技术人员将会是显然的。这些修饰也落 入权利要求书保护的范围。实施例1:抗CTGF治疗改善血液动力学参数及心脏功能如下，将本发明的方法用于证实其在动物模型中对与糖尿病相关的血 管并发症的某些方面的广谱疗效。给Sprague Dawley大鼠单次静脉注射一 剂链脲霉素(STZ)(65mg/kg)诱发糖尿病。大鼠中STZ诱发的糖尿病导致血 管通透性增加(Lawson et al. (2005) Regul Pept 124:221-224)及心功能减弱 (Machackova et al (2004) Mol Cell Biochem 261:271-278)。实验大鼠在第0 天接受0.1M柠檬酸缓冲的链脲霉素(pH值4.1)的静脉注射，剂量 65mg/kg (65mg/ml)。 STZ是否成功诱发糖尿病以第2天空腹血糖水平的升 高(〉250mg/dl)证实。将糖尿病动物分到各治疗组(载体，3mg/kg， 5mg/kg;或10mg/kg抗 CTGF抗体CLN-1 )。受治疗动物每周3次接受腹膜内注射载体或抗CTGF 抗体，为期6周。6周结束时，将动物麻醉，然后将装有压力传感器 (Millar instruments)的微尖电导管放置在左心室测量心脏功能。用计算机 数据采集系统(ADI Instruments)记录压力容积环。计算机分析压力容积环 (PVAN system, Millar Instruments),以测定血液动力学参数。或者，对动 物施以轻度麻醉，然后用心脏超声技术测定心脏功能。这种技术在本领域 技术人员中是熟悉的。依照各血液动力学和心脏功能参数所确定，糖尿病动物呈现心功能减 弱。与未治疗的糖尿病动物相比，用抗CTGF抗体治疗的糖尿病动物呈现 心功能增强。具体来说，用抗CTGF抗体治疗的糖尿病动物呈现改善的心 室舒张性、心室收縮性、舒张末压、舒张末期容积、射血分数、动脉弹 性、每搏输出量及心输出量。综上，这些结果表明抑制CTGF提供了治疗 与糖尿病相关的血管并发症的治疗方法，例如改善心脏和血管功能。依照各血液动力学和心脏功能参数所确定，糖尿病动物呈现心功能减 弱。检测了抗CTGF治疗对射血分数(每搏输出量除以总容积)的影响。如 图1所示，糖尿病动物的收縮和舒张功能都受损或减弱。特别地，与健康 的对照组动物相比，糖尿病动物的射血分数(EF)百分比降低。与未治疗的 对照组糖尿病动物相比，施用抗CTGF抗体后的糖尿病动物射血分数百分 比呈现增加(参见图1)。施用抗CTGF抗体之后(从第6周至第12周)，糖
尿病动物的射血分数百分比与健康的非糖尿病对照组动物中观察到的射血分数百分比相似或相当。该数据表明施用抗CTGF抗体阻止了射血分数降 低。也检测了抗CTGF治疗对左室舒张末压(LVEDP)的影响。糖尿病动 物呈现左室舒张末压增加。如图2中所示，施用抗CTGF抗体阻止了在未 治疗的对照组糖尿病动物中可见的左室舒张末压增加。施用抗CTGF抗体 之后，糖尿病动物的左室舒张末压与在健康的非糖尿病对照组动物中所观 察到的结果相似。这些结果表明施用抗CTGF抗体阻止了左室舒张末压的 增加。也检测了抗CTGF治疗对心肌收缩性和舒张性的影响。如图3中所 示，与健康的无糖尿病对照组动物相比，糖尿病动物的最大dP/dt下降。 此外，给糖尿病动物施用抗CTGF抗体阻止了在未治疗的糖尿病动物中观 察到的dP/dt最低收縮性的下降(参见图4)。最大dP/dt下降和最低dP/dt 下降的减少指示心肌收縮性和舒张性有所改善。总的来说，这些结果表明抗CTGF治疗在改善心脏功能上是有效的。实施例2:抗CTGF治疗降低动脉硬度以上述实施例1的糖尿病动物模型测量抗CTGF治疗对动脉硬度的影 响(动脉硬度是血管功能，尤其是大血管功能的量度标准)。获得动脉硬度 的各种测量结果，其中包括来自颈动脉的被动和主动压力-容积数据。为 了进行测量，将连接着三路活栓的PE-50导管插入左侧颈动脉的远端部 分。经所述插管将改良Krebs缓冲液灌注到颈动脉中。用血管封堵器阻塞 颈动脉的近端。将压力传感器连接到所述三路活栓，测量灌注缓冲溶液的 过程中产生的力。将所述PE管的末端亦连接到等距力传感器，以测量加 压过程中的等距轴向力。用数字图像分析系统来衡量所述动脉片段的外半 径的改变。以无(^2+缓冲液灌注所述动脉片段以测定动脉被动硬度。在灌 注液中加入血管扩张剂和血管收縮剂(例如去甲肾上腺素)来测定动脉壁的
主动硬度。在某些实验中，从动物切除动脉片段，并以体内拉伸长度用类 似仪器进行离体评估。糖尿病大鼠的颈动脉硬度增加。如图5所示，分离的颈动脉的力-压曲 线显示出在糖尿病动物中颈动脉轴向硬度增加。以3mg/kg或10mg/kg的 抗CTGF抗体(CLN-1)治疗的糖尿病动物的颈动脉轴向硬度与健康的对照 组动物相似。这些结果表明抗CTGF抗体治疗预防或降低了糖尿病动物颈 动脉的轴向硬度(例如，预防或降低血管功能障碍，尤其是预防或降低大 血管功能障碍)，且抗CTGF抗体治疗令与糖尿病相关的轴向硬度归于非 糖尿病对照组正常水平。此外，压力半径曲线分析显示糖尿病动物的颈动脉周向(即径向)硬度 增加。经抗CTGF抗体治疗的糖尿病动物的颈动脉周向硬度与无糖尿病动 物相似(参见图6)。综上，这些数据表明，抑制CTGF提供了降低或预防与糖尿病相关的 动脉和血管硬度增加的方法。因此，抑制CTGF提供了治疗与糖尿病相关 的血管并发症和改善血管功能的治疗方法。除以上所述实验外，本发明的方法和药剂被用于证明其在动物模型 中，对与糖尿病相关的血管并发症的其它方面也有广谱疗效。在一系列实 验中，用上述实施例1所述的糖尿病动物模型测量抗CTGF治疗对动脉硬 度的影响(动脉硬度是血管功能，尤其是大血管功能的量度标准)。给 Sprague Dawley大鼠单次静脉注射0.1M柠檬酸缓冲的(pH4.1)链脲霉素 (STZ) (65mg/kg)诱发糖尿病(I型糖尿病)。STZ处理是否成功诱发糖尿病 以第2天空腹血糖水平的升高(〉250mg/dl)证实。大鼠中STZ诱发的糖尿 病导致血管通透性增加(Lawson et al. (2005) Regul Pept 124:221-224)。在另一系列的实验中，动物注射STZ后，任由糖尿病和与糖尿病相关 的疾病发展6周。6周后，将糖尿病动物分成以下各治疗组人IgG对照 组(10mg/kg，腹膜内注射，每周三次，为期6周)、抗CTGF抗体组 (CLN-1， 10mg/kg，腹膜内注射，每周三次，为期6周)、卡托普利组(75mg/kg/天，口服，于饮用水中)。图7显示维持体内轴向拉伸所需轴向力。图7中数据以平均值士标准 差表示；NS-无显著性差异；重复测量的数据通过双向ANOVA进行分析 (Tukey post hoc test)。糖尿病大鼠颈动脉硬度增加。具体来说，糖尿病令轴向被动硬度显著 增加。如图7所示，各颈动脉的力-压曲线证实诱发糖尿病后6周，糖尿病 动物中颈动脉轴向硬度增加(参见图7中"STZ 6周")。如图7所示，与 无糖尿病对照组动物的轴向被动硬度相比，在第6周的(未经治疗的)糖尿 病动物或第12周的(从第6周至第12周经对照组人IgG治疗的)糖尿病动 物中观察到的轴向被动硬度都有增加。与第6周所观察到的轴向被动硬度 相比，从第6周至第12周经对照组人IgG治疗的动物，在接受STZ处理 及发生糖尿病之后第12周被动轴向硬度增加。这些结果表明，糖尿病动 物动脉硬度增加，这种增加从第6周到第12周会持续并恶化。与施用了人IgG对照的糖尿病动物相比，施用了抗CTGF抗体的糖尿 病动物呈现轴向被动硬度降低或具有降低的轴向被动硬度(参见图7)。注 射STZ及糖尿病发生后6周开始给糖尿病动物施用抗CTGF抗体，此时动 物的轴向硬度与无糖尿病动物相比已呈现增加。从第6周至第12周期间 施用抗CTGF抗体之后，动物的轴向被动硬度测量值低于在第6周时所观 察到的值。这一数据表明施用抗CTGF抗体阻止了颈动脉轴向被动硬化的 进展。这一数据也表明施用抗CTGF抗体可有效逆转或降低与糖尿病相关 的轴向硬化。这些结果表明用抗CTGF抗体治疗糖尿病动物，可以预防和降低颈动 脉的轴向硬度(例如，预防和减轻血管功能障碍，尤其是预防和减轻大血 管功能障碍)，而且抗CTGF抗体治疗可有效逆转与糖尿病相关的轴向硬 度。综上，这些数据表明，抑制CTGF提供了用于减少或预防与糖尿病相 关的动脉及血管硬度的增加的方法。因此，抑制CTGF提供了用于治疗与
糖尿病相关的血管并发症和改善血管功能的治疗方法。此外，这些动物的压力半径曲线分析表明糖尿病动物颈动脉周向(即径向)硬度增加。图8中在较高压力时压力半径曲线左移，表示动脉硬度 增加。数据表明，与健康的对照组动物相比，第6周的糖尿病动物或从第 6周至第12周用对照组人IgG治疗的糖尿病动物，都呈现颈动脉周向(即 径向)动脉硬度增加(参见图8)。在图8中，数据以平均值士标准差表示； NS二无显著性差异；重复测量的数据通过LSD post hoc tests进行ANOVA 方差分析。STZ注射及糖尿病发生后，与用对照组人IgG治疗的动物相比，在第 6周至第12周期间经抗CTGF抗体治疗的糖尿病动物的颈动脉周向硬度呈 现显著降低。这些结果表明，施用抗CTGF抗体能有效降低与糖尿病相关 的周向动脉硬度。此外，这些结果表明，抗CTGF抗体治疗可有效逆转和 改善(例如降低周向动脉硬度)与糖尿病相关的周向被动动脉硬度。综上，这些数据表明，抑制CTGF提供了减少、预防或逆转与糖尿病 相关的动脉和血管硬度的增加(例如减轻或逆转血管功能障碍，特别是减 轻或逆转大血管功能障碍)的方法。因此，抑制CTGF提供了用于治疗与 糖尿病相关的血管并发症和改善血管功能的有效的治疗方法。此外，这些 结果表明，本发明中的方法和化合物能有效地治疗、预防、减少或逆转与 糖尿病相关的大血管并发症，因而有助于改善大血管功能。，微微力沈吝腳量将本发明的方法和药剂用于证实其在动物模型中对与糖尿病相关的血 管并发症的某些方面的广谱疗效。在一系列实验中，如下利用糖尿病动物 模型测量抗CTGF治疗对动脉硬度的影响(动脉硬度是血管功能，尤其是 大血管功能的量度标准)。给Sprague Dawley大鼠单次静脉注射O.IM柠檬 酸缓冲的(pH4.1)链脲霉素(STZ)(65mg/kg)，诱发(I型)糖尿病。STZ是否 在动物中成功诱发糖尿病以第2天空腹血糖水平的升高(>250mg/dl)为准证实。注射STZ后，任由糖尿病和与糖尿病相关的疾病进展6周。6周后， 将糖尿病动物分成以下不同治疗组人IgG对照组(10mg/kg，腹膜内注 射，每周三次，为期6周)；抗CTGF抗体组(CLN-1， 10mg/kg，腹膜内 注射，每周三次，为期6周)；卡托普利组(75mg/kg/天，口服，于饮用水 中)；氯沙坦组(20mg/kg/天，于饮用水中)；抗CTGF抗体(CLN-1， 10mg/kg，腹膜内注射，每周三次，为期6周)+卡托普利(75mg/kg/day， 口服，于饮用水中)组；抗CTGF抗体(CLN-1， 10mg/kg，腹膜内注射， 每周三次，为期6周)+氯沙坦(20mg/kg/天，于饮用水中)组。该实验中的动物接受实施例1中描述的动脉力学性能测试。在力学性 能测试之前，体内测量了动脉片段的长度。力学测试后20分钟测量样品 长度，以获取无负载和零应力状态数据。将这一长度与摘除血管之前测量 的体内片段长度相比较。所得的比例被记录为体内轴向拉伸率。如图9所 示，到第6周实验性糖尿病降低了体内轴向拉伸率。至第12周，抗CTGF 抗体治疗阻止了体内轴向拉伸率进一步下跌，而载体治疗的动物中体内轴 向拉伸率却持续下降。体内拉伸率的下降指示动脉正发生硬化。抗CTGF 抗体治疗预防了动脉硬化。乂动#沐涨#鄉雄逆存从分离的颈动脉片段中部切除大动脉环并放置在Krebs溶液中。拍下 在无负载状态下所述环的截面的数字照片。循径向切开所述环，令它打开 成扇形。20分钟后拍下数字照片，让其发生粘弹性蠕变。张开角定义为 (分别)连接内表面中点与扇形(两个)内端点的连线间所形成的夹角，它是 零应力状态的特征。如图10所示，到第六周实验性糖尿病增加了张开 角。在第12周，抗CTGF抗体治疗令增加的张开角回复正常，无异于健 康对照组的水平，而在载体治疗动物中张开角则持续上升。张开角是动脉 壁中有残余应力的指征。
这些结果表明抗CTGF抗体治疗糖尿病动物预防和逆转了颈动脉壁的 病理变化(例如预防和减轻了血管功能障碍，尤其是预防和减轻了大血管 功能障碍)，而且抗CTGF抗体治疗能有效逆转与糖尿病相关的硬度。综 上，这些数据表明，抑制CTGF提供了减少、预防或逆转与糖尿病相关的 动脉和血管硬度的增加(例如减轻或逆转血管功能障碍，特别是减轻或逆 转大血管功能障碍)的方法。因此，抑制CTGF提供了治疗与糖尿病相关 的血管并发症和改善血管功能的有效治疗方法。此外，这些结果表明，本 发明的方法和化合物能有效地治疗、预防、减少或逆转与糖尿病相关的大 血管并发症，因而有助于改善大血管功能。实施例3:抗CTGF治疗降低血管通透性利用上述实施例1所述糖尿病动物模型测量抗CTGF治疗对血管通透 性的影响(血管通透性是血管功能，尤其是微血管功能的量度标准)。诱发 糖尿病后，在不同时间按照如下测试大鼠的血管通透性(VP)的增加。给未 经麻醉的大鼠静脉注射伊文思蓝(EB)染料(20mg/kg)。 20分钟后，以过量 麻醉处死动物，并摘除心脏。切除并称量从肩部以后躯干的皮肤片段。在 该检测中，血管通透性增加的特征是染料外渗进入皮肤。将皮肤浸在24。C 的甲酰胺(4ml/g湿重)24小时。利用平板读取器通过分光光度测定法于 620nm测量萃取到甲酰胺中的EB染料的吸光度。在该检测中，EB染料的 浓度与血管通透性程度成正比。此外，以6毫米活检穿孔器取得皮肤片 段。称量这些片段的重量，然后于60。C干燥过夜。称量干燥样品的重 量，并确定湿重与干重的比率。湿/干比率增加指示存在组织水肿。如图11和图12所示，伊文思蓝外渗增加及组织的湿/干比率增加，证 明在第3周糖尿病动物的血管通透性和组织水肿(与对照组非糖尿病动物 相比)己增加。糖尿病动物经抗CTGF抗体治疗后，与未治疗的糖尿病动 物相比，伊文思蓝外渗减少且湿/干比率降低。这些结果表明，用抗CTGF抗体治疗糖尿病动物，降低了与糖尿病相
关的血管通透性并减轻了组织水肿(例如减轻血管功能障碍，尤其是微血 管功能障碍)。综上，这些结果表明，本发明的方法和化合物能有效地治 疗、预防或减少与糖尿病相关的微血管并发症，因而有助于改善微血管功 能。如图13所示，所述组织的伊文思蓝外渗增加和湿/干比率增加，证明 在STZ注射及糖尿病发生后，第6周的糖尿病动物和从第6周至第12周 期间施用了人IgG对照的糖尿病动物，血管通透性和组织水肿(与对照组 非糖尿病动物相比)增加。(图13中数据先通过ANOVA进行分析，然后 通过LSD post hoc tests进行分析)。(从第6周到第12周)用抗CTGF抗体 治疗的糖尿病动物，与未治疗的糖尿病动物相比，伊文思蓝外渗减少且湿 斤比率降低。此外，从第6周到第12周施用抗CTGF抗体的动物，与施 用人IgG对照的对照组动物比较，显示出血管通透性降低和组织水肿减 少。这些结果表明抗CTGF抗体治疗能有效改善、减少和逆转与糖尿病相 关的血管通透性和组织水肿。这些结果表明，糖尿病动物接受抗CTGF抗体治疗后能减少和逆转与 糖尿病相关的血管通透性和组织水肿(例如减轻和逆转血管功能障碍，特 别是减轻和逆转微血管功能障碍)。综上，这些结果表明，本发明的方法 和化合物能有效地治疗、预防、减少或逆转与糖尿病相关的微血管并发 症，因而有助于改善微血管功能。实施例4:抗CTGF治疗减少血管钙化如下所述，检测抗CTGF治疗对血管钙化的影响。用STZ诱发糖尿病 后6周，对由动物中取得的颈动脉片段作钙矿物沉积的Von Kossa染色。 将两厘米长的颈总动脉片段置于10y。锌福尔马林(0.1M)中24小时，用系 列稀释的乙醇溶液脱水，随后用石蜡包埋。从所述颈动脉组织作3微米厚 切片，除去石蜡，在蒸馏水中水化，然后用5MAgN03处理60分钟。然 后用蒸馏水漂洗颈动脉组织样品并用5。/。Na2S203处理两分钟。然后将所 述标本顺序在蒸馏水和95%乙醇中漂洗。然后将所述标本以曙红复染，并 放在光学显微镜下检査，通过沿血管壁内膜层呈现的暗黑色/棕色染色给 血管壁钙化评分。所述血管壁在光学显微镜观察下，以存在或不存在来量 度血管钙化。该研究的结果如图14中所示。诱发糖尿病后6周，与所述血管相关 的钙矿物沉积的von Kossa染色使沿着糖尿病动物的颈动脉内膜层出现强 阳性的黑色/棕色染色区域；而从无糖尿病动物获取的颈动脉则出现很少 或无钙染色。此外，从经人IgG对照治疗的糖尿病动物(11=6)获取的颈动 脉，有一半呈强阳性血管钙化染色。类似地，在第6周从经卡托普利治疗 的糖尿病动物(n=8)获取的颈动脉，有一半呈现强钙染色。从施用抗 CTGF抗体(CLN-1， 3mg/kg)的糖尿病动物获取的颈动脉呈现钙矿物沉积 染色减少。具体地，从接受3mg/kg的抗CTGF抗体(CLN-1)治疗的糖尿 病动物获取的颈动脉，少于一半(43%)在第6周呈现阳性钙染色。施用较 高剂量抗CTGF抗体(CLN-1， 10mg/kg)能预防所有从糖尿病动物(n=6) 获取的颈动脉切片中的钙沉积。这些结果表明用抗CTGF抗体治疗糖尿病 动物能预防或减少血管钙化。这些数据表明抗CTGF治疗有助于预防或减 少血管钙化。实施例5:抗CTGF治疗对糖尿病动物模型中的心血管并发症有治疗疗效 使用8周龄雄性必/必小鼠(CSTBLKSAH^WMe/jn^)和他们年龄相 一致的非糖尿病必/+同窝出生的小鼠(^5780^/>1-%^必/+) (Jackson Labs, Bar Harbor， ME)。必/必小鼠初始重量约40g。非糖尿病必/+小鼠初始体重 约20g。在某些实验组中，饮用水加入200mg/L的氯沙坦，这浓度确保氯 沙坦的输送率为约2mg/天。纯化的多供体人IgG购自Sigma Chemical Corporation(St丄ouis， Mo.)， 并通过蛋白A层析再纯化。立即中和含有人IgG的酸性洗脱液，并用PBS 彻底透析，然后无菌过滤，进行检测以确定纯度和无内毒素，并贮存于
4°C直到使用(批号CML052803或类似，4.67mg/mL)。一旦100%的必/必小鼠变成高血糖(以血糖水平比必/+对照组小鼠高 2倍或以上为准)，在8周龄开始实施抗CTGF单克隆抗体(CLN-1)治疗。 以高血糖为准确定的糖尿病发生后，将必/^>小鼠随机分为每组10只，并 按照如下治疗。 一组必/必小鼠接受腹膜内注射抗CTGF抗体(3mg/kg)治 疗，另一组接受抗CTGF抗体(CLN-1， 10mg/kg)治疗，另一组接受同种 型配对、不相干的人IgG(cIgG， 10mg/kg)治疗，另一组接受饮用水中的 氯沙坦(2mg/天)治疗，另一组同时接受饮用水中的氯沙坦(2mg/天)和腹膜 内注射clgG (10mg/kg)。抗体经腹膜内施药，最初单次注射量为300微 克，其后是每周3次，共8周的3mg/kg或10mg/kg剂量(注射容积大约 0.5ml)。处死动物时，用肝素化毛细管自眼眶静脉丛抽取非空腹血液样品。以 未分离的肝素化血液进行HbAlc及脂质水平分析。将血清样品存放在 -S(TC直至分析。从每一个动物摘除左肾和右肾、肝脏和心脏，然后称 重。如下进行血脂测定通过市售检测试剂盒(PTS Panels, Polymer Technology Systems, Inc.)测定总胆固醇(TC)、 HDL和甘油三酯(TG)的水 平。按下列公式计算LDL的水平-LDL=TC-HDL~(TG/5) 用经审定的市售HbAlc检测试剂盒测定新鲜全血的糖化血红素水平(以糖 化血红素HbAlc的百分比表示)。如图15所示，施用抗CTGF抗体的糖尿病动物与施用IgG对照的糖 尿病动物相比，心脏重量减少。这些结果表明，抗CTGF治疗有利于治疗 与糖尿病相关的心血管疾病，包括心脏肥大、充血性心力衰竭和心肌病。 图16显示，在如实施例1中所述的STZ诱发的糖尿病大鼠模型中，施用 CTGF抗体能降低心脏重量与体重的比率。如图17中所示，给糖尿病动物施用抗CTGF抗体能降低血液LDL水
平。LDL水平增加是发生心血管疾病和障碍的风险因素。因此，这些结果 表明，抗CTGF治疗能通过降低LDL水平而有利于降低心血管疾病发生 的风险或有利于预防其发生。图18显示给糖尿病动物施用抗CTGF抗体能降低HbAlc (糖化血红素) 水平。图19显示，在如实施例1所述的STZ诱发的糖尿病大鼠模型中， 施用抗CTGF抗体能降低血液HbAlc水平。糖化血红素水平测量能提供 人体最近2至3个月内平均血糖浓度的准确指标。人类的正常(无糖尿病) 糖化血红素水平在4至6%之间。在糖尿病人研究中，DCCT发现，与具 有较高HbAlc水平的糖尿病人相比，把HbAlc水平降低到或保持在平均 7.2%，可以令心血管疾病减少35°/。。因此，这些结果表明，抗CTGF治疗 能降低糖化血红素水平，从而降低心血管疾病发生的风险或防止心血管疾 病的发生。图20显示抗CTGF抗体及ARB结合治疗能有效提高血液HDL水平。参照上述描述，针对本发明的描述所做的各种修改对于本领域技术人 员将会是明显的。这些修改均落入权利要求书保护的范围。本申请引用的所有参考文献以其全文引入本申请作为参考。 以下各参考文献以其全文引入本申请作为参考。
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权利要求
1.一种用于改善对象的心脏功能的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的抗CTGF剂，从而改善对象的心脏功能。
2. 权利要求1的方法，其中所述对象是患有糖尿病或具有患糖尿病的风险的 对象。
3. 前述任一项权利要求的方法，其中所述方法用于改善射血分数。
4. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法用于增加每搏输出量。
5. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法用于增加心输出量。
6. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法用于改善心室舒张。
7. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法用于改善心室收縮力。
8. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法用于提高舒张末压。
9. 权利要求1或权利要求2的方法，其中所述方法用于增加舒张末容积。
10. 前述任一项权利要求的方法，其中所述方法用于治疗或预防心脏并发症。
11. 权利要求10的方法，其中所述心脏并发症选自心脏肥大、充血性心力衰 竭和心肌病。
12. 权利要求IO或权利要求11的方法，其中所述方法通过降低血液中低密度 脂蛋白水平而用于治疗或预防心脏并发症。
13. 前述任一项权利要求的方法，其中所述对象是哺乳动物对象。
14. 前述任一项权利要求的方法，其中所述对象是人。
15. 前述任一项权利要求的方法，其中所述抗CTGF剂是多肽、多核苷酸或小 分子。
16. 权利要求15的方法，其中所述抗CTGF剂是与CTGF结合的抗体或其片 段、反义分子、siRNA或小分子化合物。
17. 权利要求16的方法，其中所述抗CTGF剂是针对CTGF的单克隆抗体或 其片段。
18. 权利要求16的方法，其中所述抗CTGF剂是WO 2004/108764中描述的 CLN-1或其片段。
全文摘要
本发明涉及用于治疗受损的血管和心脏功能的方法和药剂。本发明还提供用于治疗各种与血管功能障碍和心功能障碍相关的生理学和病理学表现的方法和药剂。
文档编号C07K16/22GK101213213SQ200680024462
公开日2008年7月2日 申请日期2006年5月5日 优先权日2005年5月5日
发明者C·T·雅各布, D·Y·刘, I·朗赛特默帕罗伯克 申请人:菲布罗根公司