A型脑膜炎疫苗的免疫原的制作方法

专利名称：：A型脑膜炎疫苗的免疫原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及可用于A型脑膜炎疫苗的化合物。具体而言，该化合物是包括稳定化的含磷键——优选膦酸酯键(phosphonatelinkage)的寡糖。更优选地，该化合物含有甘露糖单元，并且在该甘露糖单元的C-l处还含有成a构型的间隔区。本发明也包括制造该寡糖的方法，和制造含甘露糖的化合物和中间体的改进方法。
背景技术：
：脑膜炎是脑脊膜感染，所述脑脊膜为包围脑和脊髓的薄膜(thinlining)。几种细菌可引起脑膜炎，脑膜炎奈瑟氏菌(A^mem'"g"W的是最重要的一种。其它细菌是肺炎链球菌Cs&印tococcw;wewnom'ae)禾口乙型流感杆菌(Z/flemo;/n7wsz力y/we"za)。有几种脑膜炎奈瑟氏菌的亚型，其通过包围细菌的荚膜多糖的结构加以区分。病毒和细菌都可引起脑膜炎。弓l起脑膜炎的细菌的两种主要类型为流感杆菌和脑膜炎奈瑟氏菌。在流感杆菌的情况下，仅一种血清型——乙型是重要的，然而对于脑膜炎奈瑟氏菌已经鉴定了12个血清群(serogroup)，其中A、B、C和W135组己知引起流行病。各种血清型在不同的地区流行，例如B型和C型主要在欧洲和北美，A型在非洲和南美。血清分型是基于包围细菌的荚膜多糖(CPS)的结构和抗原性，并且CPS也可被用作对抗细菌的疫苗。通过将糖结合到载体蛋白，可制造特别有效的疫苗(复合糖疫苗)。参见Plotkin,S.A.和OrensteinW.A.,Vaccines,4thed.,Saunders,959-987页(2004)，其通过引用被引入本文。这些复合糖诱导具有记忆性的T-细胞依赖性免疫应答，并也对于幼年孩子起作用，而一般而言，非结合CPS既不能在成年人中提供记忆效应(memoryeffect),也不能在婴儿中提供任何实质性免疫原性效应。A型疫苗的开发被认为特别困难，原因在于作为CPS—部分的异头磷酸二酯键的固有不稳定性。A型的重复单位是单糖一一通过磷酸二酯键桥1—6连接的2-乙酰氨基-2-脱氧-o;-D-吡喃甘露糖(图1)。在天然多糖中，3-OH被乙酰化大约80。/。的程度。该乙酰化的免疫学重要性还没有被彻底研究，但是迹象表明其不具有显著意义。脑膜炎奈瑟氏菌血清群A引起脑膜炎的流行病突发，主要在撒哈拉南部的非洲部分所谓的脑膜炎带。在该脑膜炎带，估计在1970-1992期间的发生率大约800,000例。参见Plotkin,S.A.和Orenstein,W.A.,Vaccines,4thed.,Saunders,959-987页(2004)。脑膜炎流行病的突发正在毁掉该区域，所以迫切需要有效的疫苗。当然，希望优良疫苗的开发，加上类似于WHO在二十世纪六十年代和七十年代进行的对抗天花所作的努力，可同样地消除脑膜炎奈瑟氏菌血清型A引起的脑膜炎。接种疫苗比用抗生素和其它治疗方法控制疾病是成本更有效的方式，而在研发领域，成本是特别重要的。从细菌上多糖包被——其荚膜多糖制备的疫苗，在成年人中有效。暴露于该多糖引起成年人发展免疫应答，其保护免于脑膜炎奈瑟氏菌引起的脑膜炎。然而，这类疫苗的一个重要限制是大约两岁以下的孩子的免疫系统不对大多数多糖抗原应答。遗憾的是，这是对于细菌脑膜炎最大危险的年龄组。因此，多糖疫苗在年幼孩子中是无用的。而且，即使在较大的孩子和成年人中，这些疫苗也仅仅诱导短期的免疫性。在接种疫苗大约两年后，保护迅速降低，并且通常消失。多糖如脑膜炎奈瑟氏菌CPS是T细胞非依赖性抗原，这意味着在没有T细胞(胸腺产生细胞)参与的情况下，它们可产生免疫应答。这种应答缺乏几种表征T细胞依赖性免疫应答的重要性能，例如免疫记忆、从IgM到IgG的类别转换以及亲和力成熟。然而，如果将多糖部分结合到载体蛋白，那么其引发产生记忆效应的细胞免疫应答，并且也在年幼儿童中提供保护。这类接合到载体蛋白的多糖通常被称为复合糖，并且其作为疫苗特别有用。因为它们的产生涉及多糖抗原或其它糖抗原与载体蛋白的结合，所以称为复合糖疫苗。复合糖疫苗中的糖部分通常是官能化的细菌CPS,但是也可以是合成的。合成的碳氢化合物结构相比基于自然来源的碳氢化合物的结构具有大量的潜在优势。自然源的碳氢化合物是异源混合物，其可包括少量的天然杂质和污染物。相反地，合成的碳氢化合物可作为同源单一化合物以受控的方式产生，具有很少或没有批次之间(batch-to-batch)的差异。合成结构的另一个优点是可使它们包含用于碳氢化合物部分衍生或修饰的官能团，这些衍生或修饰在天然物质上难以或不可能进行。在免疫原性调节中，载体蛋白是重要因素。多种载体已被用于结合，并且使用强免疫原性蛋白如白喉毒素和破伤风毒素的去毒版本，已经取得了最好的结果，其已被允许在人中使用。参见美国专利4,354,170。也已显示，当患者已经用特定的载体蛋白免疫后，免疫系统更有效地反应。通常将细菌的天然荚膜多糖结构结合到适当的载体蛋白，制造复合糖疫苗。然而，由于包裹脑膜炎奈瑟氏菌的多糖的性能，此种方法存在问题。在将多糖结合到蛋白质所必需的条件下，其磷酸二酯键可能降解，甚至在制备以后，天然CPS的复合糖倾向于在储存期间降解。磷酸二酯键通常是十分稳定的，但是在脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖中，磷酸二酯键被连接到碳氢化合物残基的异头中心(anomericcenter)。因此磷酸二酯键的一个氧也是縮醛键的一部分，其使縮醛键易于被亲电体例如酸或金属离子水解切割。该键的切割将多糖分解成小片段。遗憾的是，在形成复合糖或者甚至在疫苗配制中所需要的操作期间，A型脑膜炎奈瑟氏菌的CPS经历这种降解，致使难以制造或储存包括该特定CPS的有效疫苗。使磷酸二酯键更稳定的一种方式是消除磷和异头氧之间的氧，以便键的部分不再易于被亲电水解所切割。在异头中心的外环氧可被等构碳原子(CH2)所取代，将磷酸二酯键转化为它的C-膦酸酯类似物。这应该产生抗原多糖的稳定版本。涉及这种方法的一种研究近来己经被公布。Torres-Sanchez,M.L等，^"/e"(2005)7:1147-1151。然而，作者并没有评估它们的化合物的活性或者公开超过两个甘露糖单元的寡聚物。而且，它们的合成方法仅在寡糖拟被结合到蛋白的位置提供/3异头物，而且脑膜炎奈瑟氏菌的天然CPS仅包含a键。因此仍旧需要在甘露糖单元之间具有稳定键的a连接的复合糖，以及合成它们的方法。另一个方法利用临近取代基的诱导作用减少异头氧处的电子密度，来稳定磷酸二酯键；这样也应当减慢预期的亲电子降解机制。可保持取代基的吸电子性能，同时构建寡糖，并且或许也同时将其结合到蛋白质，然后一旦分子不再需要暴露于破坏性的条件时，将其除去。本发明包括这些方法的每一个，以及它们的组合。因此，本发明的一方面提供疫苗开发所需的脑膜炎奈瑟氏菌A型荚膜多糖重复单元的寡聚形式的C-膦酸酯类似物的有效合成。参见Bundle,D.R.等，乂所o/aew.(1974)249:2275-2281。具体而言，本发明提供了引入间隔区部分的方法，通过间隔区部分，本发明的寡糖可被结合到蛋白质以制造复合糖疫苗，并且将间隔区部分定位于a异头构型中。图2阐明在该中心具有期望a构型的化合物，和具有/3构型的化合物。因为目标生物体的天然CPS是甘露糖单元的完全a-连接的寡聚物，因此特别期望在合成的免疫原中提供相同的a-连接构型。即使复合糖的合成寡聚物部分中的甘露糖单元之间所有的键都是在a构型中，当复合糖的寡糖部分含有大约IO个以下甘露糖单元时，寡糖通过它被连接到蛋白质的中心的构型可特别影响免疫原性效应。因此，本发明提供了这类的化合物和制备这些化合物的方法。通常使用C-膦酸酯单酯和Mitsunobu条件施行关键的偶联步骤。虽然制备大小与天然CPS相当的多糖是不切实际的，但这也是不必要的甚至在长度上只有几个甘露糖单元的寡糖也可以诱出免疫应答。而且，合成的寡糖提供了体内选择性连接机制(selectivelinkagemechanism)和稳定性增加的优点，这些优点中的每一个应增强其体内免疫原性效果。本发明的另一方面提供了稳定甘露糖单元的方法，以便可以使用磷酸二酯键——该键存在于天然的荚膜多糖中。其包括提供稳定化的化合物和方法，以有助于制备寡糖的蛋白复合体。通过吸电子基团提供稳定化，所述吸电子基团为多糖中至少一个甘露糖单元的C-2处的氮化物，这增加了多糖的稳定性，以便其可被结合到蛋白质。在结合之后，稳定性不那么重要了，此时，氮化物一般被还原为胺并且被乙酰化，提供2-乙酰氨基基团，该2-乙酰氨基基团为脑膜炎奈瑟氏菌A型荚膜多糖中重复甘露糖单元的一部分。如果合适，也可混合所述两种稳定方法；因此本发明的寡糖可包括含氮化物的甘露糖单元以及膦酸酯连接的甘露糖单元，所述含氮化物的甘露糖单元通过临近异头中心的磷酸二酯连接。该组合可提供另外的稳定性，这取决于膦酸酯的取向；或者该组合也提供合成的优点，例如产率增加，并且其可以避免乙酰胺取代基可能引起的复杂化。在其它方面，本发明提供合成这些化合物重要前体、含有它们的药学组合物的方法，以及使用它们制造药物的方法。可施用这些化合物、组合物和药物给对象，以在对象中诱导免疫原性应答，所述对象一般是人。
发明内容本发明提供包括多糖或寡糖的免疫原性化合物和制造这些化合物的方法，以及使用它们作为疫苗提供保护以免于脑膜炎奈瑟氏菌A细菌感染的方法。所述方法允许制备包括至少两个通过1，6-键连接的甘露糖单元的多糖。该键通常为1,6-a键，并且甘露糖单元有时为N-取代的甘露糖基团，例如在一个或多个甘露糖单元上具有2-NHAc或2-N3的N-取代的甘露糖基团。所述键可以采用不同的形式，但是其通常包括膦酸酯或磷酸酯。在一些实施方式中，寡糖包括依次连接的至少三个甘露糖单元，其每一个一般是N-取代的。虽然化合物可包括任意数量的甘露糖单元，但在优选的实施方式中，分子的寡糖部分具有2000以下的分子量。因此，优选地，本发明的化合物包括大约2到IO个串连的甘露糖单元，优选大约3到7个。对本发明的化合物进行改变以结合到蛋白质，因为复合糖形式是有效得多的用于接种疫苗目的免疫原其在婴儿中诱导免疫原性应答，并且其诱导提供延长接种疫苗效用的记忆效应的细胞应答。因此，化合物包括连接于甘露糖单元链上第一个甘露糖单元的间隔区部分(或间隔基部分)。间隔区单元被具体设计以提供将寡糖连接到蛋白质的方法，或者提供帽化末端糖单元的方法，使得其对例如进一步的链延长/修饰反应无活性。典型地，该间隔区部分具有胺、羧酸酯或羟基，以与蛋白载体上的互补基团相偶联，但是也包括本领域已知的提供将寡糖结合到蛋白质的方式的其它基团。可选地，间隔区部分拥有保护或加帽基团，例如垸基、芳基或酰基，以及在本领域公知的和/或本文公开的其它基团。在本发明的化合物中，该间隔区部分成a构型，以便其最严格地类似脑膜炎奈瑟氏菌的天然CPS中的键，并且其不会干扰期望的免疫原性效应，即使在本发明的短寡糖中。本发明的化合物通常包括分子式(l)所示的结构(1)其中，每一个Az表示氮杂取代基；每一R3和W独立地表示H或保护基；W表示H、保护基或连接到另一个糖单元的连接体；W和X中的一个是O，并且W和X中的另一个是CH2;n是1或2;当n是l时，Yn是OR，当n是2时，一个Y是O并且另一个Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳垸基，或者R是M，这里M是阳离子；和Z是OR，、SR，、NR，2或卤素，这里每一R，独立地是H或任选地取代的烷基、酰基、芳基、芳垸基、杂垸基、杂酰基、杂芳基或杂芳烷基；或者Z表示结合到另一个糖单元的连接体或者结合到蛋白质的间隔区部分。通常在这些化合物中，X是O，W是CH2，并且Az通常是N3、NH2或NHAc;并且通常n为2。本发明的化合物部分通过本领域已知的方法合成，但是形成这些分子的大量新方法也是本发明的一部分。例如，可通过本文描述的Mitsunobu反应构建式(l)化合物中的1，6-a键。N-取代基例如Az也可通过本文描述的方法作为氮化物插入，然后可被还原以提供胺或取代胺，这通常在甘露糖单元的位置2，如式(l)所示。用于还原氮化物的一般方法包括催化加氢和氢硼化物还原，一般使用催化量的镍盐。本发明也提供制造膦酸酯-取代甘露糖单元的方法，以装配本发明描述的寡糖。例如，分子式(2)的化合物，其可从葡萄糖得到，可被转化为膦酸酯的前体，所述膦酸酯可用于形成分子式(l)所示的包含膦酸酯的1,6-a-键，这里W是CH2，X是O。本方法包括用亲电体环化分子式(2)的化合物，以形成分子式(3)的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>其中R2、R3、R"和W的每一个独立地为H或保护基；并且E1表示亲电体残余部分(residue)。亲电体残余部分E1是用于引起环化的亲电试剂的一部分，其保持与碳连接。然后El可直接或间接被含磷基团例如膦酸酯基团通过本文描述的方法取代。这提供葡萄糖衍生物而不是N-取代的甘露糖单元，即其在C-2处具有错误的立体化学；因此本发明进一步提供，通过用氮化物取代OR2的O的活性形式，将分子式(2)或分子式(3)中OR2转化为具有恰当立体化学的Az基团的方法。该方法包括Mitsunobu反应，其一般使用磷酰氮化物作为氮化物来源。本发明也提供制备2-叠氮-2-脱氧-D-吡喃甘露糖的方法，该方法包括在l,3,4,6-四-保护的吡喃葡萄糖衍生物的位置2形成三氟甲磺酸酯(triflate);并且用氮化物亲核体取代三氟甲磺酸酯。在一些实施方式中，1,3，4，6-四-保护的葡萄糖衍生物是1,3,4,6-四-0-酰基-吡喃葡萄糖，这是容易获得的。参见，例如Helferich,B.等，D加/CAew.G仏(1962)95:2604-2611。有时，优选1，3，4,6-四-0-乙酰基-吡喃葡萄糖。包括本文描述的寡糖的化合物和组合物的免疫原性活性通常通过将寡糖结合到蛋白质而得到增强。因此，在许多实施方式中，本发明包括通过连接到链上第一个甘露糖单元的C-l碳的间隔区部分，将寡糖结合到蛋白质。在一些实施方式中，根据其增强人免疫原性应答的能力而选择蛋白质，并且通常使用白喉和破伤风的去毒毒素类。因此，本发明的化合物通常包括间隔区部分，其可以是分子式(l)中的Z，或者可以被结合到甘露糖单元上的任何可用的羟基或N-取代基；并且其有助于结合到蛋白质。典型地，连接到蛋白质是通过Z，因此Z通常是间隔区部分，其能被结合到蛋白质。在本发明的许多化合物中，Z是被保护形式。适当的保护基取决于Z的准确属性，这类保护基的选择和使用是在本领域普通技术范围内的。这类保护基的实例和其使用的细节例如可从Greene,T.W.和Wuts，RG.M.，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,2ded.(1991)获得。相似地，本发明提供使用Z将寡糖结合到蛋白质以生产免疫原性组合物的方法。本发明也提供含本发明寡糖的疫苗组合物，其被用于在哺乳动物中诱导免疫原性应答。哺乳动物一般是人对象，因为脑膜炎奈瑟氏菌被认为仅在人中致病，但是在其它哺乳动物中诱导免疫应答也是有价值的，并可被用于提供免疫成分例如抗体。因此，本发明提供免疫原性组合物和使用这些免疫原性组合物在哺乳动物中诱导免疫原性应答的方法。附图简述图1示出了A型脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜多糖的结构。图2是中心位置的"和i8的异头物的说明，通过它们，寡糖被结合到蛋白质以增强免疫原性。图3示出合成寡糖的模块式装配方法(modularassemblystrategy)。图4示出不同疫苗剂量时合成复合糖和寡糖复合体对照物诱导的特异性抗体应答之间的关系。本发明的实施方式在一方面，本发明提供含有第一甘露糖单元和第二甘露糖单元的寡糖，其中第一甘露糖单元在C-l处包括成a构型的间隔区。该间隔区可结合到蛋白质，并且第一甘露糖单元通过1,6-键连接到第二甘露糖单元，所述1，6-键将第一单元的C-6与第二甘露糖单元的C-l连接。在一些实施方式中，1，6-键包括膦酸酯。在一些实施方式中，1,6-键在a构型中。在这些实施方式的一些中，第一甘露糖单元是2-脱氧-2-氮杂取代的甘露糖衍生物，以及在一些实施方式中，第二甘露糖单元是2-脱氧-2-氮杂取代的甘露糖衍生物。某些实施方式具有二个或三个，或者三个以上的这些2-氮杂取代的甘露糖单元。在本发明的一些实施方式中，1,6-键具有[第二个甘露糖单元的C-l]-CH2-P-0-[第一个甘露糖单元的C-6]的形式，即膦酸酯的碳被结合到第二甘露糖单元的C-l，膦酸酯氧被结合到第一甘露糖单元的C-6。任选地，这些甘露糖单元被保护，并且在许多实施方式中，这两个甘露糖单元的一个或两个包含2-氮杂取代基，其选自NH2、NHAc和N3。当这些实施方式包括第三个甘露糖单元，它有时通过包含磷的键结合到第二甘露糖单元，并且其中所述键将第二甘露糖单元的C-6结合到第三甘露糖单元的C-1。该键通常包括膦酸酯，其通常通过膦酸酯键与第二甘露糖单元排成一列，通过膦酸酯的P-C键与第三甘露糖单元排成一列。在其它方面，本发明提供分子式(l)的寡糖:其中，每一个AZ表示氮杂取代基；每一W和W独立地表示H或保护基；RS表示H、保护基或连接到另一个糖单元的连接体；W和X中的一个是O，并且W和X中的另一个是CH2;n是1或2;当n是l时，Yn是OR，当n是2时，一个Y是O并且另一个Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M，这里M是阳离子；和Z是OR，、SR，或NR'2，这里每一R，独立地是H或任选地取代的垸基、酰基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂酰基、杂芳基或杂芳烷基；或者Z表示结合到另一个糖单元的连接体或者结合到蛋白质的间隔区部分。在一些实施方式中，包含分子式(l)的化合物通过酰胺键或酯键被结合到蛋白质。通常在分子式(l)的化合物中，W是CKb，X是O，并且在许多这类实施方式中，Az是NHAc，n为2。也在该方面的许多实施方式中，R是M，Z包括-0-(CH2)n-NH-，其中n是2-6。在基于分子式(l)的这些化合物的实施方式中，每一个W和R"独立为H或Ac。通常W是Ac，并且任选地，je和W都是H或Ac。在其它方面，本发明提供制造寡糖的方法，该方法包括通过包含膦酸酯的1,6-键，将包含至少一个氮杂取代甘露糖单元的第一部分连接到包含至少一个氮杂取代甘露糖单元的第二部分。在这些实施方式中，第一部分通常包括间隔区部分，该间隔区部分被连接到a构型中的甘露糖单元的C-l。在这些方法的一些实施方式中，使用Mitsunobu反应将第一部分的甘露糖单元的C-6连接到第二部分的甘露糖单元的C-1。在这些方法的许多实施方式中，1，6键是l，6-of键。在这些方面的一些中，连接的氮杂取代甘露糖单元包括分子式G)R00其中，每一个Az表示氮杂取代基；每一R3和R4独立地表示H或保护基；W表示H、保护基或连接到另一个糖单元的连接体；W和X中的一个是O，并且W和X中的另一个是CH2;n是l或2;当n是l时，Yn是OR，当n是2时，一个Y是O并且另一Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M,这里M是单价阳离子；和Z表示可被结合到蛋白质的部分，其可是保护形式。在本方法的一些实施方式中，在包含分子式(l)的化合物中，X是CH2，W是O。在这些实施方式中，通常甘露糖单元上至少一个氮杂取代基是通过还原氮化物(N3)取代基得到的胺或取代胺。在优选的实施方式中，胺或取代胺在甘露糖单元的位置2上。在这些方法的一些实施方式中，寡糖包括可以是分子式(l)化合物中的Z的间隔区部分，其位于甘露糖单元的异头中心。该间隔区单元可包括氨基取代的烷氧基，任选地其为被保护的形式。例如，其可以具有分子式-0-(CH2)n-NH-PG，这里PG表示H或保护基；保护基通常是烷氧基羰基例如甲氧基羰基；叔-丁氧基羰基；或者节氧基羰基。因此NH-PG通常是氨基甲酸酯基团。在这些方法的一些实施方式中，该方法进一步包括通过在分子式(l)中的OW的氧和另外的糖之间形成的键将第二甘露糖单元连接到另外的糖。该糖可以是甘露糖单元或者包含甘露糖单元，并且在许多实施方式中，另外的糖通过l，6-a键被结合到第二甘露糖单元。在这些实施方式中，通常W是H或Ac，并且存在的每一个甘露糖单元的异头中心成"构型，以最严格类似于天然脑膜炎奈瑟氏菌的CPS。在其它方面，本发明提供分子式(r)的寡糖:其中，每一个Az独立地选自NH2、NHAc和N3;Z表示能被结合到蛋白质的间隔区部分，其可是被保护形式或未保护形式，并且其可被结合到蛋白质；每一个R'是独立的H，任选地取代的C1-C6烷基、或M，这里M是阳离子；X是O或CH2;每一R3和R4独立地选自H、Ac、Bn和其它保护基；以及W是H、或保护基、或磷酸酯、或连接另外糖单元的键。在本发明的这方面，一些实施方式包括通过第一甘露糖单元的C-l处a构型中的间隔区部分结合到寡糖的蛋白质。有时，蛋白质是选自白喉类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌(E."/z')LT、大肠杆菌ST、铜绿甲单胞菌外毒素(尸set^omomwflerwg!'"cwfl(rEPA))、或者破伤风类毒素的灭活细菌毒素，或者蛋白质可以是CRM197。在这些实施方式中的蛋白质可通过间隔区部分连接到分子式(l)中的寡糖，所述间隔区部分包括羟基或胺，其中任何一个任选地被保护或任选地结合到蛋白。在该方面的一些实施方式中，W是酰基，并且W是H。分子式(i)的可选的或优选的实施方式也适用于分子式(r)。在某些方面，本发明提供合成o;-连接的甘露糖单元的寡糖的方法，其包括在Mitsunobu反应条件下，将含有分子式(2)的甘露糖单元与分子式(3)的延长单体相结合，在分子式(2)中，W是C1-C6酰基或H，R1、R3、R4、Az和Z按照权利要求15所定义；在分子式(3)中，RX表示C1-C6酰基，且M表示H或阳离子；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>以生产含有由1，6-a键连接的至少两个氮杂取代的甘露糖单元的寡糖。在该方法的一些实施方式中，Mitsunobu条件包括使用二异丙基偶氮二羰酸酯(DIAD)或二乙基偶氮二羰酸酯(DEAD)和三苯基膦或取代的三苯基膦例如三(对-氯苯基)膦。在一些实施方式中，使用DIAD和三(对-氯苯基)膦，并且过量使用三乙胺。在某些实施方式中，Mitsunobu反应条件被维持一段延长的时间，并且产物是分子式(4)的寡糖，其中，p是从l到20的整数。在许多这些实施方式中，每一个Az表示NHAc或者N3。在这些实施方式的一些中，p是l-10，而在另一些中，p是大约l-5或者p是2-4。在这些实施方式的某些中，本发明的方法进一步包括将分子式(4)的寡糖结合到蛋白质的方法。任选地，这通过Z进行，所述Z通常为被选择可与这类蛋白质结合的间隔区部分。在这些实施方式的一些中，蛋白质是选自白喉类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、铜绿甲单胞菌外毒素(rEPA)、或者破伤风类毒素的灭活细菌毒素。在其它实施方式中，蛋白质是CRM197。在其它方面，本发明提供通过前述方法制备的寡糖。通过这些方法制备的寡糖化合物是免疫原性化合物，并且一般在被治疗的哺乳动物中诱导免疫原性应答，该免疫原性应答提供了对脑膜炎奈瑟氏菌引起的感染的至少部分免疫性。在进一步其它的实施方式中，本发明一般通过给予哺乳动物，提供使用本发明的任何寡糖化合物诱导免疫原性应答的方法。在许多实施方式中，这些化合物被用作A型脑膜炎疫苗成分；因此，该方法通常包括将有效量的疫苗成分施用给对象，从而提供免疫原性应答。所述免疫原性应答在对象中提供对A型脑膜炎奈瑟氏菌引起的脑膜炎的至少部分抗性或免疫性。本发明也提供了药学组合物，其包括与至少一种药学可接受的赋性剂混合的至少一种本发明的寡糖，以提供免疫原性的药学组合物。在一些实施方式中，这些组合物因此是包括含有本发明任意化合物的A型脑膜炎疫苗的疫苗。在许多实施方式中，疫苗包括至少一种结合到蛋白质的寡糖。又在其它方面，本发明提供制造可用于制备免疫原性寡糖的甘露糖衍生物的方法，其包括本发明那些方法。这些方法包括用亲电体环化分子式(2)的化合物来形成分子式(3)的化合物，其中R2、R3、R"和I^的每一个独立地为H或保护基；并且El表示源自亲电体的残余部分。在某些实施方式中，该方法包括另外的步骤，该另外的步骤包括用磷基团取代E1的步骤。所述磷基团一般为膦酸酯，在一些实施方式中，本发明也提供用氮化物取代分子式(2)或分子式(3)的化合物中的Oie的方法。在优选的实施方式中，0112的取代包括Mitsunobu反应。在一些这样的实施方式中，磷酰基氮化物提供了用于Mitsunobu反应的氮化物。在进一步其它的方面，本发明提供改进的方法以制备2-叠氮-2-脱氧-D-吡喃甘露糖，该方法包括在1，3,4，6-四-0-酰基-吡喃葡萄糖衍生物的位置2形成三氟甲磺酸酯；和用氮化物亲核体取代三氟甲磺酸酯。也可使用制造这些化合物的其它方法，该改进的方法在产物逐步生产(work-up)和分离过程中提供最小化暴露于湿气的预防措施。这导致比已知方法极大提高的产率，例如，Popelova等.,CaAoA>^ra&A仏(2005)340:161-166。在优选的实施方式中，1,3,4,6-四-O-酰基-吡喃葡萄糖衍生物是1，3，4,6-四-0-乙酰基-吡喃葡萄糖，并且产物为2-叠氮-l，3,4，6-四-0-酰基-吡喃甘露糖。在其它方面，本发明提供可诱导针对A型脑膜炎的保护性抗体的免疫原性组合物，其包括具有至少两个糖单元的寡糖，所述糖单元一般为甘露糖单元，其通过稳定化的含磷键彼此共价结合。在许多这样的实施方式中，可以为甘露糖单元的至少一个糖单元，在其异头中心包括ce-连接的间隔区部分。所述稳定化的含磷键可包括膦酸酯。在某些实施方式中，这些寡糖包括至少两个通过稳定化的含磷键彼此共价结合的甘露糖单元。在许多实施方式中，寡糖被结合到蛋白质。可使用许多蛋白质，例如前面描述作为适当的载体蛋白的那些蛋白质，但是在优选的实施方式中，蛋白质不是清蛋白。在一些实施方式中，本发明的免疫原性组合物包括至少两种不同的寡糖部分。在许多实施方式中，在两个糖之间的稳定化含磷键包括膦酸酯。在许多这类的实施方式中，膦酸酯键是通过Mitsunobu反应形成的1,6-键，在某些实施方式中，任意前述组合物的寡糖包括至少一个甘露糖单元，其包括在异头中心的a-连接的间隔区部分。在本发明的一些免疫原性组合物中，组合物包括至少两种不同的寡糖，它们对至少两种脑膜炎球菌免疫型是特异性的。该组合物也包括其它的抗原化合物，在一些实施方式中，组合物进一步包括月巿炎链球菌(5^e;^ococc"s尸"ewwom-ae)抗原。该抗原在一些实施方式中是多糖，并且在许多这些实施方式中，该多糖被结合到蛋白质。在一些实施方式中，本发明的组合物也包括至少一种源自血清型A、B、C、W135或Y的脑膜炎的抗原。在一些优选的实施方式中，该抗原源自血清型C、W135或Y的脑膜炎。本发明的组合物通常进一步包括佐剂，并且在一些实施方式中，佐剂是明矾。在本发明的许多组合物中，寡糖成分通过含有二羧酸或其衍生物的双官能试剂被结合到蛋白质。在许多实施方式中，该二羧酸包括己二酸或辛二酸或它们的衍生物。在其它实施方式中，该双官能试剂包括方酸酯。本发明范围内的膦酸酯连接的化合物的制备可通过制造受体单体和延长单体(elongatingmonomer)完成，所述受体单体和延长单体的每一个可以是被适当地修饰的吡喃甘露糖环，其被称为甘露糖单元。延长单体通过膦酸酯键被结合到受体以制造二糖。可修改延长单体以使其C6羟基被选择性地去保护；因此，如果需要更长的寡糖，二聚糖中的延长单体可成为受体。其可被去保护，而没有对C3和C4羟基去保护，所以C6羟基可被连接到另一延长单体的膦酸酯。这种过程可被重做必要的许多次，以提供期望长度的寡糖。图3描述如何连接受体单体和延长单体以形成具有两个甘露糖单元(即二糖)的寡糖，以及该二糖如何可通过C6羟基的去保护然后通过连接其它延长单体而进一步扩展。任选地，可将受体单体通过可切割的连接体结合到固体支持体，以有助于控制和分离。在这种情况下，寡糖可通过多次重复延长过程，保持连接于固体支持体，并且可最终被切割以释放期望长度的相对纯的寡糖产物。有时，间隔区部分Z被用于在合成期间将寡糖连接到固体支持体，然后被用于将寡糖结合到蛋白质，任选地通过修饰。本发明提供了制造含有两个或多个修饰的甘露糖单元的免疫原性寡糖、以及更长的寡糖或多糖分子的方法，和通过将寡糖和域多糖结合到蛋白质，把它们制成更多的免疫原性物质的方法。甘露糖单元是具有甘露糖环基础结构的吡喃糖环，但是其具有至少一些结构修饰。在许多实施方式中，本发明包括至少一个取代基，其中氮原子或其它杂原子被结合到环碳，代替甘露糖的一个羟基；如本文使用，考虑这类取代环为甘露糖单元，只要吡喃糖环上的取代基的排列与甘露糖上的立体中心的排列具有相同的相对立体化学。注意，甘露糖构型不限定在C-1的立体化学；C-l为甘露糖单元的异头中心，可以在Q!构型或e构型中。因此甘露糖单元可具有代替一个甘露糖羟基的连接的C、N或S原子，或者可具有两个或多个这类的修饰。这里提供D-甘露糖的结构和碳原子的编号，作为参考。D-甘露糖本发明的方法可使用具有D-甘露糖或L-甘露糖的绝对立体化学的甘露糖单元；在许多实施方式中，绝对立体化学是D-甘露糖的绝对立体化学。然而，本发明的寡糖可包括一种或多种具有L-甘露糖构型的甘露糖单元。当然，其也可连接到另外的糖或肽部分，例如，只要包括如本文描述连接的至少两个甘露糖单元。本发明的寡糖包括至少两个连接在一起的吡喃糖环，如果仅包括两个环，分子可被描述为二聚体；对于依次连接的三个环，可被称为三聚体，等等。然而，如本文使用的总称寡糖包括这些较小的实施方式，以及依次具有三个或更多、五个或更多、七个或更多、十个或更多、十五个或更多、二十或更多以及超过二十五个单体的更长聚合体类型。具有大约5个以上糖环的类型在本文中有时称为多糖。在许多实施方式中，寡糖包括至少三个甘露糖单元。不管包括的甘露糖单元的数目如何，有时期望将寡糖连接到其它的分子特征上，所以可用多种基团取代甘露糖单元，并且可通过一个或多个甘露糖单元、一般通过一个末端甘露糖单元将寡糖连接到另一部分。在一些实施方式中，将寡糖结合到蛋白是有益的，并且这些复合糖形式特别包括在本发明内。一般地，通过将目标蛋白质结合到在寡糖的第一甘露糖的C-l处连接的间隔区部分上的官能团，形成复合糖，并且间隔区部分在a构型中。在许多实施方式中，期望将保护基或其它官能度结合到甘露糖单元上的一个或多个杂原子取代基上。在一些优选的实施方式中，杂原子取代基选自OH、0Ac、NH2、N3、NHAc和被连接到保护基或蛋白质的O、N或S。—般地，甘露糖单元通过1,6-键连接。1,6-键指，通过不包括间插糖环的键(linkage),将第二甘露糖单元的C-l碳——异头中心，直接或间接连接到第一甘露糖单元的C-6碳。一般地，两个甘露糖单元之间的键将包括至少两个原子，通常是在甘露糖单元碳原子之间的两个或更多非碳原子。在许多实施方式中，该键具有下述通用形式:这里，D、E和F的每一个表示选自O、N、S、Si和P的杂原子，并且每一个四氢吡喃环表示甘露糖单元的环。在一些实施方式中，E表示磷原子，其通常处于磷酸酯或膦酸酯的氧化态。典型地，该式中的D和F的至少一个是氧(O)，在一些实施方式中，D和F都是氧。具体的实施方式包括其中D-E-F表示0-P(0)-0或C-P(0)-0或O-P(O)-C的那些。有时，D-E-F优选为含有-CH2-P(0)-0-的键。在一些实施方式中，相邻甘露糖单元之间的键是1，6-o(l,6-alpha)键。对于甘露糖单元，1,6-a键指，相应于甘露糖异头中心碳的C-l上的非氢取代基，与C-2处非氢取代基为"反(anti)"相对立体化学关系。可选地，寡糖中一个或多个甘露糖单元可通过P键被连接。(在异头中心具有相对于甘露糖中C-2取代基为"顺式(syn)"的键的构型被称为/3键。)然而，化合物一般以Q!关系被连接在一起，而不管键本身的性质如何。下列结构阐明a键和^键取向之间的差异。本发明的许多实施方式包括氮杂取代的甘露糖单元，这意味着至少一个甘露糖羟基已用本文称为"氮杂"取代基的取代基所取代。这是这样的取代基，其中至少直接连接到甘露糖单元的原子是氮。氮杂取代基包括NH2和多种取代胺，包括烷基化胺和二院基化胺，以及酰化胺和二酰化胺，其中酰基包括杂酰基例如苄氧基羰基和甲氧基羰基，以及这类酰基，如乙酰基、甲酰基和苯甲酰基。氮杂取代基的其它实施方式包括N02和N3。本发明氮杂取代的甘露糖单元的一些实施方式具有在甘露糖环C-2上的氮杂取代基，并且优选的实施方式包括其中甘露糖单元上的氮杂取代基是NH2、N3或NHAc的化合物和方法。因此，在一些实施方式中，本发明的化合物和方法包括分子式(l)的部分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>其中，每一个Az表示氮杂取代基；每一R3和R4独立地表示H或保护基；W表示H、保护基或连接到另一糖单元的连接体；W和X中的一个是O，并且W和X中的另一个是CH2;n是1或2;当n是l时，Yn是OR，当n是2时，一个Y是K)并且另一Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M，这里M是阳离子；和Z是OR，、SR，、NR，或卣素，这里每一R，独立地是H或任选地取代的垸基、酰基、芳基、芳烷基、杂垸基、杂酰基、杂芳基或杂芳垸基；或者Z表示结合到另一糖单元的连接体或者结合到蛋白质的间隔区部分。优选的氮杂取代基是其中氮原子直接结合到甘露糖单元的那些氮杂取代基。这类取代基的实例包括N3、NH2、NH-垸基、NH-酰基、NH-芳基和类似取代基。任选地，这些取代基中的每一个N可以包括选自烷基、芳基和酰基的一个或两个基团，这里，每个烷基、酰基和芳基任选被取代。关于羟基、胺基和巯基，术语"被保护的"或"保护基"指这样的官能团形式——其用本领域技术人员己知的保护基被保护免于不期望的反应，例如在有机合成中的保护基(ProtectiveGroupsinOrganicSvnthesis沖所述的那些保护基，其可使用该文列出的方法添加或除去。被保护羟基的实例包括但不限于甲硅焼基醚，例如TBDMS或TBS，例如通过羟基与试剂反应而得到的那些，所述试剂例如但不限于，叔-丁基二甲基-氯硅垸、三甲基氯硅烷、三异丙基氯硅垸和三乙基氯硅烷；取代的甲基和乙基醚，例如但不限于甲氧基甲醚、甲硫基甲醚、卞氧基甲醚、叔-丁氧基甲醚、2-甲氧基乙氧基甲醚、四氢吡喃醚、1-乙氧基乙醚、烯丙醚和苄醚；酯，例如但不限于苯甲酰基、苯甲酰甲酸酯、甲酸酯、乙酸酯、三氯乙酸酯和三氟乙酸酯。被保护胺基的实例包括但不限于苄基或二苄基，酰胺例如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺和苯甲酰胺；二酰亚胺例如邻苯二甲酰亚胺和二硫代琥珀酰亚胺；和其它被保护胺基。在一些实施方式中，醇的保护基是苄基或乙酰基，并且本文中胺的典型保护基是乙酰基或苄基或叔丁基氨基甲酸酯。如本文使用的"保护基"包括本领域认为作为杂原子N、O和S的保护基的那些部分，例如在Greene,T.W.和Wuts,P.G.M.的参考书ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,2ded"WileyandSons(1991)中描述的，其通过引用被引入本文。乙酰基(Ac)是一个这类保护基，并且因为脑膜炎奈瑟氏菌的天然CPS通常是乙酰基化的，特别是在C-3位置，所以在本发明的一些实施方式中，一种或多种保护基是Ac;在一些优选的实施方式中，在至少一个甘露糖单元上的W代表Ac。在这些化合物的一些中，X和W的一个是CH2，而另外一个是O;例如，在一些实施方式中，X和W都是O，而在其它实施方式中，W是CH2，X是O。在是寡聚的并含有三个或更多甘露糖单元的本发明给定化合物中，可以存在键的不同实施方式；因此，两个通过含有膦酸酯的键连接在一起的甘露糖单元可经膦酸酯二酯键连接到第三个甘露糖单元，而不背离本发明。通常期望，将本发明的寡糖与另一分子、一般为蛋白质相结合。这些方法制成的结合物在本发明的范围内。因此糖与蛋白质的结合通常通过将活性双官能分子加入蛋白质，然后将衍生化的蛋白质暴露于糖而实现，这样，糖通过双官能试剂提供的连接体共价连接，该双官能试剂通常被结合于糖的一个羟基。然而，在本发明的化合物的受控合成中，包括特别设计用来将寡糖结合到蛋白的间隔区部分，是特别方便的。这样的间隔区部分可被结合到寡糖中任意一个甘露糖单元；然而，一般在末端甘露糖单元，或者在第一"受体"单体，或者在最后的"延长"单体。经常是在受体的C-l位置或延长单体的C-6位置，并且在分子式(l)的化合物中，其可以为Z表示的基团或者R6表示的基团。将寡糖结合到蛋白质的间隔区部分可包括多原子间隔区部分，以使寡糖的免疫原性表位更可用，因此更有效。可选地，例如，化合物例如分子式(l)表示的那些化合物中的Z可以是单个原子例如O或N或S，并且寡糖和蛋白质之间的间隔可由用于将寡糖和载体蛋白连接在一起的双官能试剂提供。适于用于本发明的复合糖的双功官试剂包括本领域已知的那些。这类双功官试剂实例包括二羧酸例如丙二酸、丁二酸、己二酸和辛二酸或其活化形式，以及方酸衍生物。试剂的这些类型特别方便于将其中间隔区部分包括胺的化合物连接到蛋白质。在一些实施方式中，间隔区部分长度上至少为两个或三个原子，尽管任选地其可以是单个原子或者其可以长得多；一个实例是分子式(l)的化合物，其中Z表示2-氨基乙氧基。该2-氨基乙氧基或其同源物可在结合延长单体之前被引入受体单体，并且任选地以被保护形式引入，所以其不参与接下来的反应。间隔区部分必须包括至少一个能被用来将寡糖结合到蛋白质的官能团，一般地，其包括用于该目标的杂原子N、O或S，虽然也考虑其它的基团，例如用于通过Diels-Alder反应结合的双烯或亲双烯体，或者用于通过酯或酰胺将蛋白质结合到寡糖的羧酸酯基团。在许多实施方式中，例如上面讨论的2-氨基乙氧基，间隔区部分包括用于该目标的氮；当该氮被引入时和在构建寡糖期间，其可以是被保护的，但是在寡糖构建完之后，在不破坏寡糖的条件下，其能够被可选择性地去保护。然后，间隔区部分的胺易于乙酰基化或垸基化，例如使用双官能试剂，其另一端被相似地结合于蛋白质。这样连接的顺序，即复合糖的部分先结合到双官能试剂，是不重要的，并且由从业者的判断所确定。间隔基的一些典型但是非限制性的实例包括-Het-(CH2)n-A、-Het-Ph-A、-Het-(CH2)n-Ph-(CH2)n-A和它们的取代形式，其中每一Het表示杂原子，通常为O、S或N;每一Ph表示苯基，任选被取代；每一n表示l-10的整数；A表示官能团或其残基，其能将间隔区连接到蛋白质，例如N、O或S，或者酯、酰胺、或其它含羰基的基团、二烯或亲二烯体。优选地，间隔区包括OR，、SR，或NR，2，这里每一R，独立地为H或任选地取代的垸基、酰基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂酰基、杂芳基或杂芳垸基，并且可进一步包括A。分子式(l)中的M可表示碱金属阳离子——选自Li、Na、K和Cs，或者铵盐NR/，这里每一R独立为H或C1-C6烷基或C1-C6杂烷基。可选地，其可表示任何其它的药学可接受的阳离子种类，如MgX或CaX，这里X表示卤素、羟基、乙酸基、三氟乙酸基、硫酸氢盐、碳酸氢盐或任意其它适当种类。在一些实施方式中，M是二价阳离子，并且被分子式(l)的两个分子所共享。本发明的方法提供合成本发明的寡糖化合物的方式。方法包括例如，以期望的方式将两个甘露糖单元结合到一起的方式，例如在两个甘露糖单元之间通过形成1,6-a键的方式。在1，6-a键是磷酸酯或膦酸酯的情况，例如分子式(l)的化合物，其中X是O，可通过Mitsunobu反应产生该键。Mitsunobu反应被描述于例如Campbell,D.A.,/(1992)57:6331-6335，并且涉及用试剂例如偶氮二羧酸酯——如DEAD或DIAD——和膦(如三苯基膦或三(对-氯苯基)膦)活化醇，然后用亲核体种类取代活化的O。在分子式(l)的化合物、其中X是O的情况下，亲核体通常为P-O种类，一般为膦酸酯或磷酸酯阴离子。在该发明的其它方面，使用Mitsunobu反应将氮杂取代基引入到糖基，在这种情况下，条件是相似的，只是亲核体为氮化物，氮化物可作为氮化物阴离子或作为三垸基甲硅垸基氮化物或磷酰基氮化物而被提供。本发明的方法也提供在例如分子式(1)的那些化合物的甘露糖单元上安装和修饰N-取代基(氮杂取代基)的方式。因此在一些实施方式中，本方法提供以适当的立体化学将氮杂取代基插入甘露糖单元的方式。一个这样的方法包括用N-取代基——典型为N3取代吡喃糖环上C-2羟基。用亲核取代反应可将其插入，但是在一些实施方式中，通过Mitsunobu型反应，在活化基例如偶氮二羧酸酯如DEAD或DIAD的帮助下将其插入。膦酰基氮化物例如二苯基膦酰基氮化物可提供该Mitsunobu反应的亲核体。在该反应中，本发明提供的具体改进包括使用膦酰基氮化物作为氮杂取代基的来源，并且引入基本无水的工作条件以避免产物的分解。在本文描述的条件下，甘露糖单元的2-叠氮基衍生物的产率相对于现有技术的方法得到实质性的提高。在一些优选实施方式中，本发明的寡糖的至少一个甘露糖单元是具有胺或乙酰化胺的氮杂取代的甘露糖，该取代通常在甘露糖单元的C-2位置。在本发明方法的一些实施方式中，为N3的氮杂取代基被插入，其可被还原，提供胺，并且在例如Greene和Wuts的前面关于保护基的参考书中描述的条件下，可乙酰化所述胺。将氮化物(N3)还原为NH2通过一般的方法容易实现，例如使用氢硼化镍，氢硼化镍可由氯化镍六水合物和氢硼化钠原位产生，如本文所描述。在一些实施方式中，本发明提供寡糖和制造寡糖的方法，其中寡糖包括氮杂取代甘露糖单元的重复系列；在许多实施方式中，每一个甘露糖单元具有氮杂取代基，典型为N3、NH2或NHAc，位于每一甘露糖单元的C-2位置——例如在分子式(l)的化合物中，Az将为N3、NH2或NHAc。任选地，在至少两个甘露糖单元之间的键是膦酸酯键，其可以是l，6-a键，例如分子式(l)的化合物中的1,6-of键，其中W是CH2，X是O。包括磷酸酯或膦酸酯的1,6-o;键，例如分子式(l)的化合物，其中W是CH2或者0，X是O，可通过上面描述的Mitsunobu反应形成。优选地，Mitsunobu在前面作为参考的Campbell描述的改进条件下进行。在另一方面，本发明提供改进的方法，以制造某些糖分子，所述糖分子可用于前面描述的寡糖的合成。因此，本发明提供合成某些膦酸酯-取代的单糖的方法。例如，可从葡萄糖获得的、分子式(2)的化合物，可被转化为用于形成分子式(l)所示的含膦酸酯的1,6-Q!键的膦酸酯的前体，其中W是CH2，X是O。本方法包括用亲电体环化分子式(2)的化合物，以形成分子式(3)的化合物。其中R2、R3、W和R6的每一个独立地为H或保护基；并且E1表示亲电体残余部分。用来进行环化的亲电体可以是汞盐，在这种情况下，在环化为分子式(3)的化合物之后，亲电体残余部分一般为HgX，这里X为卤素、乙酸基或类似物。通过用碘处理，汞可被取代，得到分子式(3)的化合物，其中El是I。然后可用磷亲核体取代碘化物；例如，用三烷基亚磷酸盐处理，直接取代碘化物，并且产生二烷基膦酸酯。其它亲电体也可以用来进行环化；例如，卤化环化是已知的，将直接提供卤化物作为El，其可被取代。相似地，可使用方法，从而烯烃可被环氧化而具有正确的立体化学，使得环氧化物开环可产生吡喃环，和分子式(3)的化合物，其中E1是0H。然后该OH可被转化为卤化物或可取代的磺酸酯，例如三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或甲磺酰酯，以及可用三乙基亚磷酸盐按前面描述的引入磷，或者可通过使用阴离子P种类例如二乙基亚磷酸钠阴离子的直接亲核取代，将其引入。这提供了分子式(3)的葡萄糖衍生物，而不是N-取代的甘露糖单元；因此本发明进一步提供将分子式(2)或分子式(3)中的OW转化为具有期望"轴"取向的氮杂取代基的方法。氮取代基的引入通常通过分子式(3)的化合物与活化剂反应，形成其中W是可取代基团的化合物例如三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或甲磺酰酯而实现。因为在(2)中的这种取代将导致烯丙基的重排，所以这种转化通常在分子式(3)的化合物中进行。虽然可能通过普通的亲核取代进行这类反应，但在本发明的一个实施方式中，这种用氮杂取代基取代0RM吏用Mitsunobu反应进行。在优选的实施方式中，Mitsunobu反应使用磷酰基氮化物作为杂氮取代基的来源。因此，该反应提供非常有效的方式将容易得到的葡萄糖源化合物例如(2)转化为2-脱氧-2-杂氮-取代的甘露糖衍生物，其中2-杂氮-取代基是氮化物。然后可将氮化物还原为胺，例如用氢硼化镍进行处理，并且可根据需要将胺官能化或保护。在本发明的许多实施方式中，用保护基立刻将胺乙酰基化，通常用乙酰基(Ac)，因为乙酰基可作为保护基并且也存在于脑膜炎奈瑟氏菌的CPS的甘露糖单元中。在另一方面，本发明提供了制造保护形式的2-杂氮-取代的甘露糖衍生物的极大改进的方法。该方法包括通过将2-羟基转化为三氟甲磺酸酯，然后用氮化物取代三氟甲磺酸酯，来取代以其它方式被保护的吡喃葡萄糖的2-羟基。亲核取代使中心转向，因此将吡喃葡萄糖转化为吡喃甘露糖。虽然取代本身已被报道，但其使用标准的条件，产生非常差的分离产率。在本发明中，已发现，使用容易获得的1,3，4,6-四_0_酰基_吡喃葡萄糖可得到期望产物的高产率，只要反应的进程在基本无水下进行。因此，在极性非质子溶剂例如DMF或NMP中，用氮化物阴离子取代三氟甲磺酸酯；然后，在直接运用到色谱柱之前，可以部分浓縮该反应浓縮物，而不是使用普通的水性/有机萃取过程去除大多数溶剂和盐。使用这样非水过程，产物可以以高产率从柱洗脱。下面的描述提供制造本发明的某些化合物的方法的更多细节。起始单体受体的一个实例——下面示出的化合物XIV，被描述于Berkin,A.等，C/訓.(2002)8:4424-4433中。作为选择，可使用下列次序<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>当在异头中心使用二苄基保护的化合物引入间隔区时，得到大约l:l的异头物混合物。如果改用乙酸酯取代苄醚，那么仅得到痕量的/异头物，并且产生分离产率为86%的期望的《异头物。因此，该方法提供在该中心产生期望a构型的有效方式，该中心通常为与将寡糖结合到载体蛋白的间隔区相连接的中心。a构型是期望的，因为其与目标生物的天然CPS的所有o;骨架最匹配。也发现，0异头物在乙硫基-糖苷取代步骤具有较小的活性。然而，乙酸酯有时引起后来的系列困难，所以在一些实施方式中，在这一步使用苄醚。使用NaBH4/催化剂NiCl2-6H20将完全保护的2-氮杂甘露糖中间体的叠氮基再还原为胺，并用乙酸酐乙酰化胺，两个步骤的产率为85%。最后，用TBAF除去甲硅烷基醚，得到99%产率的起始结构单元受体。所需延长单元的方便合成在下面方案1-3中示出，例如，这允许制备具有不同保护基的延长单元。方案l(i)MeOH/可力丁(ii)BnBr/KOH,HOAc(70%)，NaOMeMeOH(iii)BuLi/甲基三苯基溴化锬(iv)Hg(OAc)2,KC1获得化合物I并将其用作异头物的混合物，并且在七个步骤中从葡萄糖得到。其通过与甲基溴代三苯基膦的Wittig反应被延长，例如，得到91%产率的链烯烃。从D-阿糖制备该链烯烃的另外方法使用两个碳延长，其涉及加入二乙烯基锌。化合物II的汞环化只得到o;-C-糖苷，尽管相应的四-O-苄基保护的烯烃产生异头物的混合物。可以使用环化这些种类的可选方法，例如卤醚化和环氧化/亲电体开环。将乙酸汞化合物转化为相应的氯化汞衍生物，其被分离。接下来，用碘取代氯化汞，通过用I2处理得到极好的产率。方案2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>(i)12(ii)TBDMSCl/pyr/咪唑(iii)P(OEt)3为了避免在接下来的步骤中形成环磷酸酯，首先保护C2羟基为甲硅烷基醚。通过用三乙基亚磷酸酯处理一代碘化物V，得到C-膦酸酯VII，获得77。/。产率的VI。然后使用氟化四丁基铵(TBAF)从C2羟基上切割下甲硅烷基醚，产率为99%。通过与氮化物的取代反应，然后通过如方案3中所示的还原和乙酰化，引入轴向乙酰氨基基团。该取代使C-2中心转向，提供在天然荚膜多糖中发现的C-2乙酰胺取代基的轴取向。通过制备C-2羟基的三氟甲磺酸酯和用氮化物阴离子将其取代，将该氮化物以低产量引入。然而，通过使用Mitsunobu条件，和二苯基磷酰氮化物(DPPA)作为氮化物来源，得到高产率(86%)的叠氮基衍生物IX。为了在0-6处引入可选择性去除的保护基，用乙酸酯取代VIII的第一苄基醚，使用标准的乙酸水解条件，得到84%的产率；可省略该步骤，在这种情况下，所有苄基醚可被立即切割。省略乙酸水解縮短了合成，但是更难以使用C-6羟基进行进一步的延长或其它的官能化作用，尽管将苄基换为乙酰基也可在延长步骤之后进行。当乙酸酐和乙酸(1/1)的混合物被与硫酸一起使用时，乙酸水解反应进行得更好。在存在氯化镍六水合物下用氢硼化钠还原氮化物，并用乙酸酐乙酰基化所形成的胺，得到69%产率的化合物乂。方案3阐述本发明内的延长单体的完成，其为2-氮杂甘露糖单元。对于延长C-膦酸酯单体的构建，使用已公开方法的修改形式。参见Casero,F.等，Org.(1996)61:3428-3432。在前体VI脱甲硅基以提供2-OH化合物VII之后，使用Mitsunobu条件进行氮化物取代，得到2-叠氮基-2-脱氧-卩比喃甘露糖苷VIII(86%)。通过乙酸水解以提供6-0-乙酸酯IX(84。/。)，引入正交的保护基，以便后来的6-0延长。氮化物还原、然后乙酰化给出X(76。/。)，从X除去乙酯，产生带有游离膦酸的延长单体XI。对于许多实施方式，优选偶联膦酸的单酯，以便产物仍然受保护为膦酸酯。这些化合物可在两步中制成，如下面示出的XI到XIII的转化。注意，如果需要更长的寡糖，那么可推迟氮化物的还原，直到另外的甘露糖单元被装入，这样所有的氮化物可被还原并且同时乙酰化所产生的胺。方案3如在上面方案3所示，使用甲基取代膦酸衍生物上的乙基保护基，以在寡糖被构建后便于去除。在形成连接的二糖之后，在切割膦酸乙酯所需要的条件下该连接(或键)为相对易分解的。因此通过用溴代三甲基硅烷(TMSBr)处理，乙基被定量除去，并且使用乙酸和三甲基原乙酸酯将膦酸产物转化为相应的膦酸二甲酯，产率为84%。该反应必须被仔细监控，因为在延长的反应期间，脱乙酰作用是竞争副反应。用三乙胺(TEA)和苯硫酚处理膦酸二甲酯，有效地获得单膦酸甲酯xm，产率为82%。方案4阐述在两个甘露糖单元之间形成膦酸酯键的偶联反应。DCC和Mitsunobu条件都已被报道将膦酸酯偶联到醇如受体单体上，产率在50-70%范围内。Pozsgay等(参见，A.Berkin,B.Coxon和V.Pozsgay,C/em./，2002,8,4424.)。然而，当受体已经包含膦酸酯时，产率急剧下降，这可能限制这类条件提供所需三聚体、四聚体和其它更长多糖的能力。在目前情况下的Mitsunobu条件，使用Ph3P和DIAD，得到XV的良好产率(47。/。)。然而，使用Mitsunobu条件的修改形式，如在Campbell,Og.CA亂(1992)57:6331-6335描述的，可实现好得多的产率。Campbell的条件，使用三(4-氯苯基)膦和大量过量的三乙胺，得到88。/。产率的XV。在该反应中，当仔细排除可与弱亲核膦酸盐阴离子竞争的其它亲核类型时，可得到最好的产率。方案4索弓l:i)(pCIPh)3P,DIAD，Et3N，THF;ii)KOH，MeOH;iii)PhSH,DBU，CH3CN。使用上面描述的Mitsunobu条件，发现三聚体形成的产率可比得上甚至高于二聚体形成的产率。通过脱乙酰作用将二聚体XV转化为新的受体(—XVI)。然后，在XVI和XIII之间该修改的Mitsunobu反应提供92%产率的三聚体XVII。通过MS和NMR证明产物的成分，后者NMR具有一定的复杂性，原因在于由磷的手性产生的非对映异构体膦酸酯。化合物XVII被去乙酰基化，这产生可结合到其它延长单体的新的受体XVIII。在这步和接下来除去膦酸甲酯之后，破坏磷中心的手性，并且化合物XIX的NMR数据反映不存在磷非对映异构体。也发现，通过延长受体XIV和延长单体XIII的混合物在Mitsunobu条件的暴露时间，并且在存在一些过量XIII下，反应提供更长的单体。因此，在该反应条件下，从引入的延长单体切割C-6乙酰基在某一速度下在原位进行；这提供新的受体分子。因此在某些程度下，例如，通过延长暴露于Mitsunobu反应，进行将XVI转化为XVI，并且在那些条件下在存在过量xm下，形成xvn;等等，以产生更高的寡聚物。因此，该反应提供了制造含有保护形式的多个甘露糖单元的寡聚物的方式，而不需要逐步的去保护/分离过程，并且使本发明合成的免疫原性寡糖具有大小分布。在一些实施方式中，这已表明，主要提供四-和五-甘露糖寡糖，具有少量的更长寡聚物。因此，在本发明中提供合成更长寡聚物化合物的高度有效的方法。本发明也提供从容易获得的前体1,3,4，6-四-0-乙酰基-吡喃葡萄糖，合成2-叠氮基-2-脱氧-D-吡喃甘露糖的简单又改进的方法，如方案5阐述。该中间体可用于合成许多本发明的甘露糖单元。方案5XX!I.XXIHXXIVi,(TfO)Apyrii,NaN3在合成保护的2-叠氮基甘露糖化合物的尝试中，使用三氟甲磺酸酐(triflicanhydride)将1,3,4，6-四-0-乙酰基-吡喃葡萄糖转化为其2-0-三氟甲磺酸酯，并且用NaN3处理三氟甲磺酸酯。根据TCL和MALDI-TOF-ms，2-叠氮基产物以高产率形成，但是明显地，在典型的含水生产期间，其大量分解，分离的产率仅20%。然而，当反应在没有使用水下进行时，产率急剧上升。因此，用于取代的溶剂的大多数DMF在减压下被除去，并且将残留物转移到干燥柱中，该干燥柱含有预干燥的二氧化硅在干燥甲苯中的浆体。使用在甲苯中增加的乙酸乙酯梯度洗脱产物。在纯化后，产物是相对稳定的。1，3,4,6-四-0-乙酰基吡喃葡萄糖原料很容易用一锅合成法(onepotsynthesis)从葡萄糖大规模合成，并且使用标准的条件以97%的产率获得中间体三氟甲磺酸酯。从所述的转化物的分离产率强烈依赖于工作条件的无水程度通过使用预干燥的玻璃器皿和前面描述的预干燥的二氧化硅除去水，对于最优化的产率是必需的。通过在生产期间和硅胶层析法期间，最小化在湿气中的暴露，获得的可重复产率为60%或更好。四乙酸酯产物显示出在储存期间分解的一些倾向。然而，通过用EtSH/BF3-Et20处理转化为其1-乙硫基糖苷后，其变得十分稳定。接下来用醇盐处理，以除去乙酸酯基团，如方案6所示，并且用叔-丁基二甲基甲硅烷基(TBS)基团，选择性地保护伯羟基。两个仲羟基被保护为苄酯，但是这里和整个过程的其它许多步骤中可使用各种各样不同的保护基。然后，用连接体取代一SEt基团，连接体可被用来将最终的寡糖结合到蛋白质。可选地，其可被用来在装配寡糖时将受体单体结合到固体支撑体。在该情况下，在异头位置将被保护的氨乙基引入；然而，可以使用多种适于结合寡糖的连接基团，并且本领域的普通技术人员，可容易选择和使用其它的基团。方案6XXVXXViXXVII二聚体可被用作免疫原，不用进一步的延长，或者可以制备和使用更长的寡聚物。对于二聚体和三聚体，通过标准的水解除去C6位置的乙酰基。使用1,8-二氮杂-7-双环[5.4.0]十一碳烯(DBU)作为碱以及苯硫酚，切割膦酸酯的甲酯，以实现亲核去甲基化作用。然后经由标准的还原氢化，切割苄醚连同苄氧基羰基，这使用活性炭上的钯作为催化剂。为了使反应进行彻底，加入含水HC1，以便形成的胺被质子化以形成氯化氢，这减少了催化剂中毒的倾向。可将本发明的寡糖施用给哺乳动物，以诱导免疫原性应答；它们可按照前面描述的使用，典型地在至少部分去保护以后使用。它们也可被部分或完全乙酰化，以加宽诱导出的免疫应答谱。目标生物体的CPS基本上在C-3羟基处乙酰化；因此本合成方法的灵活性使其可能制备含有一个或多个乙酰基团的化合物，并且特别可能制备二聚体、三聚体和在C-3羟基处部分或完全乙酰化的更高的寡聚物，或者这些的混合物。代替地或另外地，使用膦酸酯键稳定磷酸二酯，如前面描述的，其可能通过在合成处理期间上至和任选地在将寡糖结合到蛋白质的步骤中，加入氮化物基团如C-2氮杂取代基，稳定磷酸二酯至可用的程度。这种稳定是诱导性的，但是足够提高中间体的工作稳定性超过相应的NHAc化合物的工作稳定性。在氮化物完成其目标之后，可用硼氢化镍将其还原，并用乙酸酐或相似的酰化剂酰化，如本文所描述。本发明的寡聚物化合物因此可引入磷酸二酯键至一定程度，如上描述，并且通过一般的方法和本文描述的那些方法引入磷酸二酯。为了具有使两个目标分子具有或不具有乙酸酯的选择，保护基策略基于乙酸酯作为永久保护基。为了稳定异头磷酸二酯键，使用氮化物作为乙酰氨基的前体，尽可能进入合成，如下面方案7中阐述的。氮化物的吸电子性能和缺少参与作用(participatingeffect)强烈地保护该键。而且，在使用二甲氧基三苯甲基作为6-0H的临时保护基的开始问题之后，我们使用TBDMS(叔-丁基二甲基甲硅烷基醚，有时称为TBS)。TBDMS醚以良好的产率被切割下来，由于乙酰基移动或易分解的磷酸二酯键的切割，产生很小的问题。在先前的C-膦酸酯合成中成功用来将TBDMS醚去保护的TBAF不能被使用，原因在于如果使用TREAT-HF，乙酰基移动相当缓慢(特别当在位置2具有氮化物时)但可靠。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>对于一个有效的模块合成，需要三个单糖结构单元；具有初始单体6-OH受体的间隔区、具有临时6-OH保护的o;-H-膦酸酯延长单体(供体l)和在伯位置磷酸化的封端a-H-膦酸酯单体(供体2)。为了获得在C-6位置具有磷酸酯的目标分子，如这里以三聚寡糖为示例，含有二苄基保护的磷酸酯的供体被使用，这是因为使用amidite化学的C-6羟基的连接后(post-linkage)修饰尝试是不成功的。为了简化合成，从相同的前体XXVIII合成所有三个单元，如上面方案7所示。使用传统的方法合成原料。为了制造受体，将原料偶联到苄氧基羰基保护的乙醇胺间隔区，产率为86%，使用TREAT-HF除去TBDMS-醚得到97%产率的受体XXIX。首先通过使用NIS作为促进剂和水作为受体在-2(TC下糖基化，水解硫代葡糖苷，合成供体l。仅得到期望的a异头物，产率为82%。如果在室温下反应，形成大百分比的/5型。然后，使用PCV咪唑，膦羧化该化合物，得到97M产率的XXX。因此，本发明包括在低温下例如低于室温下制备a异头物，优选在低于(TC进行，更优选地在低于-l(TC，例如-2(TC或更低。为了合成具有H-膦酸酯——其可用于加入通过磷酸二酯键与本发明寡糖连接的甘露糖单元——的供体甘露糖单元，TBDMS-醚以75%的产率被切割，并使用amidite化学，磷酸化羟基，以在C-6处得到苄基保护的磷酸酯(67%)。以与供体l相同的方式通过偶联水，水解乙基硫代糖苷(79%)，然后将其膦酸化，得到92%产率的11-膦酸酯供体甘露糖单元XXXI。使用传统的H-膦酸酯化学，用新戊酰氯促进的浓縮，将延长单体偶联到受体，如下面方案8所阐述。使用元素碘和水，氧化H-膦酸酯二酯，以提供磷酸二酯。以良好的产率(96%)获得二聚物。方案8<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>通过用TREAT-HF对C-6羟基去保护和反复加入延长单体，实现延长到三糖；这里保护基策略与在上面用于膦酸酯键构建的方案中示例的保护基策略的相容性，使两种类型的键在给定的寡糖中混合或匹配。这里实例阐述了用供体分子XXX和XXXI延长，提供在最后的甘露糖单元上具有C-6羟基，或者在那个位置上具有C-6O-磷酸酯的三聚寡糖。方案9这里R是OH或者二苄基磷酸酯。为了获得三糖，再次使用TREAT-HF，以91%的产率除去二糖上的TBDMS-醚。接下来用与偶联二糖所使用的相同条件偶联两个供体，导致分别以62%和59%的产率形成两个三糖。在第二或后来偶联期间获得的产率低于从第一步偶联获得的产率，如Pozsgay等(参见，A.Berkin，B.Coxon和V.Pozsgay，C/em.2002，8，4424.)观察到的。因此，在优选的实施方式中，寡糖中两个相邻的甘露糖单元之间的至少一些键一般包括膦酸酯，而不是磷酸二酯。本发明的两种形式寡聚物上的氮化物在R'或其相当位置例如膦酸酯寡聚物的二聚物和三聚物中的R"基团处，也可包括另外的保护形式的磷酸酯。这被任选地引入，因为天然CPS中的末端甘露糖单元可被磷酸化，并且使用传统化学可将相应的磷酰基团引入作为二节基磷酸酯。然后，例如，苄基可以随C-3和/或C-4位置的苄醚被除去，或者苄基可以随可用来保护第一甘露糖单元位置1的间隔区部分氨基的苄氧基羰基的还原性切割而被除去。苄基膦酸酯不干扰产生寡聚物所需要的其它反应。例如，使用硼氢化钠和催化量的氯化镍六水合物，在某些含有该基团的化合物中的氮化物被成功地还原为胺，并且使用乙酸酐将所形成的胺乙酰化，得到相应的氨酰基衍生物。当三聚磷酸二酯连接的化合物中的甘露糖单元的末端基团为OTBDMS时，这个反应产生89%的产率，当末端基团为二苄基磷酸酯时，产率为64%。1R=OAc2R=OHR，=TBDMSO或磷.1R"=NHZ2R"=NH2两个三糖以不同的顺序去保护。为了得到目标分子1和2，首先使用还原性氢化去保护Z-基团(83。/。)。为了避免还原性氢化期间磷酸二酯键的降解带来的问题，将阳离子交换树脂加入到混合物，得到良好的结果。再次使用TREAT-HF除去TBDMS-醚，给出85%产率的1。在标准甲醇钠/甲醇条件下，切割乙酸酯。对于目标分子3，以与先前1去保护相同的方式除去Z(85。/。)，为了得到4，在还原性氢化之前(64%)除去乙酸酯(80%)。在上述方案中描述的方法也可用于制备具有C-膦酸酯的化合物，例如本文描述的分子式(l)或(l')的那些化合物。使用化合物作为抗原通过上述方法制备的寡糖是免疫原性的，并且可用于诱导保护免于脑膜炎奈瑟氏菌感染的免疫应答，如在疫苗中。具体而言，具有上述分子式(l)所示结构的寡糖如果被投药给哺乳动物，能诱导免疫原性应答，并且因此施用包括分子式(l)的寡糖的组合物可用于诱导抗体的形成和/或提供免疫原性应答，以及提供对A型脑膜炎奈瑟氏菌感染的至少部分抗性或部分免疫性。抗体和/或免疫原性应答提供保护免于A型脑膜炎奈瑟氏菌感染。包括分子式(l)的部分的化合物，特别是W是CH2或0，X是O并且Az是NHAc的那些化合物，可用作如分子式(4)的化合物的疫苗成分。当被结合到蛋白质时，这些化合物是特别有用的，并且任选地，分子式(1)的Z基团可被用来将分子式(1)的寡糖结合到蛋白质。同样地，在分子式的其它化合物中，本发明寡糖的第一甘露糖单元的C-l位置的相应基团，可以是能被用来将该化合物结合到载体蛋白，以提高其免疫原性性能的部分。尽管选择通过Z连接，然而，本发明的化合物和具体包括分子式(1)或分子式(4)结构的化合物可被通过其它方法连接到载体蛋白，例如通过一个或多个羟基或者通过代替乙酰基连接在其中一个甘露糖单元的一个乙酰胺上的酰基。这类可选的连接机制在本发明的范围内，只要寡糖的C-l(异头)中心保持所需的a构型。优选地，这类寡糖在两个甘露糖单元之间包括至少一个膦酸酯键。因此，本发明的一个方面涉及疫苗，其包含作为活性成分的免疫原性有效量的如本文描述的免疫原性寡糖。可将寡糖(一种或多种)引入宿主，包括人，或者单独引入，或者结合到载体例如蛋白质而引入，或以甘露糖单元或其它糖类的均聚物或杂聚物而引入。在一些实施方式中，它们被用作复合糖，并且根据其对寡糖抗原的免疫原性应答的增强能力，选择寡糖所结合的蛋白质有时优选在待被治疗的哺乳动物中已诱导免疫应答的蛋白质。复合糖具有免疫活性增强的优点，并且另外具有诱导抗体和/或CTL的能力，所述抗体和/或CTL与病毒或肿瘤细胞的不同抗原决定子反应。本发明的免疫原性组合物包括至少一个本发明的化合物，并且可任选地包括一个以上这类化合物。因此，有时期望将本发明的两种或多种化合物混合在一起，以扩大诱导出的免疫原性应答。例如，经常期望将化合物——其中ie是H——与化合物——其中ie是Ac——相结合，因为目标生物体的CPS是部分而不是全部地在这个位置被乙酰化。因此，在一些实施方式中，免疫原性组合物包括至少两种、任选三种或多种这类的免疫原性化合物和/或这类化合物的蛋白质偶联物。相似地，当作为复合糖被输送时，载体蛋白可影响免疫原性应答，并且甚至影响抗体的准确属性，所述抗体是由本发明的一种或多种化合物治疗动物时产生的。因此，本发明包括含有一种以上载体蛋白的组合物，无论它们是否含有两种或多种寡糖。可用的载体蛋白在本领域是公知的，包括，例如甲状腺球蛋白、清蛋白例如人血清清蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、聚氨基酸例如聚(赖氨酸谷氨酸)、流感病毒、乙型肝炎病毒核心蛋白、乙型肝炎病毒重组疫苗和类似物。也可使用细菌外膜蛋白，例如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、运铁结合蛋白、肺松解术(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、或肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)。其它蛋白例如卵清蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清清蛋白(BSA)或纯化的结核菌素(PPD)蛋白衍生物也可被用作载体蛋白。载体蛋白优选非毒性和非反应原性并且可以获得充足数量和纯度的蛋白。载体蛋白应当遵从标准的结合方法。在本发明优选的实施方式中，从白喉棒状杆菌(Coo^"e^"en'aA;p/^m'ae)培养物纯化并且使用甲醛化学去毒的白喉毒素被用作载体蛋白。在其它实施方式中，使用CRM197。将寡糖结合到载体蛋白的方法是常规的，有技术的从业者使用传统的方法可产生含有本发明化合物的复合糖。指导在很多出版物也可获得，例如在美国专利4，356，170;4,619,828;5,153,312;5,422,427;和5,445，817中。在一个这类实施方式中，使用2-氨基乙氧基在第一甘露糖单元的C-l位置作为间隔区部分和磷酸二酯键，并且使用辛二酸或方酸酯作为双官能试剂将间隔区部分连接到载体蛋白，并且使用CRM197作为载体蛋白，制备复合糖。根据MALDI-TOF质谱分析，这些偶联物在每个载体蛋白分子上平均包含大约五个寡糖分子。然而，通常期望寡糖载体蛋白的摩尔比为大约0.1到大约1，大约1-30:1或大约1-10:1的摩尔比在本发明的范围内，无论使用哪种载体蛋白。寡糖与载体蛋白的比例也可表述为两者之间的重量比例；通常优选大约1:1到1:500的比例。精确的比例依赖于蛋白质和寡糖的分子量的比例；对于更小的寡糖，有时使用1:5到1:200的重量比。在将荚膜多糖结合到载体蛋白之后，多糖-蛋白质偶联物可通过各种技术进行纯化(针对多糖-蛋白质偶联物的量进行富集)。纯化步骤的一个目标是从多糖-蛋白偶联物去除未结合多糖。用于纯化的一个方法，涉及在存在硫酸铵下进行超滤，其被描述于美国专利6,146,902。可选地，通过任意的许多标准技术，其中包括尺寸排阻色谱法、密度梯度离心法、疏水作用色谱法或硫酸铵分馏法以及其它方法，可从未反应的蛋白质和多糖中纯化出偶联物。参见，例如Anderson,P.W.等，/mmwwo/.(1986)137:1181-1186。也参见Jennings,H.J.等，/画腳/.(簡)127:1011-1018。本发明的疫苗包括至少一种本发明的免疫原性化合物，也可包括生理学上可耐受的(可接受的)稀释剂例如水、磷酸盐缓冲盐盐水或生理盐水，并且进一步一般包括佐剂。美国专利第6,869,607号提供用于蛋白质-结合免疫原的非离子佐剂，并且讨论了其它适用的佐剂，并且在此通过引用引入对那些佐剂的描述。物质例如弗罗因德不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾、硫酸铝、磷酸铝和它们的组合是本领域公知的作为佐剂的物质。也可用的是BAY、DC-chol、pcpp、单磷脂A、CpG、AS-21、霍乱毒素和甲酰甲硫氨酰肽，以及乳液制剂，其包括MF59、SAF、角鲨垸、吐温、pluronic-嵌段聚合物L121和成分例如单磷脂A、海藻糖二霉菌酸以及细胞壁骨架。也可包括细胞因子例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)。在本发明的一些实施方式中，明矾被用作佐剂。在用本文描述的组合物经由注射、气溶胶、口服、经皮或其它途径免疫之后，宿主的免疫系统通过产生大量对期望抗原特异性的CTL，对疫苗应答，并且宿主对后来脑膜炎奈瑟氏菌病原体的感染至少部分免疫。本发明的疫苗和药学组合物打算用于肠胃外、表面、口腔或局部给药。优选地，其被肠胃外给药例如静脉内、皮下、皮内或肌内给药。因此，本发明提供肠胃外给药的组合物，其包括溶解或悬浮于可接受载体的免疫原性部分的溶液，优选为主要含水载体。可使用多种含水载体，例如水、缓冲水、0.8%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸和类似物。可通过传统的灭菌技术将这些组合物灭菌，也可无菌过滤这些组合物。对形成的水溶液可进行包装以照其原样使用，或者进行冻干，在给药之前将冻干的制剂与无菌溶液结合。组合物可包含药学可接受的辅助物质，其近似生理条件所要求，例如pH调节剂和缓冲剂，渗透压调节剂、润湿剂和类似物，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸合三乙醇胺等。这类药学组合物的制备在本领域的普通技术范围内，标准参考书例如最新版本的Remington'sPharmaceuticalScience可进行指导，其被引入本文作为参考。在优选的实施方式中，大量水混合物中包含分子式(l)或分子式(4)的至少一个部分的疫苗组合物被配制为无菌、无致热原的缓冲盐水或含磷酸盐的溶液，其也可包括保存剂(或防腐剂)或者也可无保存剂。适当的保存剂包括例如苄醇、对羟基苯甲酸酯、乙基汞硫代水杨酸钠、氯丁醇和亚苄基苯扎氯铵。溶液优选为接近等压的，并且可用试剂例如酒石酸钠、氯化钠、丙二醇和磷酸钠调节其渗透压。药物制剂中，本发明的免疫原性寡糖的浓度可广泛变化，即，按重量计从在大约0.1%以下，通常在或至少大约0.1%至多达20%到50%或更多，并且主要根据流体体积、粘性等以及依照所选择的具体给药方式进行选择。化合物和组合物的人单位剂量形式一般包括于药物组合物中，其包括具有可接受载体、优选含水载体的人单位剂量，并且以本领域技术人员已知的流体体积施用，以将该组合物给药于人，而且根据对于被治疗的具体对象的普遍理解的原则进行调整。因此，在一实施方式中，本发明提供单位剂量的在适当量水溶液中的本发明疫苗成分，所述适当量的水溶液例如0.1-3ml，优选0.2-2ml。本发明的免疫原也可经由脂质体给药，这可用来在特定的组织中浓縮免疫原，所述特定的组织例如淋巴组织，或者增强免疫原的活性或输送特性。对于制备脂质体，多种方法是可行的，其被描述于例如Szoka等，j朋.iev.祝o如".5Zoe"g.(1980)9:467，美国专利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369号中。对于固体组合物，可使用传统的无毒性固体载体，其包括例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和类似物。对于口服给药，通过引入任何的通常使用的赋形剂，例如前面列出的那些载体，和单位剂量的活性成分——即，本发明的一种或多种化合物，无论其是否结合到蛋白质，形成药学可接受的无毒性组合物。对于气溶胶给药，优选以细分的形式，连同表面活性剂和推进剂，提供免疫原性化合物。当然，表面活性剂必须是无毒性的，并且优选可溶于推进剂。这类试剂的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸与脂肪族多元醇或其环式酸酐形成的酯或偏酯，所述脂肪酸例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸(olestericacid)或油酸。可使用混合的酯，例如混合的或天然的甘油酯。按组合物的重量计，表面活性剂可占0.1%到20%，优选地0.25%到5%。组合物的余量通常是推进剂。当需要时，也可包括载体，例如用卵磷脂用于鼻内输送。对于该用途的有效量依赖于例如寡糖组合物、其是否结合到蛋白质、给药方式、患者的体重和总体健康状况以及开处方医师的判断，但是一般地，初次免疫(即对于预防给药)的范围，对于70kg患者为从大约1.0/ig到大约5,000Mg肽(例如1.0Mg，1.5]Wg,2.0/xg,2.5/ig,3.0/ig,3.5/xg，4.0/xg,4.5/xg,5.0/xg，7.5Mg,10/xg,12.5Mg，15/xg,17.5/zg,20/zg,25/xg,30/xg,35^tg,40/xg,45/xg,50pg，75/xg,100/xg,250/zg，500/xg,750pig,1,000/ig,1,500]Ug,2,000^g,2,500pg，3,000/zg，3,500gg,4,0004，500/xg或5,000pg)。实际施用给对象的剂量通常根据每kg对象体重适当的量确定。例如，有效量可以是大约O.l到5Aig/kg体重。任选地，初次剂量之后，按照数周到数月的加强方案，给予从大约l.Opg到大约1，000/xg肽的加强剂量(例如1.02.0他2.5/ig，3.0jLtg，3.5pig,4.0/xg，4.5ptg,5.07.5/ig，1012.5pg，15pig，17.5jtxg,20jwg，25jLig,30/zg，3540jug,45/xg，50/xg，75#g,100Mg,250/ig，500/zg,750/ig,1,000/zg,1,500/ig，2,000/xg，2，500jiig，3，000jLtg,3,500/xg，4,000/zg,4,500/xg或5,000Mg)，这取决于通过测量患者血内特异性T细胞的活性所确定的患者的反应和状况。包含本发明的化合物的免疫原性组合物适合使用于成年人或儿童，并且在一些实施方式中，它们被施用给处于感染脑膜炎奈瑟氏菌引起的脑膜炎的危险中的幼儿。任选地，这类组合物可与其它药学活性物质组合给药，并且经常地，与其它疫苗组合使用，作为儿童时期疫苗计戈U(chiWhoodvaccinationprogram)的一部分。有益地，施用的组合物可以包括其它类型的免疫原性化合物，例如也诱导免疫应答以提供针对其它脑膜炎病原体的保护的复合糖。因此，在一些实施方式中，本发明的疫苗组合物包括至少一种源自其它脑膜炎血清型的抗原，典型地源自血清型A、B、C、W135和Y的至少一种。优选的实施方式通常包括，至少一种和通常两种或所有的血清型C、Y和W135的抗原，以及含有本发明寡糖的至少一种和任选2种或多种化合物。实施例下面的实施例阐明本发明的某些实施方式，但是绝不限定其范围。示例性的反应和剂型的其它变化对本领域的技术人员是明显的，其也在本发明的范围内。例如，改变步骤的顺序，或者修饰选择的保护基策略通常为普通从业者所作的一般选择。下面部分中化合物的编号方式与上面提供的反应方案中化合物的编号方式不相关，提供其是为了读者的方便。一般方法在Merck预包被的60F254板上使用AMC(钼酸铵-硫酸铈(IV)-10。/o硫酸为100g:2g:2L)或8。/。H2SO4实施TLC，以可视化。在硅胶(0.040-0.063mm，Amicon)或反相凝胶(C1860A40-63/mi)上进行柱层析。在25°C、Varian300MHz或400MHz仪器下，在CDCl3(外标Me4Si，5=0.00)或020(内标丙酮13C，S=30.89，&=2.22)中记录NMR谱。在30°C、减压下，浓縮有机溶液。实施例1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula>索弓l:0TBAF;")Ph3P，DIAD,DPPA,THF;叫HOAc,Ac20，H2S04;/v)a.NaBH4,NiCl2x6H20,b.Ac20;v)Me3SiBr;W)MeC(OMe)3,HOAc;v")PhSH,Et3N.二乙基C-(3,4，6-三-O-苄基-0!-D-卩比喃葡萄糖基)甲烷膦酸酯(2)。将TBAF(2.6g1.3eq)加入到二乙基C-(2-0-三丁基二甲基甲硅烷基-3，4,6-三-0-苄基-0:-0-吡喃葡萄糖基)甲烷膦酸酯(1，5.36g，7.7mmol)的THF溶液(150mL)中。20分钟后，在减压下除去溶剂，通过硅胶柱层析法纯化产物，得到2(4.44g,7.6mmol,99%)。二乙基C-(2-叠氮基-3,4，6-三-0-苄基-2-脱氧-a-D-批喃甘露糖基)甲垸膦酸酯(3)。将DIAD(2.4ml，12.4mmol)逐滴加入冷却的(-5。C)的Ph3P(3.1g，11.7mrno1)的THF溶液(50ml)中。30分钟后，加入2(5.57g，9.5mmol)的THF溶液(20ml)。在另外的10分钟后，加入叠氮磷酸二苯酯(DPPA;2.4ml，11.31mmo1)，并且使反应混合物达到室温(rt)。在搅拌过夜后，蒸发溶剂，并且通过硅胶层析法纯化残留物，得到无色油3(5.0g，8.2mmol，86%)。13C-NMR(CDC13)138.17,137.92，137,38,128.6-127.7,78,2，74.3，73.9,73.7,73.5,72.4,69.5,68.8,62.2，62.1,62.0，61.9,61.0，60.9,27.9(d,/=141Hz),16.5,16.4;31P-NMR(CDC13)27.9。二乙基C-(6-0-乙酰基-2-叠氮基-3，4-二-0-苄基-2-脱氧--0-吡喃甘露糖基)甲垸膦酸酯(4)。将化合物3(3.2g，5.2mmol)溶于HOAc/Ac20(l:l，32mL)。加入10滴1%—H2S04的Ac20溶液。在搅拌过夜后，将混合物倒入含有冰和CH2Cb的分离漏斗中。分离有机相，通过硅石塞过滤并进行浓縮。通过柱层析法纯化残留物，得到4(2.48g，4.4mmol，84%)。l3C-NMR(CDCl3)170.41，137.41,136.95，128.34-127,75,77.77,77.60，74.01，73.39，72.17,71.89,69.26,62.47，61.82,61.73,60.50,60.37,27.57(d,/=141Hz)，20.59,16.27,16.19;31P-NMR(CDC13)27.50;[a]D+37(cl.O,CHC13)。二乙基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3,4-二-0-节基-2-脱氧-0^-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯(5)。将催化量的NiCl2x6H20加入到搅拌的4(2.50g，4.45mmol)的MeOH溶液(125ml)中，然后每隔10分钟，加入部分NaBH4(总计0.34g，8.9mmol)，直到在TLC(系统)中观察不到原料。在50分钟后，加入Ac20(3ml)，并用甲苯稀释反应混合物，通过硅石塞过滤并进行浓縮。通过硅胶层析法纯化残留物，得到5(1.95g，3.4mmol，76%)。l3C-NMR(CDC13)170.4，169.7，137.3，137.0残余芳族C128.5-127.7,75.3,72.6，72.4，72.1，72.0,67.1,61.91,61.8,61.8,61.3,61.2，48.8，48.6,28.5(d,/=142Hz),23.0，20.6,16.3,16.2,16.1;31P-NMR(CDC13)29.5。二甲基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3，4-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯(7)。向5(0.25g，0.43mmol)的干燥CH2Cl2(5ml)溶液中，在室温下加入溴三甲基硅烷(0.28111￡，2.2mmol，5eq)。在添加完成后，在室温下搅拌混合物1小时。将溶液冷却至0°C，加入Et3N(lmL)，然后加入水(lmL)。10分钟后，在减压下除去溶剂，并通过RP-层析法对残留物进行脱盐(水-水/MeOH1:1)。甲基化产物C-(6-O乙酰基-2-乙酰氨基-3，4-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-吡喃葡萄糖基)甲烷膦酸酯(6)，而没有进一步纯化。向上面描述的反应的产物中，加入AcOH(5.5ml)和三甲基原乙酸酯(11.5mL)。在回流下加热该混合物30分钟，然后浓縮。通过硅胶层析法纯化残留物，得到7(0.20g，0.36mmd，84%，两步)。(反应必须仔细监控，并且当反应完成时，正好停止反应，否则结果为想要的产品和6-OAc被去保护的产品的混合物。)13C-NMR(CDC13)170.6,170.0,137.4,137.1残余芳族C129.9-127.4，75.3,73.0,72.5,72.4，72.0，66,7，61.8,52.9,52.8，52.2，52.1，49.0，48.7，28.0(d，7=142Hz),23.2,20,8;31P-NMR(CDC13)31.6。甲基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3，4-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯(8)。向7(1.35g，2.46mmol)的THF溶液(2mL)中加入苯硫酚(1.0mL，9.83mmol)和Et3N(2.0mL，14.7mmol)。48小时后，将反应混合物直接置于硅胶柱上，并且首先用甲苯洗脱，然后用含有1.5%TEA的9:1的CHCl3/MeOH洗脱，得到8(1.28g，2.01mmol，82%)。13C-NMR(CDC13)169.5,169.1,137.1，137.1，残余芳族C,127.4-126.7,75.0,72.6，72.1,71.6,71.2,62.0，51.7，50.6,50.5，49.5,28.6(d,/=129Hz)，22.4,22.3,19.9;31P-NMR(CDC13)20.4;[a]D+15(c1.0，CHC13)。将下述方案施用到实施例1的剩余部分和实施例2-6。索弓l:,〕(pClPh)3P,DIAD,Et3N，THF;〃)KOH,MeOH;/")PhSH，DBU，CH3CN;,v)H2,Pd/C,HCl2-羧苄基酰氨乙基6-0-[甲基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3，4-二-0-节基-2-脱氧--0-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯1-2-乙酰氨基-3，4-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-卩比喃甘露糖苷(10)。向8(50mg，0.093mmo1)、三(4-氯苯基)膦(38mg，O.lOmmol)、2-羧基苄基酰氨乙基2-乙酰氨基_3，4_二-0-苄基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷(9.42mg，0.072mmo1)、Et3N(0.050mL，0.36mmol)的THF溶液(0.5mL)中，加入DIAD(0.021mL，10.4mmol)。45分钟后，在减压下除去溶剂，并且通过硅胶层析法(EtOAc，然后9:1的CHCVMeOH)纯化残留物，之后在LH-20凝胶柱(4:1的CH2Cl2/MeOH)上进一步纯化，得到为非对映异构体混合物的产物10(70.1mg，0.064mmol，88%)。实施例22-羧苄基酰氨乙基6-0-[甲基C-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-苄基-2-脱氧-0^-吡喃甘露糖萄甲垸膦酸酯卜2-乙酰氨基-3，4-二-0-节基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷(ll)。向10(73mg,0.066mmol)的MeOH(2mL)溶液中，加入溶解于MeOH的KOH储液中的KOH(7.4mg,0.13mmol)。25分钟后，用0112(:12稀释该反应混合物，通过硅石塞过滤，并且在减压下除去溶剂。在LH-20凝胶柱(4:1的CH2Cl2/MeOH)上纯化残留物，得到产物ll(70mg，0.066mmo1，100%)。实施例32-羧苄基酰氨乙基6-0-[甲基C-(6-0-[甲基C-(6-0-乙酰基-2-乙酰氨基-3,4-二-0-苄基-2-脱氧-0;-0-吡喃甘露糖基)甲垸膦酸酯1-2-乙酰氨基-3，4-二-0-苄基-2-脱氧-o;-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯-2-乙酰氨基-3，4-二-0-苄基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷(12)。向8(27mg，0.051mmo1)、三(4陽氯苯基)膦(19mg，0.052mmo1)、11(38mg，0.036mmo1)和Et3N(0.025mL，0.18mmol)的THF(0.5mL)溶液中，力口入DIAD(0.010mL，0.052mmol)。40分钟后，浓縮该反应混合物，并且通过硅胶层析法(EtOAc，然后9:1的CHCl3/MeOH)纯化反应混合物。在LH-20凝胶柱(4:1的CH2CyMeOH)上进一步纯化产物，得到12(52mg，0.033mmo1，92%)。实施例42-羧节基酰氨乙基6-0-[甲基C-(6-0-[甲基C-(2-乙酰氨基-3,4_二_0_节基_2-脱氧-0;-0-吡喃甘露糖基)膦酸酯-2-乙酰氨基-3，4-二-0-节基-2-脱氧-0;4)-吡喃甘露糖基)膦酸酯-2-乙酰氨基-3，4-二-0-节基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷(14)。向12(67mg,0.043mmo)的MeOH(2mL)溶液中，加入溶解于MeOH的KOH储液中的KOH(4.7mg,0.085mmol,2eq)。25分钟后，用DCM稀释该反应混合物，通过硅石塞过滤，并且在减压下除去溶剂。在LH-20凝胶柱(4:1的CH2CVMeOH)上纯化残留物，得到13(65mg，0.042mmo1，100%)。向13(36mg，0.024mmol)的乙腈(0.5ml)溶液中，加入苯硫酚(0.096ml，0.94mmo1，40eq)禾口DBU(0.070ml，0.47mmo1，20eq)。2.5小时后，在减压下除去溶剂，并且通过硅胶层析法(甲苯，然后9:1的CHCl3/MeOH+1.5。/。的TEA)纯化产物。在LH-20凝胶柱(MeOH+1.50/。的TEA)上进一步纯化产物，得到14(30mg，0.018mmol，75%)。31PNMR(CDC13):21.2,22.4。实施例52-氨乙基6-0-[C-(2-乙酰氨基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲垸膦酸酯-2-乙酰氨基-2-脱氧会D-吡喃甘露糖苷(15)。向11(35.1mg，0.033mmol)的乙腈(0.5ml)溶液中，加入苯硫酚(0.066ml，0.64mmo1，20equiv.)和DBU(0.048ml，0.32mmo1，lOequiv.)。2小时后，在减压下除去溶剂，并且通过硅胶层析法(甲苯，然后20:1的CHCl3/MeOH+1.5%的TEA)纯化产物。在LH-20凝胶柱(MeOH+1.5n/。的TEA)上进一步纯化产物，得到2-(苄氧基羰基)氨乙基6-0-[C-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-苄基-2-脱氧普D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯]-2-乙酰氨基-3，4-二-0-节基画2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷(30mg，2.63mmo1，79%)。13C-NMR(CD3OD)173.55,172.57，158.72,139.94,139.66，139.64，139.39，138.24,残余芳族C130.36-125.05,100.26,78.86，77.82,76.03，75.90,75.18,74.60，74.19，72.85,72.27，72.20，71.97,67.36，67.25,64.57,61.09，54.66，51.28,51.16,50.56,41.43,29.94(d,/=135Hz)，22.59,22.43。向该产物(10mg)的EtOH(4ml)溶液中，加入溶于水的HC1(0.1M，0.25ml)，然后加入催化量的碳上Pd。搅拌过夜后，在100psi氢气氛中，用乙酸钠中和该溶液。通过反相硅胶的塞子过滤该反应混合物，并且"PNMR显示原料全部转化为单一产物，冻干之后，其在P2-Biogel柱上进一步纯化，得到15(100%)。NMR(D20):31P23.1;l3C22.5,22.6,26.7,28.5，30.9，39.5,47.2,52.8,53.1,53.3,60.0,63.6，63.9,66.8,67.8，69.1,69.6，72.072.1，73.1，74.5,99.3，174.8，175.4。实施例62-氨乙基6-0-[C-(6-0-(C-2-乙酰氨基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯-2-乙酰氨基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖基)甲烷膦酸酯l-2-乙酰氨基-2-脱氧普D-吡喃甘露糖苷(16)。向14(12mg)的EtOH(4ml)溶液中，加入溶于水的HC1(0.1M，0.25ml)，然后加入催化量的碳上Pd。搅拌过夜后，在100psi氢气氛中，用乙酸钠中和该溶液。通过反相硅胶塞过滤该反应混合物，并且31PNMR显示原料全部转化为单一产物，其在P2-Biogel柱上进一步纯化，得到16(100%)。NMR(D20):31P22.72,22.75;3C22.5,22.7，23.9,26.9，28.7,30.9，39.5,47,1，52.8,53.2,53.3,60.9,63.6，64.0,66.9,67.3,67.8,69.2,69.5，69.7,72.1,72.2,73.2,74.2,74.5,99.4，174.8，175.4。实施例7a<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>乙基3，4,6-三-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-l-硫代-0!-D-卩比喃甘露糖苷(22)。向1,3,4,6-四-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧普D-吡喃甘露糖苷(21)(5.04g，13.5mmol)的012<:12溶液中，加入EtSH(1.6mL，21.6mmol)和MS(4A)。混合物在室温、氩气下搅拌30分钟。然后在1个小时期间加入溶于CH2Cl2(10mL)中的BFr醚合物(4.8mL，38.1mmol)。7小时后，用012(:12稀释混合物、用饱和的NaHC03洗涤混合物、过滤(硅石)并且浓縮该混合物。层析法(1:0—1:1甲苯-EtOAc)翻22(3.46g,9.22mmol，68%);13CNMRS14.8(SCH2CH3)，20.6，20.7，20.8(CH3CO),25.6(SCH2CH3),62.3，62.9,66.2,69.0,71.4(C画2-6)，82.5(C-l),169.6，170.0，170.7(CH3CO)。乙基3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脱氧-l-硫代-or-D-吡喃甘露糖苷(23)。向22(3.71g，9.88mmol)的MeOH(30ml)溶液中，加入NaOMe(lM)。1小时后，用AcOH中和该混合物，并且进行浓縮。将干燥残留物溶于吡啶(15mL)，并且加入叔丁基二甲基甲硅垸基氯化物(1.94g，12.87mmo1)。在室温下，过夜搅拌反应混合物。用乙酸酐乙酰化、用甲苯稀释、过滤(硅石)、浓縮以及用层析法(l:0—1:1甲苯-EtOAc)纯化，得到23(4.357g,9.73mmol,99%);[O!]d+109。(c1.0,CHC13);13CNMRS-5.33，-5.28(CH3Si)，14.7(SCH2CH3),18.4((CH3)3CSi),20.7,20.9(CH3CO),25.0(SCH2CH3),25.9((CH3)3CSi),62.6,62.9，67.0,71.7,71.9(C-2-6),81.5(C-l)，169.7,170.1(CH3CO);'H画R50.05(s,3H),0.05(s,3H)，0.90(s，9H),1.30(t,3H),2.05(s,3H),2,10(s,3H),2.55-2.75(m,2H)，3.60-3.75(m，2H),4.10(m，1H),4.15-4.20(m,1H),5.20-5.25(m，1H),5.30-5.35(m,1H);用HRMS计算C18H33N3Na06SSi[M+Na]+为470.1757，发现为470.1750。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>3,4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷(26)。将NIS(394mg，1.75mmol)和AgOTf(催化剂)加入到23(653mg，1.46mmol)的湿CH2Cl2(10mL)溶液中。在-20。C搅拌反应混合物30分钟。加入CH2C12，并且用忖325203(10%)洗涤该混合物、过滤(硅石)并且浓縮混合物。用层析法(l:0—1:1甲苯-EtOAc)纯化残留物，得到26(487mg,1.21mmol,82%);13CNMR—S-5.29,-5.22(CH3Si),18.6((CHs)3CSi),20.7,20.9(CH3CO)，26.0((CH3)3CSi)，62.1,63.2，66.971.0,71.6(C-2-6),92.7(C陽l),169.8,170.3(CH3CO);'HNMR5_0.05(s，3H),0.06(s,3H),0.89(s,9H)，2.03(s,3H),2.08(s，3H)，3.65-3.70(m，2H),4.00-4.02(m,2H),5.19-5.23(m，2H),5.42-5.47(m，IH)。3,4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅垸基)-2-脱氧-or-D-吡喃甘露糖基氢-膦酸酯，三乙铵盐(27)。咪唑(915mg，13.45mmol)、PCl3(335)LtL，3.84mmol)和Et3N(2.0mL，14.35mmol)在MeCN(25mL)中的混合物在0。C下，搅拌30分钟。在0'C下，30分钟期间，加入化合物26(388mg，0.96mmol)的MeCN(25mL)溶液。然后在室温下，搅拌该反应混合物10分钟，用TEAB(0.5M)淬灭并进行浓縮。稀释该残留物(CHCl3)、用TEAB(0.5M)洗涤该残留物、过滤(棉)并且浓縮该残留物。残留物的层析法(1:0—10:1CHCl3-MeOH+1.0yoEt3N)得到27(499mg,0.93mmol,97%);[a]D+67。(c1.0,CHC13);'3CNMR—S-5.43,(CH3Si),8.98,18,3((CH3)3CSi),20.6,20.8(CH3CO),25.8((CHs)3CSi),45.7，62.4,62.5,66.5,71.1，72.1(C陽2隱6),93.1(C-l)，169.4，70.0(CH3CO);NMR—5-0.06(s,3H),-0.05(s,3H),0.79(s，9H)51.94(s,3H)，1.99(s，3H),3.59-3.63(m,2H)，3.93-4.00(m，2H)，5.21-5.28(m，1H),5.37-5.41(m，1H),5.51-5.50(m,1H);31PNMR50.28;使用HRMS计算C16H29N309PSi[M]—为466.1411,发现为466.1400。实施例7b2-(节氧基羰基)氨乙基3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷(24)。将化合物23(527g，U8mmol)溶于含有MS(4A)的CH2Cl2(10mL)。加入节基N-(2-羟乙基)氨基甲酸酯(300mg，1.54mmol)，并且在-2(TC、氩气下搅拌该混合物30分钟，然后加入NIS(345mg，1.53mmol)和AgOTf(催化剂)。30分钟后，用Et3N中和该反应混合物，用CH2C12稀释该反应混合物、用Na2S2O3(10e/。)洗涤该反应混合物、过滤(硅石)并且浓縮该混合物。层析法(1:0—1:1甲苯隱EtOAc)得到24(595mg，1.02mmo1，86%);[a]D+46。(c1.0，CHC13);13C腿RJ-5.38,-5.34(CH3Si),18.4((CH3)3CSi),20.6,20.8(CH3CO),25.9((CH3)3CSi),40.7(HOCH2CH2NH),61.6，62.6,66.6,66.9,67.6，71.3,71.8(C-2-6,PhCH20，OCH2CH2N),98.0(C画l),128.2,128.3，128.6,136.5(芳族C)，156.4(NHCOOCH2),169.6，170.1(CH3CO);'HNMR50.03(s,3H),0.04(s,3H),0.89(s，9H)，2.03(s，3H)，2.09(s，3H),2.35(s，1H)3.32-3.40(m,1H),3.44-3,52(m,IH)，3.58-3.66(m，3H),3.72-3.80(m，2H),3.98-4.00(m，1H),5.11(s，2H)，5.18-5.23(m,IH)，5.32-5.36(m，1H),7.16-7.36(m,5H)。2-(苄氧基羰基)氨乙基3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-0!-0-吡喃甘露糖苷(25)。向化合物24(575mg，0.99mmol)的THF(5mL)溶液中，加入TREAT-HF(0.81mL,4.97mmo1)。混合物在室温氩气下搅拌过夜。浓縮并且层析法(2:1—0:1甲苯-EtOAc)，得到25(448mg,0.96mmol,97%);[a]D+60。(c1.0,CHC13);13CNMR_S_20.7，20.8(CH3CO)，40.7(HOCH2CH2NH),61.4，61.6,66.4，67.0,67.5,70.9,71.0(C-2-6,PhCH20，OCH2CH2N),98.2(C-l),128.3,128.3，128.7,136.5(芳族C)，156.5(NHCOOBn)，170.1,170.5(CH3CO);'HNMR—52.04(s,3H),2.1(s，3H),3.32-3.46(m，2H),3.54-3.60(m,2H)，3.62-3.78(m,3H),4.02-4.04(m,1H),5.06-5.18(m,3H),5.22-5.28(m.1H),5.36-5.40(m，1H),7.28-7.38(m,5H);使用HRMS计算C2()H26N4Na09[M+Na]+为489.1597，发现为489.1574。实施例7c(3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅垸基)-2-脱氧-0^-卩比喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(2-(苄氧基羰基)氨乙基3,4-二-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-0f-D-吡喃甘露糖苷)三乙铵盐(28)。化合物25(325mg，0.60mmol)和27(217mg，0.47mmol)的混合物被溶于吡啶(3mL)。加入新戊酰氯(144/iL，1.18mmo1)，并且在室温氩气下搅拌混合物1小时。将反应混合物冷却至-40。C，并且加入l2(143mg，0.56mmo1)的吡啶-水溶液(3mL，49:1)。在0'C完成氧化，并且用CHCl3稀释混合物，用Na2S2O3(10。/。)和冷的TEAB(0.5M)洗涤该混合物。过滤(棉)、浓縮并且层析法(1:0—10:1CHCl3-MeOH+0.5Q/o的Et3N)，得到28(469mg,0,45mmol,96%);[a]D+52°(c1.0,CHC13);13CNMR_S-5.48，-5.38(CH3Si),9.27，18.4((CH3)3CSi),20.6,20.7，20.8，20.8(CH3CO),25.9((CH3)3CSi),40.7(HOCH2CH2NH)，45.8，61.7,62.2，64.5,66.3,66.6,66.7,67.3,69.8,69.9，71.2,71.3,71.8(C-2-6，2'-6'，PhCH20，OCH2CH2N)94.],97.9(C-l,128.1,128.2,128.6,136.8(芳族C)，156.7(NHCOOBn),169.3,169.7，170.0,170.1(CH3CO);'HNMR—S0.00(s,3H)，0.02(s，3H)，0.88(s,9H)，1.98(s,3H),2.00(s，3H)，2.06(s，3H),2.08(s，3H),3.30-3.38(m,1H),3.42-3.52(m,1H),3.56-3.64(m,1H),3.66-3.68(m，2H),3.74-3.80(m,1H),3.90-4.04(m,5H),4.12-4.14(m,1H),5.1(s，2H),2.16-2.22(m,1H),5.29(m,1H)，5.32-5.47(ni,3H),5.51-5.54(m，1H)，5.63-5.68(m，1H),7.28-7.38(m，5H);3IPNMR5-3.61。实施例7d(3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-or-D-吡喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(2-(苄氧基羰基)氨乙基3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷)三乙铵盐(29)。将化合物28(472mg，0.46mmo1)溶于THF(10mL)中，并且加入TREAT-HF(372pL，2.28mmo1)。混合物在室温下搅拌24小时，然后浓縮并在硅胶上纯化(1:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5。/。的Et3N)，得到29(390mg,0.42mmol,91%);[+340(c1,0，CHC13);13CNMRS10.6,20.6,20.8,20.8,(CH3CO)，40.7(HOCH2CH2NH)，46.1,61.5，61.7,62.2，62,3,64.6,66.6,66.6,66.8,67.4，69.9,70.0,70,9，71.2,71.9,(C-2-6,2'-6'，PhCH20,OCH2CH2N),94.0,98.0(C-l,-l')，128.1，128.2，128.6,136.6(芳族C),156.6(NHCOOBn),169.9,170.3(CH3CO);31PNMR5陽3.51;使用HRMS计算C3。H39N7018P[M]—为816.2089,发现为816.2078。下列方案应用于实施例8-12。实施例7(3,4-二-O-乙酰基-2-叠氮基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(3,4-二-0-乙酰基-2-叠氮基—2-脱氧-o;-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-(节氧基羰基)氨乙基3,4-二<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-"-0-吡喃甘露糖苷)双-三乙铵盐(30)。向化合物27(273mg，0.51mmol)和29(357mg，0.39mmol)的吡啶(3mL)混合物中，加入新戊酰氯(119/zL，0.97mmo1)。两小时后，将该混合物冷却至-40。C，并且加入l2(119mg，0.47mmol)的吡啶-水溶液(3mL，49:1)。当温度达到-10'C时，用CHCl3稀释混合物。用Na2S2O3(10%)、冷的TEAB(0.5M)提取，过滤(棉)并且层析法(l:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5°/c^Et3N)，翻30(351mg,0.24mmol,62%);[a]D+68°(c1.0,CHC13);13CNMRS-5.53,-5.42(CH3Si),10.1,18.3((CH3)3CSi),20.5，20.6,20.6,20.8(CH3CO),25.9((CHs)3CSi)，40.6(HOCH2CH2NH),45.9,61.7,62.1，62.3,64.2,66.2,66.4,66.5,67.1,69.7,70.4,71.0,71.2,71.4,71.6,77.4(C-2-6，2'-6',2"-6",PhCH20,OCH2CH2N),93.8,94.0,97.8(C-l,-l")，128.0,128.2,128.5,136.9(芳族C)，156.8(NHCOOBn)，169.3,169.6,169.7，169.8,169.9,170.0(CH3CO);'HNMR5-0.05(s,3H),-0.03(s，3H)，0.80(s,9H),1.90-2.00(m,18H),3.23-3.31(m，1H),3.36-3.45(m,1H),3.50-3.64(m,4H)，3.69-3.76(m,1H),3.79-3.97(m,7H)，4.02-4.15(m，3H)，5.00-5.06(m，2H),5.12-5.21(m,2H),5.24-5.31(m，IH)，5.33-5.37(m，2H)，5.38-5.45(m,3H),6.04-6.10(m，IH)，7.18-7.30(m,5H);31PNMR5-3.89，-3.56;使用HUMS计算C46H66N10NaO27P2Si[M+Na]—为1303.3241，发现为1303.3197。实施例8(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅垸基)-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-乙酰基-2-脱氧-Q!-D-吡喃甘露糖磷酸酯H1—6)-(2-(节氧基羰萄氨乙基2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷)双-三乙铵盐(31)。将化合物30(83mg，0.056mmo1)溶于MeOH(3mL)，并且加入NiCl2(H2O)6(催化剂)。通过在0。C，1小时的期间内，以小量加入NaBH4，进行还原。然后用乙酸酐处理该混合物，接下来进行稀释(MeOH)和浓縮。在硅胶(1:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5%的Et3N，LH-20凝胶(MeOH+1.5y。的Et3N)上纯化该残留物，得到化合物31(76mg，0.050mmo1，89%);[a]D+63。(c1.0,CHC13);13CN證S-5.44，-5.38(CH3Si),8.46,18.4((CH3)3CSi),20.9,21.0,21.0，21.1,23.0,23.0,23.0，23.3,23.9(CH3CO,CH3CONH),26.0((CH3)3CSi),40.8(HOCH2CH2NH),46.1，50.1,50.4，50.7(C-2，-2',-2"),59.1,61.6,64.5,65.0,65.7,65.9，66.7，67.1，70.0，70,2,70.3,71.3,77.4(C-3-6，3'-6',3—"-6",PhCH20,OCH2CH2N)，94.9,95.1，99.1(C-l，-1',-1"),128.0，128.1,128.6，136.8(芳族C),156.6(NHCOOBn)，169.5,169.6,170.0,170.5,170.6，170.8，171.3(CH3CO,CH3CONH);31PNMRS-3.75,-3.39;使用HRMS计算C52H79N4O30P2Si[M+H]-为1329.4024,发现为1329.3984。实施例92-氨乙基-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-6-0-(叔丁基二甲基甲硅垸基)-2-脱氧-o;-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-脱氧普D-吡喃甘露糖苷)双-三乙铵盐(32)。向化合物31(37mg，0.024mmo1)的MeOH(1.5mL)溶液中，力G入AmberliteIR-45(OH—)树脂(40mg)和活性炭上的钯。在100psi下氢解(hydrogenolyse)该混合物过夜，并进行稀释(MeOH)、离心和浓縮。在反相凝胶(1:0—0:1H20画MeOH)上纯化，得到32(28mg，0.020mmo1，83%);[a]D+60°(c1.0,MeOH);13CNMR(D20)5-5.9，-5.4(CTI3Si),8.89，18.7((CH3)3CSi)，20.9，21.0,22.4,22.5(CH3CO,CH3CONH),26.0((CH3)3CSi),39.7(HOCH2CH2NH),47.3,50.6,51.4(C-2，-2',陽2")，62.4,64.4，64.7,64.9，65.9,66,2,66.6,70.1，70.8,71.0，71.2，71.5(C画3-6，3—'-6',3—"-6"，OCH2CH2N)，95.4，95.5，99.1(C-l,誦l',匿l")，173.1,173.3,173.5,173.6,173.8,174.9,175.1，175.2(CH3CO，CH3CONH);31PNMR(D20)5-3.04,-2.87;使用HRMS计算C44H72N4028P2Si[M+H『为1195.3656,发现为1195.3567。实施例102-氨乙基-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-脱氧-o;-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-乙酰基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3,4-二-0-乙酰基-2-脱氧-or-D-吡喃甘露糖苷)双-三乙铵盐(33)。TREAT-HF(17/xL，0.10mmol)的THF(1.5mL)溶液用Et3N(17gL，0.12mmol)处理。将该溶液加入到化合物32(28mg，0.020mmol)。在室温下搅拌30分钟之后，浓縮该混合物并在反相凝胶(1:0—0:lH2O-MeOH)上纯化，得到33(22mg，0.017mmo1，85%);[a]D+45。(c1.0，MeOH);13CNMR(D20)58.87,20.9,20.9,22.3，22.4(CH3CO:CH3CONH),39.6(HOCH2CH2NH)，47.3,50.6，51.3，51.4(C-2，-2',-2"),60.2,64.3,64.5,64.9,66.2,66.4,69.9,70.0,70.5，70.5，70.7,70.8,71.0，71.6(C-3-6,3'誦6',3"-6"，OCH2CH2N),95.3,95.3，99.5(C-l,陽l',-1"),173.3,173.3,173.6,173.7，173.8,175.0,175.1,175.3(CH3CO,CH3CONH);HNMR5(D20)2.03(s，3H),2.08(s,3H),2.09(s,3H)，2.14(s,3H),2.14(s，3H)，2.18(s，3H)，2.24(s,3H)，2.24(s,3H)，2.24(s,3H),3.28-3.36(m,2H),3.68-3.84(m,3H)，4.00-4.18(m,5H),4.27-4.33(m，IH)，4.57-4.64(m,2H)，5.22-5.30(m,IH)，5.31-5.37(m,2H)，5.44-5.49(m,1H);31PNMR(D20)5-3.02，-2.95;使用HRMS计算C38H58N4Na028P2[M+Nar为1103.261,发现为1103.2642。实施例112-氨乙基-(2-乙酰氨基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-("6)-(2-乙酰氨基-2-脱氧-0!-D-吡喃甘露糖磷酸酯H1—6)-(2-乙酰氨基-2-脱氧-or-D-卩比喃甘露糖苷)双-三乙铵盐(34)。将化合物33(22mg，0.017mmol)溶解于MeOH(lmL)，加入NaOMe(lM)。30分钟后，浓縮该混合物，并且在反相凝胶(1120—MeOH)上纯化残留物。冻干含有产物的级分，得到34(14mg，O馬匪ol，94%);[a]D+12.4。(c0.5，MeOH);13CNMR(D20)522.6(CH3CONH)，40.1(HOCH2CH2NH)，53.1,53.8,53.9(C-2,鍾2',-2"),60.8，65.3,66.6,67.0,69.1,69.3,69.5,72.2,73.0，74.1(C-3-6,3'隱6'，3"-6",OCH2CH2N),95.8,95.8，99.6(C-l,隱1'，-l")，175.5,175,-5,175.6(CH3CONH);3IPNMR(D20)S-2.36,画2.22;使用HRMS计算C26H47N4022P2[M+H〗-为829.2157,发现为829.2064。实施例13a'3SRLH,R2-SEt(75%)'36R's(BnO)2P(0)0,R;S3Bt<67%)'37R',iiO)2P(0)0，R2^011(79%)乙基3,4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-l-硫代-o;-D-吡喃甘露糖苷(35)。向溶解在THF(6mL)的化合物23(305mg，0.68mmol)中，加入TREAT-HF(0.55ml，3.38mmo1)。在室温下搅拌混合物过夜。浓縮和层析法(10:1—0:1甲苯-EtOAc)，得到35(171mg,0.51mmol,75%);13CNMR514.7(SCH2CH3),20.6，20.8(CH3CO),25.4(SCH2CH3),61.3，63.0,66.6，71.1，71.3(C-2-6),82.2(C-1),170.0,170.6(CH3CO);'HNMR51.26-1.30(t,3H)，2.05(s,3H)，2.08(s,3H),2.32(s,IH)，2.56-2.68(m,2H),3.58-3.67(m,2H),4.09-4.14(m,2H),5.24-5.35(m，3H)。实施例13b乙基3,4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-6-0-磷酸二节酯-1-硫代-a-D-吡喃甘露糖苷(36)。向溶解于CH2Cl2(10mL)的化合物35(171mg，0.51mmol)中，加入四唑(125mg，1.78mmol)和N-N-二异丙基氨基磷酸酯(264AtL，0.76mmo1)。在室温下搅拌反应混合物30分钟。在(TC加入wCPBA(176mg，1.02mmo1)，并且继续搅拌30分钟。稀释(CH2Cy混合物，用Na2S2O3(10。/。)和NaHCO3洗涤。过滤(Na2S04)、浓縮和层析法(10:1—2:1甲苯-EtOAc)，得到36(200mg,0.34mmol,67%);[a]D+92。(c1.0,CHC13);13CNMP、S14.6(SCH2CH3)，20.5,20.6(CH3CO)，25.3(SCH2CH3),62.9,65.7,66.1,69.4，69.4，69.5,71.4,(C-2-6,PhCH20),82.0(C-1),127.9，128.0，128.5,128.5,128.6,128.6,128.7,135.8，135.9(芳族C)，169.5,169.9(CH3CO);31PNMR5-1.36;使用HRMS计算C26H32N3Na09PS[M+Na]+为616.1495，发现为616.1487。实施例13c3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-6-0-磷酸二苄酯-a-D-吡喃甘露糖苷(37)。将化合物36(281mg，0.47mmol)溶于湿CH2Cl2(10mL)，并且冷却到-20。C。加入NIS(137mg，0.61mmol)和AgOTf(催化剂)，并且在-2(TC搅拌混合物30分钟。混合物被稀释(CH2Cl2)、用Na2S2O3(10%)洗涤、过滤(Na2S04)和浓縮。层析法(2:1—0:1甲苯-EtOAc)，得到37(201mg,0.37mmol,79%);13C丽RS20.7,20.7，62.5,66.2,66.3,66.4，68.6，68.7,69.6,69.7,69.8，69.8,71.0(C-2-6，PhCH20),92.5(C-l)，128.0，128.1,128.3，128.6，128.7,128.7，135.6，135.7(芳族C),169.8，170.1(CH3CO);j'PNMRS-1.87。实施例13d3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-6-0-磷酸二节酯-a-D-吡喃甘露糖基-氢-膦酸酯，三乙铵盐(38)。在0r搅拌咪唑(349mg，5.13mmol)、PCl3(128/zL，1.47mmol)禾QEt3N(765/xL，5.49mmol)在MeCN(10mL)中的混合物30分钟。在0。C，在30分钟期间加入化合物37(201mg，0.37mmol)的MeCN(10mL)溶液。然后在室温下搅拌反应混合物10分钟，用TEAB(0.5M)淬灭，并且进行浓縮。残留物被稀释(CHC13)、用TEAB(0.5M)洗涤、过滤(棉)和浓縮。残留物的层析法(l:0—10:1CHCl3-MeOH+1.0%的Et3N)，得至U38(243mg,0.34mmol,92%);[+55。(c1.0,CHC13);13CNMRS9.34,20.6，20.7(CH3CO),45.962.4，62.5，65.6，65.7,69.4,69.5，69.9,70.0,70.9(C-2-6，PhCH20),93.0(C-l),128.0，128.0,128.1,128.5，128.5,128.6，135.8(芳族C),169.5,169.9(CH3CO);31PNMR3-1.32,0.29;使用HRMS计算C24H28N3012P2[M]-为612.1148,发现为612.1129。下列方案应用于实施例13e和14-17。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage74</formula>实施例13e2-(苄氧基羰基)氨乙基(3,4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-6-0-磷酸二苄酯-0;-0-吡喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(3,4-二-0-乙酰基國2-叠氮基-2-脱氧-o;-D-吡喃甘露糖基磷酸酯H1—6)-(3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-Q!-D-吡喃甘露糖苷)双-三乙铵盐(39)。38(96mg，0.13mmol)和29(103mg，0.11mmol)的混合物被溶于吡啶(3mL)中。加入新戊酰氯(34pL，0.28mmo1)，并且在室温、氩气下搅拌混合物2小时。将反应混合物冷却至-40。C，并且加入l2(34mg，0.13mmol)的吡啶-水溶液(3mL，49:1)。在-10。C完成氧化，并且用CHC13稀释混合物，用Na2S2O3(10M)和冷的TEAB(0.5M)洗涤该混合物。过滤(棉)、浓縮并且层析法(1:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5o/o的Et3N)，得到39(106mg,0.065mmol，59%);[a]D+80°(c1.0,CHC13);13CNMRS10.2,20.6,20.7，20.8(CH3CO)，40.6(HOCH2CH2NH),45.9,57.9,61.7,62.3,64.4，65.5,65.7，66.1，66.5，66.6,67.2,69.4,69.5,70.3,71.0，71.4(C-2-6,2'-6'，2"-6",PhCH20，OCH2CH2N),93.9，94.0，97.8(C-l,-1"),128.0，128.1，128.2，128.5，128.6,136.0,136.9(芳方矣C),156.8(NHCOOBn),169.6，169.7,169.8，169.9(CH3CO);31PNMR5-4.13,-3.58,-1.52。实施例122-(苄氧基羰基)氨乙基(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-6-0-磷酸二苄酯-or-D-吡喃甘露糖基磷酸酯H1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-a'-D-吡喃甘露糖苷)双-三乙铵盐(40)。将化合物39(76mg，0.047mmol)溶于MeOH(3mL)，并且加入NiCl2(H20)6(催化剂)。通过在(TC，在30分钟的期间，以小量加入NaBH4，进行还原。然后用乙酸酐处理该混合物，接下来进行稀释(MeOH)和浓縮。在硅胶(1:0—5:1CHCl3-MeOH+0.5%的Et3N)和LH-20凝胶(MeOH+1.5。/。的Et3N)上纯化该残留物，得到化合物40(50mg，0.030腿o1，64%);13CNMR(D20)S8.89,20.7,20.8,22.4(CH3CO,CH3CONH)，40.7(HOCH2CH2NH),47.3,50.7,51.4(C-2,-2',-2"),64.5，65.9,66.1,66.5，66.6,67.2,67.3，69.7，69.8,70.5,70.8,70.9，71.1(C-3-6，3'-6'，3"-6",PhCH20,OCH2CH2N)，95.2，95.3，98.8(C-l，-l'，-1"),128.2，128.9,129.0,129.3,129.5,129.7，135.7,135.8,137.1(芳族C)，158.7(NHCOOBn)，172.8，172.9，173.2,173,3,173.4，173.4,174.8，174.9,175.0(CH3CO,CH3CONH);31PNMR(D20)5-3.05,-2.75，-1.20。实施例132-氨乙基(2-乙酰氨基-3,4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-6-0-磷酸酯-0^-吡喃甘露糖基磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-O-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-0!-D-卩比喃甘露糖基磷酸酯Hl—6)-(2-乙酰氨基-3，4-二-0-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-a-D-卩比喃甘露糖苷)三-三乙铵盐(41)。向化合物40(46mg，0.027mmol)的MeOH(2mL)溶液中，加入AmberliteIR-45(Off)树脂(46mg)和活性炭上的钯。在100psi下氢解(hydrogenolyse)该混合物过夜，并进行稀释(MeOH)、离心和浓縮。在反相凝胶(1:0—0:1H20-MeOH)上纯化，得到41(34mg，0.023mmo1，85%);[q:]d+43。(c1.0,MeOH);l3CNMR(D20)S8.89,20.9，20.9，22.4,22.4(CH3CO,CH3CONH),39.6,(HOCH2CH2NH)，47.3，50.6,51.3,51.4(C-2,-2',-2"),63.6,64.4,64.8,66.1，66.2,66.4，69.9，70.0,70.6,70.7,71.0(C-3-6,3'-6',3"-6",OCH2CH2N)，95.3,95.4,99.1(C-l,國l',匿l")，173.2,173.3，173.4,173.6，173.7,173.7,175.0，175.1，175.2(CH3CO,CH3CONH);31PNMR(D20)S-3.08,-2.95，0.05;使用HRMS计算C38H59N4031P3[M/2+H]-为580.1188，发现为580.1142。头她i夕y142-(苄氧基羰基)氨乙基(2-乙酰氨基-2-叠氮基-2-脱氧-6-0-磷酸二节酯会D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基2-叠氮基-2-脱氧-0^-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-2-叠氮基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷)二-钠盐(42)。将化合物40(50mg，0.030mmol)溶于MeOH(3mL)，并且加入NaOMe(lM)。室温下搅拌该混合物1小时。浓縮，并在反相硅胶(1:0—0:1H20-MeOH)上纯化，得到42(30mg，O据扁ol，80%);13CNMR(D20)S22.6(CH3CONH),40.7(HOCH2CH2NH),53.1,53.8，54.0(C-2，-2'，-2")，65.1,66.4,66.5,66.8,67.5,68.9，69.1，69.6,71.0,71.1，71.9,72.0,72.3,73.1(C-3-6,3-'画6',3"-6",PhCH20，OCH2CH2N),95.6,95.8,99.4(C-l，-l")，128.1，128.4，129.0,129.0,129.4,129.5,129.8,135.7,135.8，137.1(芳族C)，158.8(NHCOOBn),175.3(CH3CONH);31PNMR(D20)S-2.35,-2.23,-0.96。实施例152-氨乙基(2-乙酰氨基-2-叠氮基-2-脱氧-6-0-磷酸酯-a-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(l,6)-(2-乙酰氨基-2-叠氮基-2-脱氧-or-D-吡喃甘露糖磷酸酯)-(1—6)-(2-乙酰氨基-2-叠氮基-2-脱氧-a-D-吡喃甘露糖苷)三-钠盐(43)。将化合物42(30mg，0.024mmol)溶解于MeOH(2mL)溶液中。加入AmberliteIR-45(OH，树脂(30mg)和活性炭上的钯。在100psi下氢解(hydrogenoyse)该混合物过夜，并进行稀释(MeOH)、离心和浓縮。在反相凝胶(1:0—0:1H20-MeOH)上纯化，得到43(15mg，0.015mmo1，64%);[q;]d+13.6。(c0.5，MeOH);13cNMR(D20)522.6，22.6,22.6(CH3CONH)，39.7(HOCH2CH2NH),49.5,53.0,53.7，53.8(C-2，-2',-2"),63.8,64.2，65.1,65.2，65.4，66.5，66.7，67.0，68.9，69.2，69.5，72.2，72.3,72.9,73.1，73.2，73.4，73.4(C-3-6,3'-6'，3"-6"，OCH2CH2N)，95.9,99.6(C-l，-l'，-l")，175.4,175.5,175.5(CH3CONH);31P画R(D20)S-2.35,-2.30,2.2;使用HRMS计算C26H46N4Na2025P3[M+2Na]—为953.1459,发现为953.1440。为了研究C-膦酸酯取代磷酸二酯对MenA糖的免疫原性和稳定性的影响，合成脑膜炎奈瑟氏菌组A多糖重复单元的三聚体的合成寡糖类似物，并将其结合到载体蛋白CRM197。分析该复合糖，以证实物理化学性质和小鼠中的免疫原性。该偶联物的结构如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>通过用非乙酰化和非磷酸化碱分子中的c-膦酸酯基团取代连接单糖的磷酸二酯基团，得到该化合物。a)CRM-MenA合成复合糖的物理化学性质表征该偶联物，以得到糖、蛋白、未结合(自由)糖的含量。实施例16而且，针对特异性抗MenA抗体，进行SDS—Page(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和蛋白质印迹(WesternBlot)。糖和蛋白质浓度用盐水复原冻干产物(终浓度^.8mg/ml)，通过比色检测分析该产物，得到总磷和总蛋白含量(MicroBCA分析)。然后使用适当的转化因子(convertingfactor),将磷含量转化为总糖含量。因为在储存该偶联物期间产生一些沉淀，故加入浓縮的磷酸盐缓冲液(磷酸钠，100mMpH7.5)，达到10mM的终浓度。然后，考虑稀释因子，重新计算浓度。在用磷酸盐缓冲液稀释后，该偶联物具有97.10pg/ml的总糖浓度，和215.63/xg/ml的总蛋白浓度。b)在小鼠中的免疫原性以ELISA和杀菌测定，分析具有合成寡糖的偶联物的免疫原性。用含有和不含有作为佐剂的磷酸明矾而配制的纯化复合糖，使BALB/c小鼠(每组8只)免疫。在表1示出的免疫方案，包括在第0天、14天和28天三次给药(每次200ng)，在第42天放血。在1次给药后、2次给药后和3次给药后，分析血清，以确定特异性的总IgG和相应的抗体机能活动。MenA-CRM2011是野生型MenA偶联物。表l:免疫组方案和治疗方案<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>在ELISA测定中，分析血清，以特异性确定在小鼠血清中IgG抗体的应答。通过线性回归曲线，计算针对A、C、W135和Y多糖抗原(MenA、MenC、MenW、MenY)的总IgG效价，并将其表示为ELISA单位/毫升(EU/ml)。通过与标准血清的滴定曲线对比，得到血清效价。用荚膜多糖和甲基化的人血清清蛋白的混合物包被微滴定平板，其每一个在PBSpH7.4中终浓度为5.0/zg/ml。密封该平板，在2°C-8°CT，培养过夜，然后以PBSpH7.4中的含有5。/。胎牛血清的缓冲液作为封闭剂，进行洗涤和浸泡(saturate)。在室温下温育1小时后，洗涤平板，并且将稀释的测试血清加入到第一排的孔中。用两倍稀释步骤，通过滴定曲线分析血清。在2匸-8^下培养过夜后，洗涤平板，并且将结合到碱性磷酸酯酶的山羊抗小鼠抗体以1:2000稀释到饱和缓冲液中，并且加入到平板中。在37t下，温育该二抗2小时，洗涤后，将显色底物溶液(溶于1M二乙醇胺缓冲液——pH9.8，0.5mMMgCl2，0.02%NaN3——中的lmg/ml磷酸对硝基苯酯)加入到平板。在室温下温育反应30分钟，在405-620nm波长下，读出吸收值。第一个点的吸收值高于标准吸收值的血清，被使用更高的初始稀释度再次检测。阴性抗体应答(在1:100稀释时，第一个点的OD值低于0.300)的小鼠被定为2EU/ml效价，并且被归类为"非-应答者"。血清杀菌抗体(SBAtO测定通过测量脑膜炎奈瑟氏菌体外的补体介导裂解(complement-mediatedlysis)，分析疫苗免疫诱导的功能抗体(Goldschneider等，1969)。使用大量商业幼兔补体作为补体来源(PelfreezelotNo.09958)。测定方案是基于添加有0.25。/。葡萄糖的MuellerHinton培养液(Difco)中的测试菌株的接种体，其开始于在琼脂巧克力上生长的分离菌落。在37匸下，用5%(:02，温育细菌培养物，并且当细菌到达早期指数生长期(O.D掘为0.220-0.240)时，停止生长。在具有1%BSA的Gey's平衡盐溶液中，将该培养物稀释到10^菌落形成单位/ml(ColonyFormingUnit(CFU)/ml)，并且在37。C、5%C02T，在存在热灭活的试验血清池(heatinactivatedtestserapool)和幼兔补体的情况下，温育1小时。在温育之前(TO)和温育1小时后(T1)，将反应混合物铺于MuellerHinton琼脂(Difco)上。在37。C、5%0)2下，温育平板过夜，并且计数对应于TO和Tl的CFU/ml。将血清杀菌抗体效价表示为产生50%杀菌的血清稀释度的倒数。结果物理化学性质物理化学分析的结果表明，偶联物的糖基化程度是非常低的。蛋白质印迹获得的适度信号和偶联物与CRM参比之间的SDS-Page中注意到的小的差异也表明低偶联程度。可优化偶联条件以及偶联物的纯化。ELISA结果获得的结果报告于表2和图4中。测量从每单一动物得到的ELISA效价，并以ELISA单位/ml(EU/ml)表示。计算对每一复合糖的特异性抗体应答，作为相应免疫接种组的几何平均效价(GeometricMeanTitre,GMT)。第二次给药后，血清在用佐剂配制的合成偶联物中显示出低效价，在没有佐剂处理的免疫组中显示出任何效价。具有和没有明矾的情况下，偶联物没有显示出任何效价。如预期的，具有和没有佐剂处理的对照组显示出高应答。表2.在第一次给药后，第二次给药后，第三次给药后小鼠血清中确定的对多糖MenA的ELISA抗体效价。报告对每一免疫组计算的几何平均效价。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>SBAb测定结果在从每一免疫组制备的血清池中确定血清杀菌效价。将杀菌效价表示为，对比于在TO测量的对照CFU/ml，导致反应混合物的CFU/ml下降50%的血清稀释度的倒数。针对血清群(serogroup)A菌株F8238，测量杀菌效价。SBAb抗体效价报告于表3中。(MenA-CRM是野生型对照)表3.在第二次给药后和第三次给药后血清集合体中的杀菌活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>结论制备了偶联物，并分析其物理化学、免疫化学和免疫学特性。物理化学和免疫化学分析都表明了偶联物的糖基化程度。在对照组中，在具有或没有佐剂的情况下，对免疫接种的应答，效价是高的。在第三次给药后的血清池中，对比于第二次给药后的血清，效价增加。在用不具有明矾的合成偶联物治疗的组中，效价是测量不到的，在用佐剂化偶联物的免疫接种中，效价是可测量的但是较低。用寡偶联物进行对照免疫接种的效价明显较高。结果证明结合到蛋白载体CRM197的合成MenA寡糖在小鼠中是免疫原性的。偶联物具有应该比天然磷酸二酯键稳定得多的C-膦酸酯键。一些免疫原性己被检测的事实表明是有前景的。应理解，提供前述实施例来阐明本发明，而不是限定本发明的范围。公开的要素的各种改变和组合是可行的，如一个普通技术人员将意识到的，这些也在本发明的范围内。例如，用于胺和羟基的许多保护基是公知的，并且这些中的许多能被用来代替在本文中具体叙述的那些，而不背离本发明的精神。权利要求1.寡糖，其包括第一甘露糖单元和第二甘露糖单元，其中所述第一甘露糖单元包括在C-1处成α构型的间隔区，该间隔区可结合到蛋白质，其中所述第一甘露糖单元通过1，6-键结合到所述第二甘露糖单元，所述1，6-键将所述第一单元的C-6与所述第二单元的C-1相连接，并且其中所述1，6-键包括膦酸酯。2.权利要求l所述的寡糖，其中所述l,6-键在a构型中。3.权利要求1或2所述的寡糖，其中所述第一甘露糖单元是2-脱氧-2-氮杂取代的甘露糖衍生物。4.权利要求1-3任一项所述的寡糖，其中所述第二甘露糖单元是2-脱氧-2-氮杂取代的甘露糖衍生物。5.权利要求l-4任一项所述的寡糖，包括至少3个甘露糖单元。6.权利要求l-5任一项所述的寡糖，其中所述1,6-键具有[第二个甘露糖单元的C-l]-CH2-P-0-[第一甘露糖单元的C-6]的形式。7.权利要求l-6任一项所述的寡糖，其中存在的每一2-氮杂取代基选自NH2、NHAc和N3。8.权利要求1-7任一项所述的寡糖，其中第三个甘露糖单元通过含磷的键结合到所述第二甘露糖单元，并且其中所述键将所述第二甘露糖单元的C-6连接到所述第三甘露糖单元的C-l。9.权利要求8所述的寡糖，其中将所述第二甘露糖单元的C-6连接到所述第三甘露糖单元的C-l的所述键包括膦酸酯。10.权利要求8或9所述的寡糖，其具有下列分子式:其中，每一个Az独立地选自NH2、NHAc和N3;Z表示能结合到蛋白质的所述间隔区部分，并且其可以是被保护形式或未保护形式，或者其可被结合到蛋白质；每一个Ri独立地是H、任选地取代的C1-C6烷基、或M，这里M表示阳离子；X是O或CH2;每一113和114独立地选自H、Ac、Bn和其它保护基；和W是H、或保护基、或磷酸酯、或连接另外糖单元的键。11.权利要求1-10任一项所述的寡糖，进一步包括通过所述间隔区部分连接到所述寡糖的蛋白质，所述间隔区部分在所述第一甘露糖单元C-l处成a构型。12.权利要求11所述的寡糖，其中所述蛋白质是选自白喉类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、铜绿甲单胞菌外毒素(rEPA)、或者破伤风类毒素的灭活细菌毒素，或者其中所述蛋白质是CRM197。13.权利要求1-12任一项所述的寡糖，其中所述间隔区部分包括羟基或胺，它们中的任一个任选被保护，或者任选结合到蛋白质。14.权利要求1-13任一项所述的寡糖，其中W是酰基，R"是H。15.权利要求l所述的寡糖，其包括分子式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，每一个AZ表示氮杂取代基；每一R3和R4独立地表示H或保护基；W表示H、保护基或连接到另一糖单元的连接体；W和X中的一个是O，并且W和X中的另一个是CH2;n是1或2;当n是l时，Yn是OR，当n是2时，一个Y是二O并且另一Y是OR，其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M，这里M是阳离子；和Z是OR，、SR，或NR'2，这里每一R，独立地是H或任选地取代的烷基、酰基、芳基、芳烷基、杂垸基、杂酰基、杂芳基或杂芳垸基；或者Z表示结合到另一糖单元的连接体，或者结合到蛋白质的所述间隔区部分。16.权利要求15所述的寡糖，其中蛋白质通过酰胺键或酯键连接到所述寡糖。17.权利要求15所述的寡糖，其中W是CH2，X是O，Az是NHAc，和n是2。18.权利要求15-17任一项所述的寡糖，其中R是M，Z包含-0-(CH2)n-NH-，其中n是2-6。19.权利要求15-18任一项所述的寡糖，其中113和114的每一个独立地是H或Ac。20.制造寡糖的方法，该方法包括通过包含膦酸酯的1,6-键，将包含至少一个氮杂取代甘露糖单元的第一部分连接到包含至少一个氮杂取代甘露糖单元的第二部分，其中所述第一部分通常包括间隔区部分，该间隔区部分被连接到a构型中的甘露糖单元的C-1。21.权利要求20所述的方法，其中使用Mitsunobu反应将所述第一部分的甘露糖单元的C-6连接到所述第二部分的甘露糖单元的C-l。22.权利要求20-21的任一项所述的方法，其中所述1,6键是1,6-a键。23.权利要求20-22的任一项所述的方法，其中所述连接的N-取代甘露糖单元包括分子式(l)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，每一个AZ表示氮杂取代基；每一R3和W独立地表示H或保护基；RS表示H、保护基或连接到另一糖单元的连接体；W和X中的一个是O，并且W和X中的另一个是CH2;n是1或2;当n是l时，Yn是OR，当n是2时，一个Y是K)并且另一Y是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中R是H、Cl-C6烷基、或C6-C12芳基、或C6-C12芳烷基，或者R是M，这里M是单价阳离子；和Z表示能结合到蛋白质的部分，其可以是被保护形式。24.权利要求23所述的方法，其中X是CH2，W是O。25.权利要求20-24的任一项所述的方法，其中在甘露糖单元上至少一个氮杂取代基是通过还原氮化物(N3)取代基得到的胺或取代胺。26.权利要求25所述的方法，其中所述胺或取代胺在甘露糖单元的位置2上。27.权利要求20-25的任一项所述的方法，其中位于异头中心的Z或所述间隔区部分包括胺取代的烷氧基。28.权利要求20-27的任一项所述的方法，进一步包括通过在分子式(l)中的OW的氧和另外的糖之间形成键，将所述第二甘露糖单元连接到所述另外的糖。29.权利要求28所述的方法，其中所述另外的糖包括至少一个甘露糖单元。30.权利要求28或29所述的方法，其中所述另外的糖通过1,6-a键被连接到所述第二甘露糖单元。31.权利要求28-30的任一项所述的方法，其中W是H或Ac，并且存在的每一个甘露糖单元的异头中心是在a构型中。32.合成o;-连接甘露糖单元的寡糖的方法，所述方法包括将含有分子式(2)的甘露糖单元与分子式(3)的延长单体在Mitsunobu反应条件下相结合，在所述分子式(2)中，其中W是C1-C6酰基或H，R1、R3、R4、Az和Z如权利要求15所定义；在分子式(3)中，其中RX表示C1-C6酰基，且M表示H或阳离子；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(2)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(3)从而得到含有由1，6-o;键连接的至少两个氮杂取代的甘露糖单元的寡糖。33.权利要求32所述的方法，其中所述Mitsunobu反应条件被保持一段延长的时间，从而得到分子式(4)的寡糖，其中，p是从l到20的整数。34.权利要求32或33所述的方法，其中每一个Az表示NHAc或者Ns。35.权利要求33或34所述的方法，其中p是l-36.权利要求33或34所述的方法，其中p是2-10。37.权利要求32-36的任一项所述的方法，进一步包括将所述寡糖结合到蛋白质。38.权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质是选自白喉类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、铜绿甲单胞菌外毒素(rEPA)、或者破伤风类毒素的灭活细菌毒素。39.权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质是CRM197。40.按照权利要求32-36的任一项所述的方法制备的寡糖。41.按照权利要求32-39的任一项所述的方法制备的免疫原性化合物。42.权利要求1-16或40的任一项所述的寡糖，其用于在下述方法中，所述方法包括将有效量的A型脑膜炎疫苗成分施用给对象，从而提供免疫原性应答。43.药物组合物，其包括至少一种权利要求1-16或40的任一项所述的寡糖，和至少一种药学可接受的赋形剂。44.免疫原性组合物，其包括至少一种权利要求1-19或40或41的任一项所述的化合物。45.A型脑膜炎疫苗，其包括至少一种权利要求1-19或40或41的任一项所述的化合物。46.权利要求45所述的A型脑膜炎疫苗，包括连接到蛋白质的寡糖。47.制造可用于制备免疫原性寡糖的甘露糖衍生物的方法，所述方法包括用亲电体环化分子式(2)的化合物，形成分子式(3)的化合物，其中R2、R3、W和R6的每一个独立地为H或保护基；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>48.权利要求47所述的方法，进一步包括用磷基团取代El的步骤。49.权利要求47所述的方法，进一步包括用氮化物取代分子式(2)或分子式(3)中的OR2。50.权利要求49所述的方法，其中所述取代步骤包括Mitsunobu反应。51.权利要求50所述的方法，其中所述Mitsunobu反应使用磷酰基氮化物作为氮化物来源。52.制备2-叠氮基-2-脱氧-D吡喃甘露糖的改进方法，该方法包括:在1，3，4,6-四-0-酰基-吡喃葡萄糖衍生物的位置2形成三氟甲磺酸酯；和用氮化物亲核体取代所述三氟甲磺酸酯；其中所述改进包括在产物分离和纯化步骤过程中，最小化原始反应混合物对湿气的暴露。53.免疫原性组合物，其能够诱导针对A型脑膜炎的保护抗体，所述组合物包括具有至少两个糖单元的寡糖，所述糖单元通过稳定化的含磷键彼此共价结合。54.权利要求53所述的组合物，其中所述寡糖包括至少两个通过稳定化的含磷键彼此共价结合的甘露糖单元。55.权利要求53-54的任一项所述的组合物，其中所述寡糖被结合到蛋白质。56.权利要求55所述的组合物，其中所述蛋白质不是清蛋白。57.权利要求53-55的任一项所述的组合物，包括至少两种不同的寡糖部分。58.权利要求53-57的任一项所述的组合物，其中所述稳定化的含磷键是膦酸酯。59.权利要求58所述的组合物，其中所述膦酸酯键包括通过Mitsunobu反应形成的1,6-键。60.权利要求57所述的组合物，包括至少两种不同的寡糖，所述至少两种不同的寡糖对至少两种脑膜炎球菌免疫型具有特异性。61.权利要求53-59的任一项所述的组合物，进一步包括肺炎链球菌抗原。62.权利要求61所述的组合物，其中所述肺炎链球菌抗原包括多糖。63.权利要求62所述的组合物，其中所述多糖被结合到蛋白质。64.权利要求53-63的任一项所述的组合物，进一步包括源自脑膜炎血清型A、B、C、W135和Y中至少一种的至少一种抗原。65.权利要求64所述的组合物，其中所述抗原源自脑膜炎血清型C、W135或Y。66.权利要求53-65的任一项所述的组合物，进一步包括佐剂。67.权利要求66所述的组合物，其中所述佐剂是明矾。68.权利要求63-67的任一项所述的组合物，其中所述寡糖通过含有二羧酸或其衍生物的双官能试剂结合到所述蛋白质。69.权利要求68所述的组合物，其中所述二羧酸包括己二酸或辛二酸或它们的衍生物。70.权利要求68所述的组合物，其中所述双官能试剂包括方酸酯。71.权利要求53-70的任一项所述的组合物，其中至少一个甘露糖单元包括在其异头中心的ce-连接的间隔区部分。全文摘要可用于A型脑膜炎疫苗的寡糖，其包括在C-1位置具有成α构型的间隔区的第一甘露糖单元，该间隔区能结合到蛋白质，并且第一甘露糖单元通过1，6-键连接到第二甘露糖单元，所述1，6-键将第一单元的C-6与第二单元的C-1相连接，其中1，6-键包括膦酸酯。制造这类化合物、类似化合物或其中间体的相关方法也被公开。文档编号C07H7/00GK101282984SQ200680024358公开日2008年10月8日申请日期2006年5月8日优先权日2005年5月6日发明者P·特奥多罗维奇,P·科斯坦蒂诺,S·奥斯卡松申请人:诺华疫苗与诊断股份有限公司;斯德哥尔摩大学