多肽、疫苗及其用途的制作方法

专利名称：多肽、疫苗及其用途的制作方法
专利说明多肽、疫苗及其用途 本发明涉及预防性或治疗性治疗，从而阻止血管形成，例如阻止肿瘤生长、视网膜疾病、动脉硬化症、子宫内膜异位症、类风湿性关节炎和炎症性病况。
预防性或治疗性治疗的一种形式是免疫接种。疫苗是源于造成疾病的病源或其成分的制品，其被给药以刺激免疫应答，这将保护人免于因该病源造成的疾病。治疗性(治疗)疫苗是在疾病发生后给予的，目的是要减轻或延缓疾病进程。预防性(预防)疫苗要防止一开始疾病的发生。例如，用在疫苗中的试剂可以是完全灭活的(失活)、活的减毒的(减弱的)病原生物或人造物。
疫苗通过刺激宿主免疫系统而特异产生抗主要靶位的抗体和/或免疫细胞(细胞毒性T细胞)来介导它们的效应。这些靶位被称为“抗原”。刺激针对靶抗原的免疫应答能导致通过免疫介导来破坏并消除存在于经免疫的宿主体内的病源。一旦被刺激，则免疫系统还会保持对以后由该靶向的病源造成的感染或疾病发生的监视。因此，疫苗是控制现存疾病并抑制其将来恶化或复发的有效的途径。
有各种方法来针对靶抗原来免疫接种。这些中的一些包括注射完整的蛋白质；对应于蛋白质片段的合成肽；和/或编码蛋白质的DNA/RNA序列。递送DNA和RNA的递送载体包括表达表达抗原以及其它免疫刺激剂，如细胞因子或生长因子的基因、裸DNA/RNA或重组质粒的改变了的病毒。
除了免疫接种，预防性或治疗性治疗可通过用治疗性抗体治疗宿主来实现，所述抗体产生在宿主外并特异针对感兴趣的抗原。
产生、分离和使用针对所需抗原或表位的抗体的方法对相关领域技术人员来说是公知的。例如，利用现有已知的标准方法可在合适的宿主动物(如，例如，小鼠、兔、或山羊)中产生抗体并将其用作粗抗血清或进行纯化，例如通过亲和纯化进行。所需特异性的抗体可另外利用公知的分子生物学方法产生，包括从重组抗体的分子文库中筛选，或将互补决定区(CDR)移植或改组到合适的框架区上。人抗体可选自重组文库和/或利用公知的分子生物学技术通过将非人抗体的CDR移植到人框架区上而产生。该抗体可用于治疗性治疗，例如含治疗性抗体的药物可被导入受试者中以调节受试者的免疫应答。例如，特异针对受试者抗原的治疗性抗体将刺激针对该抗原的免疫应答，由此诱导和/或促进免疫应答并帮助痊愈。
血管发生(vasculogenesis)就是干细胞分化成内皮细胞，内皮细胞接着形成血管。血管生成(angiogenesis)是从先已存在的血管形成血管。诸如血管形成、新血管化和血管化的术语涵盖了血管发生和血管生成。
血管生成(血管形成的一个例子)是通过从预先存在的血管萌发过程来形成新的毛细管血管，其在发育期间以及在大量生理和病理情况中发生(Folkman，1995，Nature Medicine，127-31)。通过血管生成的过程形成新血管涉及一系列复杂的事件，包括内皮细胞增殖、迁移、相互作用和粘附以形成索状组织和管，并最终成熟。生理上，血管生成是组织生长、伤口愈合、和女性生殖功能之必需，并且是如视网膜疾病、动脉硬化症、子宫内膜异位症、类风湿性关节炎和炎症性病况的病理过程的组成部分。可是，许多对血管生成的长期兴趣来自于以下观念，即要使实体肿瘤生长超过关键大小，它们必须从周围基质补充内皮细胞以形成它们自己的内生微循环。为了促进新血管化，肿瘤释放各种因子刺激内皮细胞增殖和迁移。这些因子包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素-8(IL-8)胎盘生长因子、和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(源于血小板的内皮细胞生长因子；Relf等，1997，Cancer Research，57963-9)。因此，已有许多工作致力于找到干扰这些信号传递途径并由此阻断肿瘤血管生成的分子。
与传统溶瘤细胞疗法相比，靶向血管生成具有几个潜在优势。这些中最突出的是所有实体肿瘤都是血管生成依赖性的；靶内皮细胞容易为治疗所接近；而且它们是遗传稳定的并较不倾向于产生对治疗的耐受性。靶向癌细胞表达的蛋白质的显著优势之一是遗传可变性和迅速的细胞生长和分裂造成的大的选择压力，其经常使这些药物失效，这归因于耐受性机制和其他途径的产生和利用。
血管生成的抑制也对糖尿病性视网膜病变和黄斑变性展现出早期的前景，所述疾病都由眼血管过度生长造成。在这些病症中，血管干扰眼中正常的结构，或使光线不能到达眼后部。新血管本身就是原发病理情况，而且阻止血管生长可防止失明。
大量天然产生的血管生成抑制剂被鉴定出来了，如血管生成抑制素(angiostatin)(血纤维蛋白溶酶原的38kDa蛋白水解片段)、抗血管生成的抗凝血酶III、内皮抑制素(胶原蛋白XVIII片段)、干扰素α/β/γ、促乳激素16kDa片段和凝血栓蛋白-1(TSP-1)，其在体外和体内模型中显示出各种程度的效果。这些抑制剂靶向内皮细胞并抑制血管生成。例如，观察到的血管生成抑制素的抑制不依赖于刺激内皮细胞的是何血管生成因子(Eriksson等，2003 FEBS Letts.53619-24)。这与诸如结合VEGF或抑制VEGF-受体激酶活性的低分子量化合物的抗体的试剂相反。大多数肿瘤表达各种血管生成因子，这显示靶向单一血管生成途径不足以抑制肿瘤扩展。因而，直接靶向于内皮细胞的疗法具有绕开由数种源于肿瘤的因子控制的血管生成问题的能力。可是，在另一方面，该疗法必须应对能特异靶向涉及在新血管化的过程中的血管内皮细胞、而同时不靶向成熟血管的问题。
被称为血管生成抑制素结合蛋白(angiomotin)的80kDa分子(“p80-血管生成抑制素结合蛋白”)由于其结合血管生成抑制剂——血管生成抑制素的能力而被鉴定出来(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254；WO 99/66038)。p80-血管生成抑制素结合蛋白属于新的蛋白质家族，其有两个额外的成员——血管生成抑制素结合蛋白样蛋白1(Amot1)和2(Amot2)。这些蛋白质的特征在于保守的卷曲-卷曲结构域和C末端PDZ结合基序(Nishimura等，2002，J.Biol.Chem.2775583-5587；Bratt等，2002，Gene，29869-77)。p80-血管生成抑制素结合蛋白区别于其相关蛋白质，在于它含细胞外血管生成抑制素结合结构域。P80-血管生成抑制素结合蛋白主要在内皮细胞中表达并介导血管生成抑制素对体外内皮细胞迁移和管形成的抑制效应(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254)。在小鼠主动脉内皮(MAE)细胞中表达p80-血管生成抑制素结合蛋白能增加对化学趋化因子的迁移性应答(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254)。在迁移中起的作用被小鼠p80-血管生成抑制素结合蛋白敲除实验的发现所强化，其中约有70％的敲除小鼠在胚胎期第7-8天死亡，这归因于前内脏内胚层的迁移缺陷(Shimono和Behringer，2003，Current Biology，13613-7)。
在原代细胞以及细胞系中实时PCR分析p80-血管生成抑制素结合蛋白的表达模式表明，血管生成抑制素结合蛋白在内皮细胞中优势表达。p80-血管生成抑制素结合蛋白的体内图谱揭示了在如人胎盘的血管生成组织以及肿瘤组织中有表达。这些数据提示，血管生成抑制素结合蛋白在血管生成期间在内皮细胞中被上调。WO 99/66038讨论了p80-血管生成抑制素结合蛋白及其用途，例如用作药物筛选靶位。
130kDa的p80-血管生成抑制素结合蛋白的新剪接同工型(被称为“p130-血管生成抑制素结合蛋白”)最近被鉴定出来了。该较大的同工型包含延伸的N末端结构域并在血管生成中起作用，其不同于，但与p80-血管生成抑制素结合蛋白相关。
本发明提供了对应于完整p130-血管生成抑制素结合蛋白分子或其片段的疫苗的用途，用于产生阻止血管形成(血管生成)的免疫应答。本发明还提供了用p130-血管生成抑制素结合蛋白分子的免疫接种和利用疫苗防止在肿瘤生长以及由新血管生成产生或恶化的其他疾病中起关键作用的血管形成的方法。
本发明进一步提供了治疗性抗体、和其片段，其特异针对p130-血管生成抑制素结合蛋白，用作药物以阻止血管形成(血管生成)和/或防止在肿瘤生长以及由新血管生成产生或恶化的其他疾病中起关键作用的血管形成。
本发明的第一个方面提供了用于调节血管生成和/或肿瘤形成的分离或重组的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽。
各种用于分离多肽的方法对所属领域技术人员来说是已知的。例如，多肽可通过应用亲和纯化而分离自表达蛋白质的细胞。制备重组多肽的方法也是公知的，并包括在细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞系统中表达。例如，分离多肽和表达重组多肽的方法在Sambrook等，2001，MolecularCloningA Laboratory Manual(第3版)中有讨论。
对于“多肽”，我们包括互相用肽键连接的约10或更多个氨基酸的链(或其衍生物)。本发明的多肽可通过添加一个或多个化学基团(例如，磷酸基和法呢基)来修饰。本发明还包括糖基化或未糖基化的多肽。在酵母或哺乳动物表达系统中表达的多肽与天然分子在分子量和糖基化模式上可以是相似的或有轻微差异，这取决于表达系统。例如，在诸如大肠杆菌的细菌中表达编码多肽的DNA通常提供了非糖基化的分子。真核蛋白质的N-糖基化位点的特征在于氨基酸三联体Asn-A.sub.1-Z(其中A.sub.1是除了脯氨酸之外的任意氨基酸，而Z是丝氨酸或苏氨酸)。具有失活的N-糖基化位点的多肽变体可通过所属领域普通技术人员已知的技术来制备，如寡核苷酸合成和连接或位点特异性突变技术，这包括于本发明的范围内。另外，N-连接的糖基化位点可加于本发明的多肽上。
对于“p130-血管生成抑制素结合蛋白”，我们包括任意天然产生的130kDa全长血管生成抑制素结合蛋白多肽(例如，由本发明人在实施例中描述的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽)或其任意变体，其保留与天然产生的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽或其片段的抗原交叉反应性。
优选地，多肽是分离或重组的哺乳动物p130-血管生成抑制素结合蛋白；更优选地，是分离或重组的人p130-血管生成抑制素结合蛋白。
更优选地，多肽包含 (i)序列SEQ ID NO1；或 (ii)与SEQ ID NO1具有至少80％和/或至少90％和/或至少95％和/或至少98％同一性并提供功能性多肽的序列；或 (iii)SEQ ID NO1或(ii)的序列的功能性片段。
而且其中多肽不是p80-血管生成抑制素结合蛋白或p80-血管生成抑制素结合蛋白的片段。
术语“血管生成抑制素结合蛋白”对于所属领域技术人员来说是公知的，并包括多肽，其具有卷曲-卷曲和C末端PDZ结合结构域；被认为是细胞表面相关蛋白；而且被认为结合血管生成抑制素并介导血管生成抑制素对内皮细胞迁移和管的形成的抑制效应。天然产生的血管生成抑制素结合蛋白多肽的例子由以下给出Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254；WO 99/66038；Levchenko等，2003，J.Cell Sci.1163803-3810；Bratt等，2002，Gene，29869-77；GenBank登录号NP_573572(人)。
可是，与p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽和其片段相同的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其片段不被认为是本发明的多肽。
对于“功能性多肽”和/或“SEQ ID NO1的功能性片段”，我们包括SEQID NO1的任意片段，其显示出SEQ ID NO1的一些或全部细胞功能。优选地，SEQ ID NO1的功能性片段是p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端区，其不与p80-血管生成抑制素结合蛋白具有相似性，而且更优选地是包含或由SEQ ID NO1氨基酸残基第1至409位组成的片段。如实施例所示，p130-血管生成抑制素结合蛋白的N-末端能诱导应力纤维并改变细胞形状，这都是全长p130-血管生成抑制素结合蛋白所涉及的促进血管生成的功能。
本发明的第二个方面提供了抗体或其片段，其能结合本发明的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽。
抗体包含两个通过二硫键连在一起的相同的Mr50,000-70,000(被称为“重链”)的多肽，其每一个连于一对相同的Mr25,000(被称为“轻链”)的多肽之一。在不同抗体分子重链的各N末端之间和在不同抗体分子各轻链之间有着相当大的序列可变性，因而这些区域被称为“可变结构域”。相反，在不同抗体分子重链的各C末端之间和在不同抗体分子各轻链之间有着相当大的序列相似性，因而这些区域被称为“恒定结构域”。
一对重和轻链可变结构域中的高变区形成了抗原结合位点。高变区也被称为互补决定区(CDR)，决定了抗体所针对配体的特异性。重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域通常包含3个CDR，其每一个的侧翼是较少变化的被称为框架区(FR)的序列。
抗体的可变重(VH)和可变轻(VL)结构域与抗原识别有关，通过早期蛋白酶消化实验就认识到该事实。啮齿动物抗体的“人源化”发现了进一步证实的依据。啮齿动物来源的可变结构域可与人源的恒定结构域融合，由此产生的抗体保留了啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，6851-6855)。
通过涉及抗体片段的细菌表达的实验，其所有片段都包含一个或多个可变结构域，可知抗原特异性由可变结构域赋予，而且不依赖于恒定结构域。这些分子包括Fab样分子(Better等，1988，Science，2401041)；Fv分子(Skerra等，1988，Science，240，1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL配对结构域通过柔性寡肽相连(Bird等，1988，Science 242423；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879)；和单结构域抗体(dAb)，其包含分离的V结构域(Ward等，1989 Nature 341，544)。涉及合成保留其特异结合位点的抗体片段的技术的概括性综述可在Winter等，1991，Nature，349，293-299中找到。
对于“ScFv分子”，我们指分子，其中VH和VL配对结构域通过柔性寡肽相连。
利用抗体片段而不是完整抗体有若干优势。较小尺寸的片段可导致增强药理学性质，如更好地穿透实体组织。去除了完整抗体的效应器功能，如补体结合。Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段都可在Escherichia coli(大肠杆菌)中表达和分泌，因此容易产生大量所述片段。
完整抗体、和F(ab′)2片段是“二价”的。对于“二价”，我们指所述抗体和F(ab′)2片段具有两个抗原结合位点。相反，Fab、Fv、ScFv和dAb片段是单价的，仅具有一个抗原结合位点。
产生、分离和使用针对所需抗原或表位的抗体的方法对相关领域技术人员来说是公知的。例如，利用现有已知的标准方法可在合适的宿主动物(如，例如，小鼠、兔、或山羊)中产生抗体并将其用作粗抗血清或进行纯化，例如通过亲和纯化进行。所需特异性的抗体可另外利用公知的分子生物学方法产生，包括从重组抗体的分子文库中筛选，或将互补决定区(CDR)移植或改组到合适的框架区上。人抗体可选自重组文库和/或利用公知的分子生物学技术通过将非人抗体的CDR移植到人框架区上而产生。
优选地，抗体或片段能结合由SEQ ID NO1残基1至残基409所限定的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽区，但不能结合p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽。SEQ ID NO1的残基1-409对应于p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端，其与p80-血管生成抑制素结合蛋白的多肽序列不具有同一性。
优选地，抗体或片段能结合由SEQ ID NO1残基410至残基1084所限定的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽区，但不能结合p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽。SEQ ID NO1的残基410-1084对应于p130-血管生成抑制素结合蛋白的C末端，其与p80-血管生成抑制素结合蛋白的多肽序列具有相似性。
优选地，抗体或片段能结合由SEQ ID NO1残基817至残基1013所限定的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽区，但不能结合p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽。SEQ ID NO1的残基871-1013对应于p130-血管生成抑制素结合蛋白的血管生成抑制素结合结构域，其与p80-血管生成抑制素结合蛋白血管生成抑制素结合结构域的多肽序列具有相似性。
优选地，抗体是人抗体。
能结合p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽和其片段的抗体可被认为是本发明的抗体。
本发明的第三个方面提供了本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)用于产生能结合本发明的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽的抗体的用途。
产生、分离和使用针对所需抗原或表位(例如，本发明的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽)的抗体的方法对相关领域技术人员来说是公知的并包括在上述的那些方法中。
本发明的第四个方面提供了本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或本发明的抗体或片段，其用于药物中。
对于“多核苷酸”，我们包括单链和/或双链DNA (脱氧核糖核酸)和/或RNA(核糖核酸)分子和其衍生物。对于“编码多核苷酸”，我们包括多核苷酸，其序列可被翻译形成所需多肽。对于“反义多核苷酸”，我们包括多核苷酸，其与编码多核苷酸的编码链互补。
本发明人证实了p130-血管生成抑制素结合蛋白和p80-血管生成抑制素结合蛋白在调节血管发生/血管生成中起作用。这些多肽尤其涉及通过调节细胞迁移、细胞大小和管形成而促进血管发生/血管生成。本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或本发明的抗体或片段因此可用于药物中。
有一些医学病况的特征在于缺失对控制血管发生和/或血管生成的分子过程的调节控制。例如，血管发生/血管生成相关疾病包括癌(尤其是实体肿瘤)、血管瘤、眼新血管形成、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、类风湿性关节炎、炎症性病况(如牛皮癣、慢性肠炎、哮喘)和子宫内膜异位症。
本发明人以前在PCT/EP2004/014573中显示血管生成抑制素结合蛋白分子(尤其是p80-血管生成抑制素结合蛋白)可有效用于治疗性和/或预防性治疗血管发生和/或血管生成，其内容纳入本文参考。
本发明的第五个方面提供了本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸和/或本发明的抗体或片段用于制备调节血管生成和/或肿瘤形成的药物的用途。
将多肽、多核苷酸和抗体配制成药物、药物组合物和疫苗的方法对于相关领域技术人员来说是公知的。含本发明多肽、多核苷酸和抗体的药物、药物组合物和疫苗的优选配方在实施例中有描述。
优选地，药物防止和/或减轻血管生成和/或肿瘤形成。
一些公知的方法可用于检测和/或测量血管生成和/或肿瘤形成，而且将会理解这些可用于确定药物是否能防止和/或减轻血管生成和/或肿瘤形成。可测量免疫接种的功效，例如通过利用酶联免疫吸附测试(ELISA)分析抗体滴度；利用酶联免疫印迹(ELISPOT)测试通过γ干扰素产生间接测量T细胞活化。也可定量循环的内皮细胞水平并用作成功的免疫接种的代用标记。可通过确定管形成和内皮细胞的存在性来测量血管生成的“水平”，这如在实施例和Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254中所述的那样。
例如可利用测微计通过确定肿瘤大小和体积来检测和/或测量肿瘤。肿瘤中的新血管化可通过各种已知测试来评估，包括“基质胶-栓”测试(例如，London等，2003，Cancer Gene Ther.10823-832所述)或基于成像的测试，如皮肤-皮片窗-室模型。
本发明的第六方面提供了本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或本发明的抗体或片段用于制备治疗患有血管生成相关疾病或病症的受试者的药物的用途。
本发明的第七方面提供了本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或本发明的抗体或片段用于制备免疫接种患有或有血管生成和/或肿瘤形成和/或血管生成相关疾病或病症风险的受试者的疫苗的用途。
优选地，血管生成相关疾病或病症是癌、实体肿瘤、血管瘤、眼新血管形成、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、类风湿性关节炎、炎症性病况、牛皮癣、慢性肠炎、哮喘或子宫内膜异位症。
有血管发生/血管生成相关疾病风险的患者可以是有癌症风险(尤其是有实体肿瘤风险)的患者，例如有形成癌而导致实体肿瘤的遗传倾向的患者、或有实体肿瘤环境风险的患者。例如，有癌症风险的患者可以是有癌家族史的人，其结肠中存在息肉；或已知感染了与宫颈癌相关的人乳头瘤病毒株的和/或呈现有最早期宫颈癌变的pap涂片的妇女。
优选地，要治疗的受试者是人，例如患有或有血管生成相关疾病或状况风险(如上定义)的人。另外，接受者可以是患有或有这种状况风险的动物，例如驯养动物(如猫或狗)或有重要农业用途的动物，例如牛、绵羊、山羊、或家禽。
药物或治疗可以是预防性治疗或治疗性治疗。
产生、分离和使用针对所需抗原或表位的抗体方法对相关领域技术人员来说是公知的并如上所述。该抗体可用在治疗中一一例如，含治疗性抗体的药物可被导入受试者中以调节该受试者的免疫应答。例如，特异针对受试者抗原的治疗性抗体将刺激针对该抗原的免疫应答，由此诱导和/或促进免疫应答并帮助痊愈。向需要其的患者给药治疗性抗体的方法是现有公知的。将会理解，本发明的抗体可用作治疗性抗体以调节受试者中针对p130-血管生成抑制素结合蛋白的免疫应答，优选抑制和/或减轻该受试者中的血管生成。
免疫接种可通过向受试者给药本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽或多核苷酸；或通过在受试者体外将受试者的免疫细胞暴露于本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽或多核苷酸，然后将经过暴露的免疫细胞(和/或它们的后代)输回受试者，由此来进行。
用本发明的多肽或多核苷酸作为免疫原进行免疫接种的范围不受限，涵盖了蛋白质、肽和基于基因的免疫接种策略。例如，疫苗可包含本发明的多肽或多核苷酸或其免疫刺激衍生物或片段。希望向受试者同时或顺序给药基于蛋白质或肽的和基于多核苷酸/基因的疫苗成分。这可促进更强、更广或更平衡的免疫应答。
衍生物包括但不限于(A)本发明多肽的类似物，其中天然蛋白质的氨基酸序列在一个或多个氨基酸位置上被修饰，从而增加了分子的免疫原性；(B)化学修饰一个或多个氨基酸，如用人工化学基团取代天然产生在所述氨基酸上的一个或多个化学基团，以增强所得的肽的免疫原性；(C)用免疫原性蛋白质(如钥孔血蓝素-KLH)或半抗原(即小化学分子，如二硝基酚-DNP)与对应于本发明多肽片段的肽缀合。
疫苗被认为能打破耐受并在接受者中产生抗内源p130-血管生成抑制素结合蛋白的免疫应答。例如，在人中有效抗血管形成的疫苗可包含有效量的人p130-血管生成抑制素结合蛋白分子和/或其编码多核苷酸；p130-血管生成抑制素结合蛋白分子或所编码的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽可以是全长血管生成抑制素结合蛋白或其片段，其能促进抗出现于内源p130-血管生成抑制素结合蛋白中并可接近的一个或多个表位的免疫应答。
疫苗可进一步包含(作为一种或多种抗原的)一种或多种肿瘤抗原以及其它已知一种或多种血管生成因子，例如血管生成抑制素受体。
例如，编码Her2/neu肿瘤抗原(原癌基因片段)的穿膜细胞外(TMEC)部分的质粒可与编码人血管生成抑制素结合蛋白分子的质粒协同作用从而减轻肿瘤发展。TMEC部分源自大鼠p185(TMEC)的穿膜和细胞外(TMEC)部分，其为人Her2/neu癌基因的同源物。这例示了基于血管生成抑制素结合蛋白的疫苗如何作为“佐剂”与肿瘤抗原协同，在该例子中肿瘤抗原源于Her2/neu，但可能源于在人肿瘤中表达的任何肿瘤抗原，包括但不限于如下实例源于癌/睾丸肿瘤抗原(如抗原的MAGE、BAGE、GAGE、NY-ESO-1家族)的那些；分化抗原(如MART-1/MelanA、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、TRP-1和-2)；广泛表达的抗原(ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、iCE、MUC1和2、PRAME、P15、RUI和2、SART-1和3、WT1)；和其它更独特或相同的抗原(如AFP、b-联蛋白、级联蛋白-8、CDK-4、ELF2、G250、HSP70、HST-2、KIA A0205、MUM-1、2和3、RAGE)；病毒抗原(如HPV-E7、EBV抗原)；或衍生自融合蛋白的那些(如来自bcr-abl、Del-cain、LDL/FUT、TEL/AML1的那些)。肿瘤抗原可以以完整重组蛋白、质粒、一种或多种肽、或其片段或部分(如I类或II类表位)来给药。
疫苗可进一步包含一种或多种抗肿瘤抗原或抗原因子的抗体。因此，本发明还包括与抗肿瘤抗原的抗体联用的血管生成抑制素结合蛋白疫苗，包括但不限于针对Her2/neu抗原(如Herceptin/Traztusumab)、淋巴瘤上的CD20抗原、结肠直肠癌上的EpCAM抗原的抗体。
疫苗要能产生抗p130-血管生成抑制素结合蛋白分子的免疫应答。得到的免疫应答能抑制肿瘤与其它疾病状态产生和/或维持所需的新毛细管的形成。进一步(或另外)，尽管p130-血管生成抑制素结合蛋白至今还未在肿瘤细胞中被检测到，但少量血管生成抑制素结合蛋白可由某些恶性肿瘤表达，因此可用作肿瘤特异性抗原。而不受理论所限，本发明涵盖了利用疫苗(即如本文所述)的免疫接种，其中与p130-血管生成抑制素结合蛋白有反应性的特异T细胞和/或抗体识别和摧毁表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的肿瘤细胞。利用血管生成抑制素结合蛋白作为肿瘤特异性抗原的所有免疫接种模式和方法使用如抗血管生成效果的免疫接种所示的相同方法。
对所属领域技术人员公知的是，给药疫苗(即通过受试者免疫系统作用的试剂)的分子和模式的选择不同于直接治疗剂的分子和模式的选择。例如，作为疫苗给药的血管生成抑制素结合蛋白分子或编码血管生成抑制素结合蛋白分子的多核苷酸与非疫苗血管生成抑制素结合蛋白治疗实体间的差异包括以下中一种或多种。
非疫苗治疗实体必须保持血管生成抑制素结合蛋白分子的功能(例如结合血管生成抑制素的能力；或与细胞成分相互作用的能力)。在另一方面，疫苗分子不必是功能性血管生成抑制素结合蛋白分子，但可以是(尽管不必是)最小的功能性衍生物(包括片段)或类似物，其能产生与天然血管生成抑制素结合蛋白分子在免疫上交叉反应的免疫应答。
通常疫苗剂量比非疫苗治疗剂量低一或两个数量级，例如以“每kg体重”为基础测得的。
疫苗可包括(或带有)“佐剂”，如细胞因子、BCG和/或明矾，其能增强免疫应答。对于非疫苗疗法，没有这些伴随物。例如在本案例中，在针对“自我”蛋白质进行免疫时——即在针对人中的人蛋白质免疫时，佐剂尤其重要。
尤其考虑到血管生成抑制素结合蛋白分子作用的机理(延迟血管生成)，非疫苗治疗实体将必须几乎每天给药，而相反涉及增强剂的疫苗给药在两或三周中只一次。例如，以几周间隔的一次或两次给药对于基因疫苗或多肽/肽疫苗来说是必要的。
非疫苗载体应当能以高水平表达功能性分子(如本发明的多肽)；这在实践中非常难以实现。DNA疫苗能以低得多的水平表达免疫性抗原。许多合适的载体和启动子系统是已知的，例如基于CMV启动子的系统。免疫性抗原可以是血管生成抑制素结合蛋白的最小的非功能性肽或结构域，其能并足以产生抗天然血管生成抑制素结合蛋白的免疫应答(抗体和/或T细胞)。功能性血管生成抑制素结合蛋白分子不需被使用。
本发明的药物组合物、药物或疫苗可局部性、局部、全身或肠内给药以产生长期的免疫。产生的免疫应答阻止新血管形成，而且防止新血管化对肿瘤形成或其它血管发生/血管生成相关疾病发挥预防或治疗效果。
本发明使用的多肽片段可包含至少一个结构域，即能、或预计能以与其在全长多肽中折叠的相似方式独立折叠的部分。利用计算机分析鉴定这样的结构域的方法(例如，将对疏水性和/或形成α螺旋的可能性的分析加以合并)是公知的。独立折叠的能力对于产生抗体应答而言是重要的，但对于诱导T细胞应答而言不被认为是重要的，因为多肽被降解了并呈递为肽片段。
可用一种或多种代表p130-血管生成抑制素结合蛋白的一种或多种表位的肽或肽模拟化合物。例如，可用短肽，例如多至约15、12、10或9个氨基酸(或编码该短肽的多核苷酸)。对于表位，如所属领域技术人员公知的，其包括模拟表位。
表位序列可用公知的技术来鉴定，如那些在Epotope Mapping Protocols(1996)Methods Mol Biol 66(Glenn E Morris，编，Humana Press，Totowa，New Jersey)；美国专利4,708,871；Geysen等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.813998-4002；Geysen等，1986，Mol.Immunol.23709-715中所述的。线性或构型表位的鉴定可利用诸如X-射线晶体学或2D-核磁共振衍生的结构数据来进行。抗原性或疏水性图(如利用OMIGA软件产生的，该软件可得自Oxford Molecular Group，其基于Hopp等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.783824-3828和Kyte等，1982，J.Mol.Biol.157105-132的算法)也可用于鉴定表位。
抗体可用作疫苗中的抗原。例如，给药针对所要靶向(如血管生成抑制素结合蛋白)的抗体的抗体，而免疫系统的B细胞产生抗该抗体的抗体，其也能识别所要的靶位。这被称为抗独特型疫苗，而且与被动抗体治疗有区别，其中针对所要靶位的抗体被给药。
本发明还提供了基于p130-血管生成抑制素结合蛋白的疫苗和其他类型的靶向内皮细胞或产物的抗血管生成疗法的组合。因而，例如，疫苗可进一步包含适于用作抗血管生成促进多肽(例如VEGFR-2(例如登录号AF063658)或Tie2(例如登录号BC035514))的免疫原的多核苷酸或多肽(或肽模拟化合物)。这些其它血管生成促进多肽衍生的序列(例如VEGFR-2序列)可与本发明的多肽/多核苷酸包括在相同或不同多肽(或如合适，为多核苷酸)中。治疗或疫苗可进一步包括免疫治疗，其基于给药带有抗肿瘤效应的细胞因子或肿瘤抗原，例如给药pDNA疫苗、病毒载体、或在DC细胞中表达或负载在DC细胞上。
疫苗可包含其它多肽或多核苷酸，这对于所属领域技术人员来说是显然的。例如，一种或多种多肽或一种或多种多核苷酸可以重组生物体或其部分、或其产物(如细胞培养上清液)的形式被包含在疫苗中，优选是微生物，优选能表达一种或多种多肽，即能表达血管生成抑制素结合蛋白氨基酸序列，或可选地能将编码一种或多种多肽的核酸递送到其表达的宿主细胞中。重组微生物优选是非毒性微生物，这对所属领域技术人员来说是公知的。例如，重组微生物可以是双歧杆菌或乳酸杆菌、或减毒的沙门氏菌或BCG或减毒的大肠杆菌。重组生物体可选的还可以是植物，例如利用WO97/40177的教导。
进一步可选的是，疫苗可以由完整的真核细胞或细胞所含物质所构成。例如，细胞可衍生自疫苗所要针对的生物体类型。细胞可以是重组的，如衍生自能表达本发明多肽的和/或用本发明多核苷酸转染的细胞系的细胞。细胞可以被辐照、热灭活或用多聚甲醛固定，并用于免疫。
细胞可以是表达本发明的p130-血管生成抑制素结合蛋白的肿瘤细胞，或人源或来源于其它物种的异种的、表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的新移植或培养的内皮细胞，或用p130-血管生成抑制素结合蛋白或该分子部分转染并表达它的细胞。另外，细胞可以是抗原呈递细胞(APC)，如树突细胞(DC)，其负载有本发明的多肽或用本发明的多核苷酸转染。肿瘤细胞疫苗(其不必包含p130-血管生成抑制素结合蛋白抗原)与本发明的疫苗一起使用。对于完整的细胞疫苗，肿瘤细胞取自一个或多个患者，并在实验室中生长。然后处理肿瘤细胞以确保1)它们不再增殖，和2)没有能感染患者的东西。
有两种类型的完整细胞癌症疫苗。自体同源的完整细胞疫苗用患者自己的完整、失活的肿瘤细胞制备。异源的完整细胞疫苗用别人的完整、失活的肿瘤细胞或几个人肿瘤细胞组合来制备。
APC疫苗包含抗原呈递细胞，通常是树突细胞。例如，癌症疫苗可由用肿瘤抗原刺激或在肿瘤抗原存在的情况下生长的树突细胞制成。用抗原刺激的树突细胞(或APC)在它们的表面带有肿瘤抗原，当注射时，可有力激活T细胞。
抗原疫苗包含一种或多种包含于肿瘤中的抗原。一些抗原是所有特定类型癌症所共有的，而一些抗原是个体特有的。一些抗原是不同类型癌症肿瘤间共有的。
本发明的多肽可以是肽模拟化合物，例如对应于血管生成抑制素结合蛋白表位或模拟表位。术语“肽模拟物”指化合物，其模拟作为治疗剂的特定肽的构型和所需特征，但避免了不需要的特征。
涉及肽的治疗用途是有限的，这归因于缺乏口服生物利用度以及蛋白酶水解降解。例如，通常肽迅速在体内通过外切和内切肽酶降解，一般会造成非常短的生物半衰期。肽用作潜在治疗剂的其它的缺陷是它们缺乏通过口服给药的生物利用度。蛋白水解酶在胃肠道中降解肽可能是重要的起作用的因素。可是，问题更复杂，因为已认识到即使不被迅速代谢失活的小的环肽也显示出不好的口服生物利用度。这可能归因于不良的穿过肠膜的传输和由肝提取将其迅速清除出血液并然后排出到肠中。这些观察结果提示多种酰胺键可干扰口服生物利用度。据信，肽链中连接氨基酸残基的肽键可在肽药物口服给药时被打断。
有一些不同方法来设计和合成肽模拟物。在一种方法中，如Sherman和Spatola(1990，J.Am.Chem.Soc.112433)所公开的，一种或多种酰胺键以基本电子等排(isoteric)的方式被各种化学功能性基团所替代。该阶梯式的方法取得了一些成功，由此获得了活性类似物。在一些情况下，这些类似物显示比它们的天然产生的对应物具有更长的生物半衰期。然而，该方法有局限性。成功地替换超过一个酰胺键是很少见的。因此，产生的类似物仍旧易于在分子的其它地方被酶促失活。当替换肽键时，优选新的接头部分与肽键有基本相同的电荷分布和基本相同的平面性。
可用现有已知的方法合成逆-反肽模拟物(retro-inverso peptidomimetics)(其中肽键被翻转了)，例如在Meziare等，1997，J.Immunol.1593230-3237中所述的。该方法包括制造假肽，其含涉及骨架、而不涉及侧链定向的变化。逆-反肽，其包含替代CO-NH肽键的NH-CO键，对蛋白水解更有抗性。
在另一种方式中，各种非编码或修饰的氨基酸(如D-氨基酸和N-甲基氨基酸)被用于修饰哺乳动物肽。另外，推测的生物活性构型通过共价修饰(如环化)或通过掺入γ-内酰胺或其它类型的桥接来稳定。如参见Veber等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，752636(1978)和Thursell等，Biochem.Biophys.Res.Comm.111166(1983)。
在许多合成策略中的共同主题是将一些环化部分导入基于肽的框架中。环化部分限制了肽结构的构型空间，而且这经常造成增加肽对特定生物受体的亲和力。该策略外加的优势是将环化部分导入肽也可使得肽减少对细胞肽酶的敏感性。
合成环化稳定的肽模拟物的一种方法是环封闭换位(RCM)。该方法包括的步骤有合成肽前体和将其与RCM催化剂接触以产生构型限制性肽。合适的肽前体可包含两个或更多个不饱和C-C键。该方法可利用固相肽合成技术来进行。在该具体实施方式
中，锚定于固相支持物上的前体与RCM催化剂接触，然后从固相支持物上裂解下产物从而产生构型限制性肽。
其中一种或多种氨基酸残基在多肽合成之前或之后被化学修饰了多肽可用作抗原，只要多肽的功能，即体内特异性免疫应答的产生基本保持不变。这些修饰包括与酸或碱成盐，尤其是与生理上可接受的有机或无机酸或碱成盐，形成末端羧基的酯或酰胺，和连上氨基酸保护基团，如N-叔丁氧羰基。这些修饰可保护多肽不被体内代谢。多肽可以被甘露糖化或以其它方式修饰以增加其抗原性，或与化合物组合增加其抗原性和/或免疫原性。
源于p130-血管生成抑制素结合蛋白的激动性表位的用途也包括在本发明中。设计激动性表位从而通过更有效地活化MHC I类或MHC II类限制性CD8或CD4+T细胞来更高效地活化免疫系统。有两种常规的方法包括在本发明中用以从T细胞表位来设计激动剂表位。一种方法进行修饰HLA锚定残基，造成较高的HLA I类或II类结合。该方法已成功用于源于肿瘤抗原或微生物抗原的几种HLA I类结合肽。另外，在T细胞受体(缩写为TCR)接触中涉及的残基替换也可造成增加由T细胞引发的应答，而且这为本发明所涵盖。
一般而言，如所属领域技术人员公知的，而且例如US 5,869,445所述的，氨基酸替换可以各种方式制备从而提供本发明内变体的其它具体实施方式
。例如，首先，氨基酸替换可以是保守地制备出的；即，替换氨基酸代替具有相似性质的氨基酸，由此，肽化学领域技术人员将能预期多肽二级结构和疏水性质基本不变。一般而言，以下氨基酸组代表保守改变(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。非保守改变的例子是用另一组的氨基酸替换一个组的氨基酸。
其它制备氨基酸替换物以产生本发明变体的方式是鉴定并替换T细胞基序中潜在结合II类MHC分子(对于CD4+T细胞应答)或I类MHC分子(对于CD8+T细胞应答)的氨基酸。带有潜在结合II类MHC分子的基序的肽片段可以通过计算机分析来鉴定。例如，可用蛋白质序列分析软件包——T Sites，其整合了几种设计用来区分潜在T细胞识别位点的计算机算法(Feller和de la Cruz，1991，Nature 349720-721)。使用两种搜索算法(1)AMPHI算法，其在Feller和de la Cruz，1991，Nature 349720-721；Margalit等，1987，J.Immunol.1382213-2229中有描述，根据α螺旋周期性和两亲性来鉴定表位基序；(2)Rothbard和Taylor算法，其根据电荷和极性模式来鉴定表位基序(Rothbard和Taylor，988，EMBO J.793-100)。带有这两个基序的片段最适于结合II类MHC分子。CD8+T细胞识别结合I类MHC分子的肽。Falk等证实了结合特定MHC分子的肽共有可分辨的序列基序(Falk等，1991，Nature，351290-296)。结合于HLA-A2.1凹陷处的肽基序通过Edman降解从培养的细胞系的HLA-A2.1分子上剥离下的肽来确定(表2，来自Falk等，见前)。该方法将典型或平均HLA-A2.1结合肽鉴定为有9个氨基酸长、在第2(L)和9(V)位带有优势性锚定残基。通常发生的强结合残基被鉴定出处于第2(M)、4(E、K)、6(V)、和8(K)位。鉴定出的基序代表许多结合肽的平均情况。
表位(例如形成表位的氨基酸序列，或被认为包含抗血管生成表位的区域)可以单拷贝或多拷贝(例如串联重复序列)形式出现。该串联或多重复序列本身可有足够的抗原性从而避免使用载体。以下情况对于多肽是有益的成环，N末端和C末端连接在一起，或将一种或多种Cys残基加到末端以增强抗原性和/或使二硫键形成。如果表位(例如形成表位的氨基酸序列)共价连于载体上，优选连于多肽上，则优选进行排列以使形成表位的氨基酸序列成环。
根据当前的免疫学理论，载体功能应当出现在任何免疫原性制剂中以刺激、或增强刺激免疫系统。以上本发明前述方面定义的一个或多个表位可以与分离的载体(如血清白蛋白、肌红蛋白、细菌类毒素和钥孔血蓝素)相连，例如通过交联。本发明的多肽本身可用作载体或佐剂。较近开发的载体在免疫应答中诱导T细胞的辅助，其包括乙型肝炎核心抗原(也被称为核壳蛋白)、推测的T细胞表位，如Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys、β-半乳糖苷酶和白细胞介素-1的163-171位肽。后者的化合物可另外被视为载体或佐剂或这两者。
另外，有几个拷贝的相同或不同表位可以相互交联，在这种情况下没有分离的载体，而载体功能可由该交联来提供。合适的交联剂包括列于Sigma和Pierce目录的那些，例如戊二醛、碳化二亚胺和琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己胺-1-羧酸酯，后一试剂利用C末端半胱氨酸残基(如果存在)上的-SH基团。可使用任何交联多肽的常规方法，如在O′Sullivan等，1979，Anal.Biochem.100100-108中有常规描述的那些。例如，第一部分可以富含硫醇基团，而第二部分能与能与硫醇基团反应的双功能试剂反应，双功能试剂例如碘乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHIA)或N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)、在缀合的部分间整合了二硫桥接的杂双功能交联剂。酰胺和硫醚键(例如用m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯得到的)通常在体内较二硫键更稳定。
其它有用的交联剂包括S-乙酰基硫代乙二醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SATA)，其是针对伯胺的硫醇化试剂，其在温和条件下使巯基去保护(Julian等，1983，Anal.Biochem.13268))；二甲基软木脂亚胺酯二盐酸(dimethylsuberimidate dihydrochloride)和N，N′-邻-亚苯基二马来酰亚胺。
如果多肽通过合适的核苷酸序列在合适的宿主中表达来制备，则多肽作为与用作载体的肽序列的融合产物来表达是有益的。Kabigen的“Ecosec”系统就是这种排列的实例。
其它可用佐剂包括WO 02/053181中所述的佐剂，例如VSA3，其包括DDA(参见美国专利5,951,988)。
可用于制备合适重组多肽或多核苷酸的合适的载体或构建体对所属领域技术人员来说是已知的。能表达所需一种或多种多肽的多核苷酸可利用所属领域技术人员公知的技术来制备。
希望多核苷酸能在接受者中表达一种或多种多肽，从而向人或动物给药多核苷酸，导致在人或动物中表达抗原多肽(即源于血管生成抑制素结合蛋白并任选其它多肽的序列)。一种或多种多肽(例如p130-血管生成抑制素结合蛋白)可由任何下述合适的多核苷酸(遗传构建体)表达并递送到接受者。通常，表达多肽的遗传构建体包含编码所述多肽的多核苷酸序列，其可操作地连于能在接受者细胞中表达转录的多核苷酸(如mRNA)分子的启动子，其可以被翻译以合成所述多肽。合适的启动子对所属领域技术人员来说是已知的，可包括针对普遍表达的基因(例如管家基因)或针对组织选择性基因的启动子，这取决于希望在哪里表达所述多肽(例如，在树突细胞或其它抗原呈递细胞或其前体中)。优选地，使用树突细胞或树突前体细胞选择性启动子，但这不是必需的，特别是如果多核苷酸的递送或摄取靶向于所选择的细胞，如树突细胞或前体。树突细胞选择性启动子可包括CD83或CD36启动子。
其它希望与本发明疫苗一起表达或组合的多肽/蛋白质包括免疫刺激剂，如细胞因子或生长因子。实例包括GM-CSF、IL-2、IL12或IL-15。其它可表达或被包括入的免疫刺激剂是结合所谓Toll受体的因子，其包括小免疫刺激分子Imiquimod、微生物产物(如鞭毛蛋白)、或未甲基化的细菌CpG基序、或基于CpG基序的寡核苷酸。
能表达一种或多种多肽的多核苷酸序列优选可操作地与表达所述序列所需的调节元件相连。
“可操作地相连”指邻接从而能执行成分的正常功能。因而，编码序列“可操作地相连”于调节元件指其中编码抗原(或免疫刺激分子)的核酸序列能在调节序列控制下表达的构型。
“调节序列”指在特定宿主生物体中表达可操作相连的编码序列所需的核酸序列。例如，适于真核细胞的调节序列有启动子、聚腺苷化信号、和增强子。
“载体”指DNA分子，其包括单链、双链、环或超螺旋DNA。合适的载体包括反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒和细菌质粒。反转录病毒载体是反转录病毒，其通过将它们的基因组随机整合入宿主基因组而复制。合适的反转录病毒载体在WO 92/07573中有描述。
病毒载体应当不能使人生病或带来任何疾病。这些病毒能在实验室中通过基因工程制备，从而使它们在感染人细胞时，细胞将在其表面产生并展示所需的抗原。病毒应仅能感染少量人细胞——足以引发免疫应答，但不足以使人生病。
病毒也能通过基因工程来制备细胞因子或在它们的表面展示蛋白质，帮助活化免疫细胞。这些能单独或与疫苗一起给药以辅助免疫应答。
腺病毒包含线性双链DNA基因组。合适的腺病毒载体在Rosenfeld 等，1991，Science，252432中有描述。
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒属并包含约4-6KB的单链DNA基因组。
痘病毒载体是大的病毒并具有几个可插入基因的位点。它们是热稳定的，可以在室温下储存。安全性研究表明痘病毒载体是复制缺陷的，并不能从宿主转移到宿主或环境中去。
可将疫苗靶向特异细胞群(例如APC)，例如，通过注射位点，应用靶向载体和递送系统，或从接受者中选择性纯化该细胞群并先体外后体内(ex vivo)给药肽或核酸(例如树突细胞可以如Zhou等，1995，Blood，863295-3301；Roth等，1996，Scand.J.Immunology 43，646-651所述进行分选)。另外，靶向载体可包括组织或肿瘤选择性启动子，其指导抗原在合适的位置表达。
尽管包含本发明多核苷酸的遗传构建体可以是DNA或RNA，但优选是DNA。优选地，遗传构建体适于向人细胞进行递送。
将遗传构建体导入细胞或从动物体中去除的方式和方法是现有已知的。例如，本发明的构建体可通过常规方法导入细胞，例如涉及反转录病毒的方法，从而使构建体被插入(分裂)细胞的基因组中。被靶向的反转录病毒可用于本发明中；例如，提供特异结合亲和力的序列可以通过基因工程导入预先存在的病毒env基因中(参见Miller & Vile，1995，Faseb J.9190-199对此和其它用于基因疗法的靶向性载体的综述)。
优选的反转录病毒载体可以是慢病毒载体，如在Verma & Somia，1997，Nature，389239-242中所述的那些。
其它方法包括简单地将构建体递送进细胞中，用于在有限的时间内表达，或者在整合入基因组中后，在较长时间内表达。后者方法的例子包括脂质体(Nssander等，1992，Cancer Res.52646-653)。其它递送方法包括腺病毒，其通过抗体-聚赖氨酸桥带有外源DNA，(参见Curiel Prog.Med.Virol.401-18)，和作为载体的铁传递蛋白-聚阳离子缀合物(Wagner等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873410-3414)。在这些方法中的第一个方法中，与本发明的DNA构建体或其它遗传构建体形成聚阳离子-抗体复合物，其中抗体特异针对野生型腺病毒或其中新的表位被导入以结合抗体的变体腺病毒。聚阳离子部分通过与磷酸骨架静电相互作用来结合DNA。腺病毒，因为含不变的纤维和五邻体蛋白质，进入细胞，并随着它将本发明的DNA构建体带入细胞。优选聚阳离子是聚赖氨酸。
合适的细菌递送方法描述于Dietrich，2000，Antisense Nucleic Acid DrugDelivery，10391-399。例如，减毒的细菌株通过粘膜表面给药重组疫苗。尽管减毒细菌一般通过遗传工程来表达异源抗原，其它方法使用细胞内细菌来递送真核抗原表达载体(DNA疫苗)。该策略能通过细菌感染直接递送DNA到专门的抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞和树突细胞(DC)。用于DNA疫苗递送的细菌在被APC吞噬后进入宿主细胞胞质，例如，志贺氏菌和李斯特氏杆菌，或它们仍留在吞噬体小室中，如沙门氏菌。细菌载体的这两种细胞内定位都适于成功递送本发明的DNA疫苗载体。
表达本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽可在诱导型细菌启动子控制之下进行，例如在细菌遭遇或进入宿主生物体环境(例如宿主肠道)或结合或进入宿主细胞时能诱导的启动子。
本发明的多核苷酸可用“基因枪”皮内免疫接种、肌肉内注射、或皮内或肌肉内注射的质粒DNA免疫接种来给药，然后在注射位点进行皮肤或肌肉内“电穿孔”，以此增加免疫接种的功效。
例如如下所述，DNA也可通过腺病毒递送，其中它存在于腺病毒颗粒内。
可用高效核酸递送系统，其利用了受体介导的内吞作用将DNA大分子带入细胞。这通过缀合铁传输蛋白质(铁传递蛋白)与结合核酸的聚阳离子来进行。人铁传递蛋白、或鸡同源物伴清蛋白、或其组合通过二硫连接共价连接于小DNA结合蛋白质鱼精蛋白或各种大小的聚赖氨酸。这些修饰的铁传递蛋白分子保持了结合其同类受体和有效介导铁转移入细胞的能力。铁传递蛋白-聚阳离子分子与本发明的DNA构建体或其它遗传构建体形成了在电穿孔时稳定的复合物，而无论核酸大小(可从短的寡核苷酸至21千碱基对的DNA)。当铁传递蛋白-聚阳离子和本发明的DNA构建体或其它遗传构建体的复合物用于靶细胞时，预计构建体在细胞中高水平表达。
也可利用本发明的DNA构建体或其它遗传构建体的高效受体介导的递送，其利用由Cotten 等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896094-6098的方法产生的有缺陷或化学失活的腺病毒颗粒的核内体干扰活性。该方法似乎依赖以下事实，即腺病毒被修饰以从核内体中释放出它们的DNA而不经过溶酶体，并且在存在诸如与本发明的DNA构建体或其它遗传构建体相连的铁传递蛋白的情况下，该构建体被细胞以与腺病毒颗粒相同的途径摄入。
该方法具有以下优点，即无需利用复杂的反转录病毒构建体；不像反转录病毒感染那样永久修饰基因组；和靶向的表达系统与靶向的递送系统偶联，因而减轻了对其它细胞类型的毒性。
“裸DNA”和与阳离子和中性脂复合的DNA也可用于将本发明的DNA导入接受者细胞中。非病毒方法进行基因治疗在Ledley，1995，Human GeneTherapy，61129-1144中有描述。其它靶向性递送系统也是已知的，如WO 94/10323所述的修饰的腺病毒系统，其中通常DNA被携带在腺病毒、或腺病毒样颗粒中。Michael等，1995，Gene Therapy，2660-668描述了修饰腺病毒从而将细胞选择性部分加到纤维蛋白上。突变的腺病毒选择性地在p53缺陷型人肿瘤细胞中复制，如Bischoff等，1996，Science，274373-376所述的那些，其也可用于将本发明的遗传构建体递送到细胞中。其它合适的病毒或病毒样颗粒包括HSV、AAV、痘苗病毒、慢病毒和细小病毒。
免疫脂质体(导向抗体的脂质体)尤其可用于靶向过表达细胞表面蛋白质的细胞类型，所述细胞表面蛋白质的抗体是可得到的，例如使用针对CD1、CD14或CD83(或其它树突细胞或前体细胞表面分子)的抗体，就像在树突细胞或前体中可能的那样。为了制备免疫脂质体，根据Martin&Papahadjopoulos，1982，J.Biol.Chem.257286-288的方法合成MPB-PE(N-[4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酰]-磷脂酰乙醇胺)。MPB-PE被整合入脂质体双层中从而能将抗体、或其片段和脂质体表面共价偶联。脂质体方便地装载有本发明的DNA或其它遗传构建体用以向靶细胞递送，例如，可通过在DNA或其它遗传构建体溶液中形成所述脂质体，然后接着在多至0.8MPa的氮气压力下通过0.6μm和0.2μm孔径的聚碳酸酯过滤膜顺序挤出来进行。挤出后，80000xg超离心45分钟来将包裹的DNA构建体从游离的DNA构建体中分离出。新制备的溶于去氧缓冲液的MPB-PE-脂质体与新制备的抗体(或其片段)混合并在4℃在氮气下恒定翻转过夜而来进行偶联反应。80000xg超离心45分钟来将免疫脂质体从未缀合的抗体中分离出。例如可通过腹膜内或例如可皮下直接导入存在靶细胞的位点来注射免疫脂质体，。
将能理解的是，希望能暂时在细胞中调节一种或多种多肽(例如抗原多肽)的表达。因而，可能希望直接或间接在可调节启动子控制下表达多肽，例如当希望活化或减弱(取决于小分子是否活化或减弱所述启动子)多肽表达时，可通过向接受者给药的小分子的浓度来调节。将能理解的是，如果表达构建体是稳定的，即能在所述细胞中表达多肽(在存在任何必要调节分子的情况下)至少一周、一、二、三、四、五、六、八个月或一或多年，这是特别有益的。优选表达构建体在所述细胞中能表达多肽少于一月时间。本发明优选的构建体可包含可调节的启动子。可调节的启动子的例子包括以下论文提及的那些Rivera等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，968657-62(由雷帕霉素控制，其为口服的生物利用的药物，其利用两个分离的腺病毒或腺相关病毒(AAV)载体，一个编码诱导型人生长激素(hGH)的靶基因，而另一个编码双向雷帕霉素调节的转录因子)；Magari等，1997，J.Clin.Invest.1002865-72(由雷帕霉素控制)；Bueler，1999，Biol.Chem.380613-22(腺相关病毒载体的综述)；Bohl等，1998，Blood，921512-7(腺相关载体中由强力霉素控制)；Abruzzese等，1996，J.Mol.Med.74379-92(综述，涉及诱导因子，如激素、生长因子、细胞因子、细胞抑制素、放射性、热休克和相关应答元件)。也可用四环素诱导型载体。通过显示能用于在哺乳动物细胞培养物中调节表达的相对非毒性的抗生素可活化这些载体。而且，基于类固醇的诱导子尤其可用，这是因为类固醇受体复合物在转录前进入DNA载体必须被隔离的核中。
通过在两种水平上调节表达可进一步改善该系统，例如通过利用组织选择性启动子和由外源诱导子/弱化子(例如上述和所属领域技术人员已知的小分子诱导子)控制的启动子。因此，一种调节水平可包括将合适的编码多肽的基因与诱导型启动子连接，而另一种调节水平必须使用组织选择性启动子来驱动编码所需诱导型转录因子(其控制在诱导型启动子下编码多肽(例如抗原多肽)的基因表达)的基因。通过细胞类型特异性靶向遗传构建体可进一步改善控制。
利用现有公知的方法可制备本发明的构建体。
治疗剂或分子(疫苗)，例如抗原分子，例如本发明的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸和/或抗体或其制剂，可通过常规方法给药，方法包括口服和非肠道(如，皮下或肌肉内)注射。优选的途径包括口服、鼻内或肌肉内注射。治疗可由一段时期单剂或数剂组成。将会理解的是，优选诱导子(例如上述小分子诱导子)可口服给药。
向接收者细胞递送包含编码本发明的针对的多核苷酸(或反义多核苷酸)的遗传构建体(例如腺病毒载体构建体)的方法对于所属领域技术人员来说是公知的。尤其可用可采用的治疗规程，更优选可用基因枪来递送构建体至树突细胞，例如在皮肤中。
可采用的治疗规程描述于Nestle等，1998，Nature Med.4328-332和De Bruijn等，1998，Cancer Res.58724-731。
治疗剂(疫苗)可向正在用某些其它方法治疗疾病的受试者给药。因而，尽管可单独用治疗方法，但希望用它作为辅助疗法来治疗，例如随同常规预防性或治疗性方法或靶向肿瘤抗原的免疫治疗使用。例如，本发明的疫苗与基于肿瘤抗原的、以肽、蛋白质、寡核苷酸或完整肿瘤细胞给药的疫苗的组合可成为合适的组合疗法。
尽管可能单独给药本文所述的治疗分子，例如抗原分子或免疫刺激分子，优选将其与一种或多种可接受的载体在一起作为药物制剂。一种或多种载体必须是“可接受的”，其含义为与治疗分子(其可以是核酸或多肽)相容，和不对其接受者有害。通常，载体将是无菌的和无热源的水或盐水。
药物组合物可进一步包含用于增加组合物抗原性和/或免疫原性的成分，例如上述佐剂和/或细胞因子。可用多价抗原(抗原簇)。
商品型细胞因子已被用于非特异性免疫治疗以全面增强免疫系统，并用于作为佐剂与诸如肿瘤疫苗的其它免疫治疗剂一起给药。正在测试GM-CSF用作抗癌的可非特异性免疫治疗并用于作为与其它类型的免疫治疗剂一起给药的佐剂。
已知各种其它化合物能增强免疫系统的活性，而且现在正在研究其能否用作佐剂，尤其用于疫苗疗法。一些最常研究的佐剂如下列，但更多的在开发之中。
左咪唑，一种最先用于抗寄生虫感染的药物，最近被发现当与一些化疗药物一起使用时能改善结肠直肠癌患者的存活率。它常用作免疫治疗佐剂，因为它能活化T淋巴细胞。左咪唑现在常规用于患有某些阶段的结肠直肠癌的人，并正在临床试验中测试能否用于治疗其它类型的癌症。
氢氧化铝(明矾)是癌症疫苗临床试验中最常用的佐剂之一。它已经用于抗几种传染源、包括乙型肝炎病毒的疫苗中。
卡介苗(BCG)是细菌，其与造成肺结核的细菌相关。BCG感染对免疫系统的效应使该细菌能用作抗癌免疫治疗剂。BCG是最早用于抗癌的免疫治疗剂之一。FDA批准其用于常规治疗表面膀胱癌。也正在测试它能否用于其它癌症中作为非特异佐剂。研究人员正在关注在化疗、放疗或其他类型的免疫治疗时注射BCG以增强免疫系统。
不完全福氏佐剂(IFA)与一些实验性疗法一起使用以帮助刺激免疫系统并增强对癌疫苗的免疫应答，IFA是由溶于白色矿物油中的乳化剂组成的液体。
QS-21是相对较新的免疫刺激物，其由植物提取物制成，能增加对用于抗黑素瘤的疫苗的免疫应答。
DETOX是另一种相对新的佐剂。它由细菌细胞壁的部分和一种脂肪制成。它与各种免疫疗法一起使用以刺激免疫系统。
钥孔血蓝素(KLH)是另一种佐剂，用于提高癌疫苗疗法的有效性。它提取自一类海洋软体动物。
二硝基苯基(DNP)是半抗原/小分子，其能附着于肿瘤抗原并增强免疫应答。在某些癌疫苗中，它被用于修饰肿瘤细胞。
本发明的第八方面提供了本发明的抗体或片段检测和/或测量测试样品中血管生成和/或肿瘤形成的用途。例如，测试样品(如血清、提取自肿瘤的肿瘤蛋白提取物或mRNA)可用于定量p80-和/或p130-血管生成抑制素结合蛋白多核苷酸和/或多肽和/或抗p80-和/或p130-血管生成抑制素结合蛋白的抗体的水平。许多公知的方法可用于该目的，包括ELISA和/或实时聚合酶链式反应(PCR)测试。将能理解的是，利用由要分析的测试样品决定的体外和/或体内方法可检测和/或测量血管生成和/或肿瘤形成。
本发明的第九方面提供了用于调节血管生成和/或肿瘤形成的药物组合物，其包含有效量的本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或本发明的抗体或片段，和药物赋形剂或稀释剂。
对于“有效量”，我们包括足以调节血管生成和/或肿瘤形成的量。用于测量受试者(如人)中血管生成和/或肿瘤形成水平的方法对于所属领域技术人员来说是公知的。
例如，肿瘤形成可在鼠肿瘤细胞系(如小鼠乳腺癌系D2F2、和淋巴瘤系EL-4)中评估。肿瘤体内形成可在模型系统中测定，如小鼠转基因乳腺癌模型BALB-neuT，其能由于在小鼠乳腺肿瘤病毒启动子控制下过量表达转化的大鼠Her.2/neu癌基因而自发发展出肿瘤(Boggio等，1998，J.Exp.Med.188589-96)。
这些模型中宿主免疫系统的状态可利用已知的免疫学测试来评估，其测量CD8+和CD4+T细胞应答(如ELISPOT测试)、细胞因子释放测试和T细胞增殖测试以及测量抗体应答的测试(如ELISA测试)和基于流式细胞仪的测试。肿瘤中的新血管化可通过各种已知的测试来评估，包括“基质胶-拴”测试(描述于诸如，London等，2003，Cancer Gene Ther.10823-832)或基于成像的测试，如皮肤-皮片窗-室模型。
通过利用这种方法在受试者中确定用一定量的本发明的多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或抗体或片段治疗之前和之后血管生成水平，可在体内来确定有效量。另外，药物的有效范围可通过利用诸如实施例所述方法体外测试药物来获得。
优选地，药物组合物防止和/或减轻血管生成和/或肿瘤形成。
本发明的第十方面提供了用于调节血管生成和/或肿瘤形成的疫苗，其包含有效量的本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)，和赋形剂或稀释剂。
有一些动物研究证明了疫苗候选物可起预防性(即在用肿瘤细胞刺激过的动物中防止肿瘤)和治疗性(即给药疫苗可造成先前建立的肿瘤的消退)作用，例如Cavallo等，1993，Cancer Res.215067；Nanni等，2001，J.Exp.Med.1941195。
优选地，本发明的疫苗或本发明的药物组合物进一步包含至少一种添加剂，其用于辅助或增强多肽和/或多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或其抗体或片段的作用。
更优选地，至少一种添加剂是免疫刺激分子，常规的是，细胞因子或编码细胞因子的多核苷酸(和/或反义多核苷酸)。
优选地，本发明的疫苗或本发明的药物组合物包含细胞或细胞提取物，更优选是APC，其负载有本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽或用本发明的编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)转染。
细胞通常是肿瘤细胞表达的血管生成抑制素结合蛋白或内皮细胞表达的血管生成抑制素结合蛋白。
本发明的第十一个方面提供了在哺乳动物中产生抗本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽的免疫应答的方法，该方法包括如下步骤 (iii)用本发明的血管生成抑制素结合蛋白多肽或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)先体外后体内刺激从哺乳动物中收集的免疫细胞； (iv)将经刺激的免疫细胞传输回哺乳动物，由此细胞传输回哺乳动物产生针对血管生成抑制素结合蛋白的免疫应答。
优选地，哺乳动物是人。
优选地，免疫应答起预防性或治疗性作用以抑制血管生成相关疾病的发生或发展。
在本发明的该方面中，本发明的多肽先体外后体内(即在受试者体外)刺激了受试者的免疫细胞。本发明的多核苷酸转染入抗原呈递细胞(APC)后，该多肽可呈递于患者的免疫细胞上，尤其是T细胞。抗原呈递细胞也可预先用本发明的多肽或源于它的肽处理。任何能刺激淋巴细胞的细胞类型在本文行文中都被定义为抗原呈递细胞；这些被认为包括源于单核细胞或骨髓淋巴细胞的树突细胞(DC)；和B细胞，其用分裂素刺激或用诸如Epstein Barr病毒(EBV)无限增殖。
可采用的将经刺激的免疫细胞传输回患者的方法可造成通过被传输的免疫细胞(主要是CD8+或CD4+型T细胞)识别在内皮细胞中表达的血管生成抑制素结合蛋白来抑制新血管生成，然后限制肿瘤发展或其它血管生成相关疾病。可采用的将经刺激的免疫细胞传输回患者的方法也可造成通过将肿瘤细胞中表达的血管生成抑制素结合蛋白被传输的免疫细胞(主要是CD8+或CD4+型T细胞)识别为肿瘤抗原来限制肿瘤发展。
优选地，在本发明的用途、药物组合物、疫苗或方法中，编码多核苷酸包含 (i)SEQ ID NO2的多核苷酸(和/或反义多核苷酸)；或 (ii)多核苷酸(和/或反义多核苷酸)，其与SEQ ID NO2具有至少80％和/或至少90％和/或至少95％和/或至少98％同一性和/或在65℃、2xSSC的条件下能与SEQ ID NO2杂交，和/或其编码功能性多肽；或 (iii)SEQ ID NO2的片段，其编码功能性多肽片段。
而且其中，多核苷酸(和/或反义多核苷酸)不编码p80-血管生成抑制素结合蛋白或p80-血管生成抑制素结合蛋白的片段。
本发明的多核苷酸和/或反义多核苷酸不包括与编码p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽和其片段的多核苷酸一致的那些。
本发明的多核苷酸可进一步包含上述调节序列和/或载体序列来使其在必要的宿主和/或靶细胞中复制和/或表达。
现有公知的是，那两个编码相同基因的核酸具有相似但不相同的核苷酸序列。基因的核苷酸序列中的变化是一种变化，其(i)用于产生蛋白质或其片段，其随后可用于制备特异于由所述基因编码的蛋白质的抗体，或(ii)对应于如上定义的(i)类基因或变体的反义序列。例如，可替换不同的密码子，其与原密码子编码相同的氨基酸。另外，替换的密码子可编码不同的氨基酸，其将不影响蛋白质的活性或免疫原性，或其可改善其活性或免疫原性。例如，定点突变或其它技术可用于产生单个或多个突变，如替代、插入、缺失、和转座，如Botstein等，1985，Science，229193-1210所述，其内容纳入本文参考。由于这些修饰的基因可通过将已知的技术应用于本文所包含的教导中来获得，因此这些修饰的基因在要求保护的发明的范围内。
而且，所属领域技术人员将认识到，本发明的基因序列(或其片段)可用于获得其它在高度严紧条件下与它杂交的DNA序列。这些DNA包括任何基因组DNA。因此，本发明的基因包括DNA，其编码本发明方法鉴定的基因推导的氨基酸序列有超过50％同一性的氨基酸序列，或包括DNA序列，其与本发明方法鉴定的基因有至少百分之55，优选百分之60，和最优选百分之70同源性，只要该同源DNA能用于本发明的方法中。本发明的基因还包括DNA，其编码与血管生成抑制素结合蛋白的至少200个氨基酸的序列有超过20％同一性的氨基酸序列。
DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂交可在包含0.1XSSC至6XSSC的水溶液中在55℃至70℃的温度下进行。现有公知的是，温度越高或SSC浓度越低，杂交条件越严紧。对于“高度严紧”，我们指2XSSC和65℃。1XSSC为0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠。
基因的变化包括这样的基因，其中相对短的一段序列(例如20至50个核苷酸)与本发明的基因的同等序列段具有高度同源性(至少50％和优选至少90或95％)，然而两个基因间的总体同源性可以低得多。这是因为即使当蛋白质的整体构架不同时，重要的活性或结合位点可以是共有的。
杂交反应的“严紧性”可由所属领域普通技术人员容易地确定，一般可根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度来经验性地计算。一般而言，越长的探针需要越高的正确退火温度，而较短的探针需要较低的温度。当互补链处于低于它们熔解温度的环境时，杂交一般取决于变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列间所希望的同源性程度越高，则可用的相对温度就越高。对于杂交反应严紧性的其它详情和解释，参见Ausubel等，1995，CurrentProtocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers)或在线规程URLwww.protocol-online.net/molbio/index.htm)。
“严紧条件”或高度严紧可由如下那些确定(1)用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.1XSSC，0.2％SDS@65-70℃。
“中度严紧条件”可由Sambrook等，2001，Molecular CloningALaboratory Manual(第3版)所述的来确定，并包括使用比上述的那些更不严紧的洗涤溶液和杂交条件(如温度、离子强度、和％SDS)。中度严紧条件的例子是0.2XSSC，0.1％SDS@58-65℃。普通技术人员将能认识到如何按需要调节温度、离子强度等以适应如探针长度、探针和靶位之间的同源性程度等。因此，除了感兴趣的序列之外，还预计与感兴趣的序列不同的其他或另外的探针序列也将能用于筛选感兴趣的序列。
现在将参考以下附图描述具体体现本发明某些方面的优选、非限制性的实例

图1鉴定p130-血管生成抑制素结合蛋白——血管生成抑制素结合蛋白的新剪接同工型。A针对血管生成抑制素结合蛋白的24个氨基酸的C末端的兔多克隆抗体识别293T细胞中的80kDa和130kDa的两种蛋白质。NIS＝非免疫血清。B对293T细胞进行免疫沉淀，在SDS PAGE上分离并用银染观察蛋白质。提取80kDa和130kDa的条带，并用质谱分析。红色(粗体文本)表示p130同工型(isoform)所特有的蛋白水解片段的序列。蓝色(下划线的文本)序列(410-1084)对应于也能在p80蛋白中找到的肽。当鉴定出能分辨各肽片段的一致序列时，用斜体表示。C外显子2和3间通过交互剪接产生了新的开放阅读框，导致p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端延伸。蓝色(1)对应于p130-血管生成抑制素结合蛋白中富含谷氨酰胺的结构域，红色(2)对应于卷曲-卷曲，黄色(3)对应于血管生成抑制素结合结构域，而绿松石色(4)对应于PDZ结合结构域。D如Western印迹所分析的，产生的抗p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端中的266个氨基酸的兔多克隆抗体能特异检测血管生成抑制素结合蛋白的130kDa同工型。PI＝免疫前血清，I＝免疫血清。
图2在胚胎和成体小鼠组织中p130-血管生成抑制素结合蛋白的表达。AWestern印迹分析胚胎期第5至19天时的小鼠胚胎中的血管生成抑制素结合蛋白的蛋白质水平。在胚胎期第5至18天表达p80-血管生成抑制素结合蛋白(箭头尖端)，而不能检测到p130-血管生成抑制素结合蛋白的蛋白质。BWestern印迹分析小鼠胎盘溶解产物，显示在胚胎期第11至19天表达p80-血管生成抑制素结合蛋白(箭头尖端)。P130-血管生成抑制素结合蛋白在胚胎期第13至16天表达(箭头)。C分析小鼠成体组织，显示在心、肺、肝、脾、卵巢、肝、胸腺、睾丸和胎盘中表达p80-血管生成抑制素结合蛋白(箭头尖端)。P130-血管生成抑制素结合蛋白仅仅在胸腺、睾丸和胎盘中被找到(箭头尖端)。星号表示非特异性条带。Lu，肺；Li，肝；Spl，脾，Ki，肾；St，胃；SI，小肠；SkM，骨骼肌；Ov，卵巢；Th，胸腺；Te，睾丸；Ut，子宫，P1，胎盘。DWestern印迹分析用载体、p-80血管生成抑制素结合蛋白和p-130血管生成抑制素结合蛋白逆转染的MAE细胞和在293T细胞、细胞滋养层、hTERT+-BCE细胞和BAE细胞中内源表达的两种同工型。箭头表示p130和p80条带的位置。
图3血管生成抑制素结合蛋白与ZO-1共定位于原代牛毛细管内皮细胞。A抗血管生成抑制素结合结构域抗体(绿)结合亚满板牛毛细管内皮(BCE)细胞细胞表面上的血管生成抑制素结合蛋白。抗陷窝蛋白(caveolin)细胞内表位的抗体(红)用作完整细胞膜的对照。当细胞满板时，细胞表面染色丧失了。B内源血管生成抑制素结合蛋白与ZO-1共定位于满板的BCE细胞。满板的BCE细胞用Triton X-100进行渗透并用抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体(绿)和抗ZO-1的抗体(红)染色。显示两幅图重叠(合并)，共定位情况显示作黄色。C细胞密度调节血管生成抑制素结合蛋白p80和p130同工型的表达。细胞以所示密度铺板，并通过Western印迹分析血管生成抑制素结合蛋白的表达。刻度表示20μm。
图4在出生后小鼠视网膜血管形成期间血管生成抑制素结合蛋白与ZO-1共定位于血管中。用抗ZO-1(红)、抗CD31/PECAM(红)的抗体和抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体(绿)通过整标本(whole-mount)荧光显微镜分析出生后第5天的小鼠视网膜。显示两幅图重叠(合并)，共定位情况显示作黄色。A血管中表达血管生成抑制素结合蛋白，这通过内皮标记CD31/PECAM来显示。B血管生成抑制素结合蛋白与ZO-1共定位于视网膜血管中细胞-细胞接触面上。C放大血管的一部分，显示出在细胞-细胞接触面上共定位的血管生成抑制素结合蛋白和ZO-1。刻度表示10μm。
图5血管生成抑制素结合蛋白与ZO-1共定位于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。CHO细胞用pcDNA3转染，所述pcDNA3含有p80-或p130-血管生成抑制素结合蛋白的cDNA，并产生稳定的细胞系。A利用抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体通过Western印迹分析CHO细胞系中血管生成抑制素结合蛋白的表达。Wt，野生型细胞，Vec，载体转染的细胞。B.用免疫荧光显微镜分析血管生成抑制素结合蛋白在CHO细胞中的定位。用抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体(绿)和抗ZO-1的抗体染色CHO细胞。显示两幅图重叠(合并)，共定位情况显示作黄色。如通过用毒伞素染色所确定的，P80-血管生成抑制素结合蛋白位于细胞质和紧密连接中，而p130-血管生成抑制素结合蛋白位于F-肌动蛋白纤维(箭头)。ZO-1沿着应力纤维被补充到p130阳性焦点上(箭头尖端)。刻度表示10μm。
图6p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端结构域诱导应力纤维形成。A-C用p80-血管生成抑制素结合蛋白逆转染、并用血管生成抑制素结合蛋白兔多克隆抗体(绿)和得克萨斯红缀合的毒伞素(红)双重染色的MAE细胞，显示p80同工型位于迁移细胞的片状伪足上。D-F同样染色的p130-血管生成抑制素结合蛋白逆转染的MAE细胞产生了不同的亚细胞定位。以不时打断的方式显示P130-血管生成抑制素结合蛋白定位于应力纤维上。G-I用编码p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端结构域的带flag标签的构建体转染的MAE细胞用flag抗体和毒伞素染色。flag抗体染色显示完全与F-肌动蛋白重合。J-L用血管生成抑制素结合蛋白多克隆抗体和毒伞素染色的MAE-载体细胞。Mp130-血管生成抑制素结合蛋白和毒伞素染色的三维图像显示p130-血管生成抑制素结合蛋白和F-肌动蛋白聚集物共定位于应力纤维上。刻度20μm。
图7p130-血管生成抑制素结合蛋白在应力纤维破坏后仍与F-肌动蛋白相连。A-C用血管生成抑制素结合蛋白(绿)和F-肌动蛋白(毒伞素，红)染色的MAE-p130-血管生成抑制素结合蛋白细胞。D-F是用50μg/ml细胞松弛素B处理1小时后用同样方法染色的MAE-p130-血管生成抑制素结合蛋白细胞。p130-血管生成抑制素结合蛋白的聚集结构完全与被破坏的肌动蛋白纤维重叠。G-IMAE细胞，其转染有带flag标签的p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端的，用flag抗体和毒伞素染色。J-L添加50μl/ml细胞松弛素B一小时后用同样方法染色的N末端转染的MAE细胞。N末端的聚集结构完全与被破坏的肌动蛋白纤维重叠。刻度20μm。
图8血管生成抑制素结合细胞表面上的血管生成抑制素结合蛋白。
A稳定表达p80-血管生成抑制素结合蛋白的小鼠主动脉内皮(MAE)细胞与硫代-NHS-LC-生物素一起孵育，并用针对血管生成抑制素结合蛋白的血管生成抑制素结合结构域或桩蛋白(paxillin)的抗体一起进行免疫沉淀(IP)，然后用HRP-缀合的抗生物素蛋白进行印迹。血管生成抑制素结合蛋白被生物素化，而细胞内蛋白质桩蛋白则没有。输入对照泳道代表用于免疫沉淀中的2％的量。B碘化的血管生成抑制素与稳定表达p80-血管生成抑制素结合蛋白的HeLa细胞的结合。结合是可饱和的，半最大浓度为11ng/ml、或0.3nM。
图9血管生成抑制素结合蛋白的拓扑学。Ap80-和p130-血管生成抑制素结合蛋白的结构域结构。3种不同的抗血管生成抑制素结合蛋白的多克隆抗体被用于探查MAE细胞中血管生成抑制素结合蛋白的拓扑学一种针对p130-血管生成抑制素结合蛋白的C末端，一种针对其血管生成抑制素结合结构域，一种针对其N末端。表位在结构域中用水平线显示。这些抗体不与表达空载体的对照细胞反应(未显示)。另外，用myc抗体定位在N末端加标签的p80-血管生成抑制素结合蛋白。B抗血管生成抑制素结合结构域抗体(绿)结合细胞表面上的p80-血管生成抑制素结合蛋白。将抗陷窝蛋白细胞内表位的抗体(红)用作完整细胞膜的对照。相反，抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体(绿)仅在用去污剂首次处理细胞时才展示免疫反应性。C抗血管生成抑制素结合结构域抗体(绿)结合带有完整细胞膜的细胞上的p130-血管生成抑制素结合蛋白。这里，将毒伞素(红)用作完整细胞膜的对照。抗p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端的抗体因不能渗透而不能染色。载体细胞不能用抗体染色。D表达N末端带有myc标签的p80-血管生成抑制素结合蛋白的细胞仅染色被渗透的细胞。刻度表示20μm.E对于p80-和p130-血管生成抑制素结合蛋白拓扑学所建议的模型。
图10p130-血管生成抑制素结合蛋白的血管生成抑制素结合结构域暴露于细胞表面。A-C在不渗透细胞膜的情况下用抗细胞外血管生成抑制素结合结构域的抗体染色的MAE-P130-血管生成抑制素结合蛋白细胞显示对细胞表面上的p130-血管生成抑制素结合蛋白的染色。阳性细胞对于得克萨斯红-缀合的毒伞素染色呈阴性，这显示细胞膜是完整的。D-F用针对细胞内C末端的多克隆抗体和用毒伞素染色未显出对p130-血管生成抑制素结合蛋白或毒伞素有阳性染色结果。刻度20μm。
图11p130-血管生成抑制素结合蛋白与MAGI-1相互作用。A表达p80或p130-血管生成抑制素结合蛋白和带flag标签的MAGI-1B或MAGI-1C构建体的CHO细胞的溶解产物用flag抗体或抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体进行免疫沉淀，然后用flag抗体或抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体进行免疫印迹。通过对总溶解产物进行免疫印迹来确认蛋白质表达。Bp130-血管生成抑制素结合蛋白与MAGI-1B共定位于CHO细胞中。表达p130-血管生成抑制素结合蛋白和MAGI-1B的CHO细胞用flag抗体(红)和抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体(绿)进行免疫染色。显示两幅图重叠(合并)，共定位情况显示作黄色。刻度表示10μm。
图12血管生成抑制素结合蛋白控制渗透和迁移。分析稳定表达p80-或p130-血管生成抑制素结合蛋白的CHO细胞控制细胞层渗透和细胞迁移的能力。A以FITC-右旋糖酐随时间沿细胞层的扩散测量生长于渗透室中的CHO细胞单层的渗透。长斜方形，载体；正方形，p80-血管生成抑制素结合蛋白；十字形，p130-血管生成抑制素结合蛋白。显示了一个有代表性的实验从每个时间点开始的重复三次的平均数和平均数标准差。当汇聚了三次实验的数据时，通过student’s t-测验，对于载体-p80和载体-p130，p＜0.05。B血管生成抑制素不影响表达血管生成抑制素结合蛋白的CHO细胞的细胞渗透。1h后如A所述测量FITC-右旋糖酐的渗透。C血管生成抑制素抑制表达血管生成抑制素结合蛋白的CHO细胞的细胞迁移。在Boyden室中，细胞能自发或向0.05％血清处迁移。显示了每个显微镜视野中迁移细胞平均数的标准偏差和平均数。
图13p130-血管生成抑制素结合蛋白影响细胞形状并介导血管生成抑制素对迁移的抑制.A对MAE-p130-血管生成抑制素结合蛋白、用N末端结构域转染的MAE细胞、MAE-p80-血管生成抑制素结合蛋白细胞和MAE-载体染色，如材料和方法所述的那样评估细胞区域。表达p130-血管生成抑制素结合蛋白或其N末端片段的细胞比p80-血管生成抑制素结合蛋白和载体细胞大两倍以上。三个星号表示p＜0.001。B表达p130-血管生成抑制素结合蛋白、p80-血管生成抑制素结合蛋白和载体的MAE细胞生长至满板，并用吸液管刮擦来产生伤痕。在3和6小时后测量迁移率。P80-血管生成抑制素结合蛋白细胞的迁移几乎是p130-血管生成抑制素结合蛋白细胞和载体细胞的2倍。三个星号表示p＞0.001.CMAE-p130-血管生成抑制素结合蛋白、MAE-p80-血管生成抑制素结合蛋白和MAE-载体细胞在迁移室测试中进行测试。用或不用bFGF以及用或不用血管生成抑制素(5μg/ml)处理细胞。在存在bFGF的情况下刺激载体细胞迁移，但不被血管生成抑制素抑制。bFGF刺激的p80-血管生成抑制素结合蛋白迁移在存在血管生成抑制素的情况下被抑制了175％。bFGF刺激的p130-血管生成抑制素结合蛋白迁移在存在血管生成抑制素的情况下被抑制了160％。D内源表达p80和p130血管生成抑制素结合蛋白的hTERT+-BCE细胞在迁移室测试中分析。用bFGF刺激迁移，而在存在血管生成抑制素的情况下会被抑制85％。
图14细胞滋养层表达p80-血管生成抑制素结合蛋白和p130-血管生成抑制素结合蛋白，并对血管生成抑制素应答。A-F用针对血管生成抑制素结合蛋白C末端的多克隆抗体和检测细胞角蛋白(细胞滋养层的标记物)的单克隆抗体染色人胎盘切片(第二个三个月)，显示细胞角蛋白和血管生成抑制素结合蛋白共定位于浮动的绒毛(FV)、锚定的绒毛(AV)和基板(BP)上。放大倍率＝400x。G血管生成抑制素处理(5μg/ml)极大抑制了细胞滋养层对基质胶(matrigel)的体外侵入(p＜0.001)。数据的统计学显著性通过Student’s t-测验来分析。
图15内源p80-血管生成抑制素结合蛋白在牛毛细管内皮(BCE)细胞中是生物素化的。在BCE细胞中进行类似于图8图例中所述那些实验以确定p80-血管生成抑制素结合蛋白是否有细胞外结构域。
图16p80-血管生成抑制素结合蛋白具有细胞外表位。表达p80-血管生成抑制素结合蛋白的MAE细胞(“p80 Amot”)用胰蛋白酶处理5、10、20、40和80分钟并用Western印迹分析细胞溶解产物。在80分钟内胰蛋白酶降解了大部分p80-血管生成抑制素结合蛋白，而细胞内的肌动蛋白未被降解。
SEQ ID N01-p130-血管生成抑制素结合蛋白的多肽序列。(与p80-血管生成抑制素结合蛋白序列没有相似性的)p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端结构域没有加下划线；与p80-血管生成抑制素结合蛋白有相似性的p130-血管生成抑制素结合蛋白序列加了下划线。
SEQ ID NO2-p130-血管生成抑制素结合蛋白的多核苷酸序列。编码p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端结构域的多核苷酸序列(其与p80-血管生成抑制素结合蛋白序列没有相似性)没有加下划线；与p80-血管生成抑制素结合蛋白有相似性的p130-血管生成抑制素结合蛋白多核苷酸序列加了下划线。
实施例1-实验数据 材料和方法 细胞培养 稳定表达p80-和p130-血管生成抑制素结合蛋白的MAE细胞(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254)生长于Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)(Sigma)。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生长于含F-12 HAM的DMEM。稳定表达p80或p130的CHO细胞通过利用脂质体转染胺2000(Gibco)用带有p80-血管生成抑制素结合蛋白或p130-血管生成抑制素结合蛋白插入片段的pcDNA3转染CHO细胞并用0.4mg/ml的G418筛选克隆来产生。牛毛细管内皮(BCE)细胞培养于添加了2ng/ml bFGF的DMEM。所有细胞培养基都添加了10％胎牛血清(Gibco)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺。
自发无限增殖的小鼠主动脉内皮(MAE)细胞(Bastaki等，1997，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17454-464)和产生嗜亲性反转录病毒的Phoenix eco细胞(由Dr G Nolan，Stanford University，Palo Alto，CA提供)生长于含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)(Sigma)。
稳定转染的MAE细胞在存在5μg/ml嘌呤霉素(载体、p80-血管生成抑制素结合蛋白、和p130-血管生成抑制素结合蛋白)或800μg/ml G418(p130特异性N末端)的情况下生长。293T细胞生长于补充有10％供体牛血清和抗生素的DMEM培养基。M21细胞生长于含5-10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640培养基。BAE细胞生长于含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM。hTERT+-BCE细胞生长于含10％BCS、2ng/ml FGF-2、1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM。
质粒的构建 p80-血管生成抑制素结合蛋白和p130-血管生成抑制素结合蛋白cDNA亚克隆进pENTR-2B载体(Gateway，Invitrogen)中，然后用LR重组反应(Gateway，Invitrogen)重组进转变(convert)Gateway destination载体pcDNA3(Invitrogen)或pBABE(由H Land博士，LCRF，伦敦，英国提供)中。带flag标签的MAGI-1b和MAGI-1c如(Dobrosotskaya等，2000，Biochem.Biophys.Res.Commun.270903-9)所述。N末端构建体是A Shimono博士(发育生物学中心，Kobe，日本)的馈赠物。
抗体 使用三种不同的抗血管生成抑制素结合蛋白多克隆抗体一种抗p130-血管生成抑制素结合蛋白的血管生成抑制素结合结构域(B3抗体)(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)，一种抗其C末端(TLE抗体)(Ernkvist等，2005，已提交)，和一种抗其N末端(Ernkvist等，2005，已提交)(图9A)。使用以下小鼠单克隆抗体9E10抗myc标签(Santa Cruz)，M2抗flag标签(Sigma)，AC-15抗肌动蛋白(Sigma)，1A12抗ZO-1(ZymedLaboratories Inc.)，C060抗陷窝蛋白(Transduction Laboratories)，349抗桩蛋白(Transduction Laboratories)和大鼠单克隆Mec 13.3抗CD31/PECAM(BDPharmingen)。
产生了抗血管生成抑制素结合蛋白不同结构域的兔多克隆抗体。用特异针对p130-血管生成抑制素结合蛋白的266个氨基酸的片段产生N末端抗体。用血管生成抑制素结合结构域产生抗血管生成抑制素结合蛋白细胞外部分的抗体(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)。对应于24个最C末端氨基酸的肽被用于产生C末端抗体。
免疫沉淀 细胞用裂解缓冲液(50mM，Tris-HCl pH7.4，0.2％诺乃洗涤剂(Nonidet)P40，150mM NaCl，1mM EDTA和蛋白酶抑制剂)提取。溶解产物于4℃用免疫前血清或免疫血清免疫沉淀1小时。沉淀用裂解缓冲液洗3次并重悬于1x上样缓冲液中，用SDS-PAGE分析。为了在胶中消化和质谱，5克293T细胞溶于50ml裂解缓冲液。17,000rpm离心20分钟以使上清液澄清。500μl 50％免疫前或免疫抗孪蛋白抗体与琼脂糖CL-4B偶联的浆体用于在4℃免疫沉淀90分钟。沉淀用RIPA缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP40，1％脱氧胆酸，0.1％SDS和蛋白酶抑制剂)洗3次。样品用100mM乙醇胺于室温洗脱2分钟，用Lamelli上样缓冲液变性并在SDS-PAGE上分析。银染后，切下条带并进行质谱。
克隆 p130-血管生成抑制素结合蛋白 p130序列的蛋白酶水解片段的质谱显示来自p80的肽和来自被认为是p80-血管生成抑制素结合蛋白5’“UTR”(图1B中的黑体字)的肽和来自数据库中的两个EST(BI 058583和CK001189.1)的肽。延伸序列符合基因组DNA中的序列，其为p80 cDNA 5’末端上游的7千碱基，这暗示它来自于上游外显子。因为我们不能获得这些EST，因此我们使用了含基因组序列的PAC克隆(AC004827.1)；PCR扩增出上游外显子并将其连接于血管生成抑制素结合蛋白p80 cDNA的5’末端。产生的cDNA含EST BI058583和CK001189.1的公开序列以及p130-血管生成抑制素结合蛋白的完整ORF。
Western印迹 蛋白质在7.5％Criterion SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)上分离，并通过半干印迹转移至Protran硝化纤维素膜上。用5％PBD孵育和用一级抗体于+4℃孵育过夜封闭膜，然后与HRP-驴抗兔或HRP-绵羊抗小鼠(AmershamBiosciences)于室温孵育1小时。用PBS+0.05％土温洗涤过滤膜几次，并用Western Blotting Luminol Reagent(Santa Cruz)使信号可见。
用SDS-PAGE分析细胞溶解产物并将蛋白质转至硝化纤维素膜上。用10％溶于含0.1％土温的PBS(PBS-T)的奶粉封闭非特异结合1小时。过滤膜与针对血管生成抑制素结合蛋白C末端肽的多克隆抗体(1∶500)或针对血管生成抑制素结合蛋白细胞外结构域的多克隆抗体(1∶2000)一起于4℃在溶于PBS-T的5％奶粉中孵育过夜。二级抗体(抗兔-HRP)以1∶10000稀释(Amersham)并于室温孵育1h。然后，用Santa Cruz Biotechnology Inc的检测系统在智能暗箱(Fujifilm)中用LAS1000程序(Fujifilm)使硝化纤维素膜可视化。可从商业渠道购买的含小鼠成体组织、胚胎或胎盘的膜(RNWAYlaboratories)，其如上一样孵育。
生物素化实验 含有约1千万个细胞的满板10cm平板用PBS短暂洗2次，并与溶于PBS的NHS-硫代-LC-生物素(Pierce Inc.)(0.4mg/ml)或溶于DMSO的NHS-LC-生物素(0.4mg/ml)于室温孵育30分钟。然后用PBS洗平板。对照平板只与PBS一起孵育。加入1ml裂解缓冲液(20mM HEPES，140mMKCl，5mM MgCl2，10mM β-磷酸甘油，3％聚乙烯-9-月桂醇醚(Thesit)和蛋白酶抑制剂混合物，pH7.4)，用橡胶淀帚收获细胞。以30000g离心25分钟得到的溶解产物，通过将上清液与1μg B3血管生成抑制素结合蛋白抗体或1μg单克隆抗桩蛋白抗体和30μl蛋白质G琼脂糖浆体(Pierce Inc.)一起孵育进行免疫沉淀。用裂解缓冲液洗珠1次并用含1％Thesit的裂解缓冲液洗3次。用30μl Laemli缓冲液洗脱蛋白质并将一半材料上样于10％预制Criterion凝胶(Bio-Rad)。生物素化的蛋白质通过Western印迹来检测，其中膜与HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白(Pierce Inc.)在含5％脱脂牛奶的PBS中孵育过夜。
血管生成抑制素结合测试 人血管生成抑制素(kringle 1-4)根据厂商(Pierce Inc.)的规程通过Iodogen方法用碘125标记。评估15000cpm/ng蛋白质的比活。为进行结合测试，使稳定表达p80-血管生成抑制素结合蛋白或空载体的HeLa细胞在12孔板中生长至满板。用含1mg/ml BSA的PBS洗细胞。细胞与10ng/ml放射性标记的血管生成抑制素一起孵育2小时。然后用含1mg/ml BSA的PBS洗细胞5次并用含1％Triton X-100的PBS裂解，用γ射线计数仪测量放射性。
胰蛋白酶处理 满板的生长在6厘米皮氏培养皿上的细胞用无钙和镁的PBS洗2次并与1ml 2μg/ml测序级胰蛋白酶(Sigma)或只与PBS于37℃孵育所示的一段时间。通过用PBS洗细胞1次并加入75μl Laemlli缓冲液来终止实验。通过Western印迹来分析样品。
生物信息学分析 穿膜螺旋用PredictProtein(http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html)(Rost等，1996，Protein Sci.51704-1718)和Tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html)进行预测。
免疫荧光 培养的细胞置于小室载玻片中并使之生长和粘附过夜。用4％PFA于室温固定细胞10分钟。需要时，细胞用0.1％triton X-100(Sigma)渗透1分钟。通过与含5％马血清的PBS孵育1h来封闭非特异反应性，然后加入封闭缓冲液中的一级抗体孵育1小时。用荧光标记的二级抗体(Dako and MolecularProbes)检测抗体结合。用得克萨斯红毒伞素(Molecular Probes)使F-肌动蛋白可视化。载玻片用Vector Laboratories的固定介质固定，在Zeiss Axioplan 2显微镜下观察，利用AxioCam HRm照相机和Axiovision 4.2软件收集图像。固定前，要用细胞松弛素B(Sigma)处理的细胞用50μg/ml细胞松弛素B处理1h。然后如上所述，对细胞染色。
胎盘切片的免疫染色利用前述方法(Fisher等，1989，J.Cell Biol.109891-902；Damsky等，1992，J.Clin.Invest.89210-222)，对胎盘切片进行双间接免疫定位。简而言之，用冷的丙酮固定切片5分钟，然后用PBS再洗5分钟。通过在0.2％BSA/PBS中孵育30分钟来封闭非特异反应性，然后加入一级抗体混和物。使用以1∶50稀释的大鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体7D3(Damsky等，1992，J.Clin.Invest.89210-222)。使用以1∶50稀释的兔抗人血管生成抑制素结合蛋白。1h后，细胞用PBS洗并与缀合了若丹明或二氢荧光素的合适的物种特异性第二抗体(JacksonImmunoResearch Lab，Inc)一起孵育。用PBS再洗3次后，将盖玻片装在载玻片上并用Zeiss Axiophot落射荧光显微镜(Thornwood，NY)检查。
培养的细胞的免疫荧光 在小室载片上的细胞板(Falcon)用PBS短暂洗涤，在4％多聚甲醛中固定10分钟并(如果不另外说明)用0.05％Triton x-100处理30秒。然后细胞与5％马血清孵育60分钟，与用5％马血清稀释的一级抗体孵育1小时，用PBS洗4遍并与5％马血清稀释的德克萨斯红马抗小鼠(Vector LaboratoriesInc.)或FITC猪抗兔(DAKO)孵育1小时。用德克萨斯红毒伞素(MolecularProbes)使F-肌动蛋白可视化。标本用带有DAPI的Vectashield固定介质(Vector Laboratories Inc.)固定。用Ziess Axioplan 2显微镜捕获图像，并用Zeiss Axiovision软件和Adobe Photoshop处理。
血管生成抑制素结合蛋白诱导测试 500000个BCE细胞以所示密度铺板，24小时后用PBS洗细胞层2次，轻轻反转到薄纸上，并加入100μl 2xSDS PAGE上样缓冲液来裂解。利用TLE抗体通过Western印迹分析样品。由于PBS残留，样品体积随着平板尺寸增加而增加，因此，将10％体积的溶解产物上样。通过用抗肌动蛋白抗体探测印迹来检验等量上样。
小鼠视网膜的免疫荧光 处死的C57BL6小鼠的眼睛用4％多聚甲醛/PBS于4℃固定2-3小时并用PBS洗。视网膜如前述那样切下(Chan-Ling等，1990，Curr.Eye Res.9459-478)并于室温在渗透/封闭缓冲液PBB中孵育2小时，PBB为PBS，含1％BSA、0.5％Triton X-100和5％正常山羊血清。然后视网膜与用PBB缓冲液稀释的一级抗体于4℃孵育过夜。用PBS于室温洗6次后，视网膜于室温在暗处与用PBS+0.5％BSA、0.25％Triton X-100和5％正常山羊血清稀释的二级抗体孵育2小时。二级抗体是FITC-缀合的猪抗兔(Dako)Alexa Fluor 594-山羊抗小鼠(Molecular Probes)和RPE-山羊抗大鼠IgG小鼠(Southern Biotechnology Associates)。视网膜平置于Vectashield装置(Vectorlabs)上。
用MAGI-1进行免疫沉淀 用脂质体转染胺2000试剂(Life Technologies)转染2μg每种质粒DNA之前，2百万个CHO细胞在6cm皮氏培养皿中铺板一天。转染后48小时将细胞收集在裂解缓冲液中150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH7.4、0.5％Triton X-100和蛋白酶抑制剂。细胞溶解产物于4℃颠倒往复旋转15分钟，并于4℃以13000rpm离心5分钟。收集上清液并用于通过Bradford法确定总蛋白质。代表1.5mg总蛋白质的溶解产物预先用20μl蛋白质A珠澄清，然后在旋转条件下于4℃用5μg抗血管生成抑制素结合蛋白或抗FLAG抗体孵育每种免疫前血清样品6小时。然后，向每个免疫前血清样品加入30μl蛋白质A珠并于4℃旋转过夜。孵育后，用裂解缓冲液洗珠2次，重悬于Lammeli上样缓冲液中，煮沸并用7.5％Criterion预制凝胶(Bio-Rad)分辨。对于免疫荧光染色，40000个CHO细胞在小室载玻片中铺板，并用脂质体转染胺2000试剂转染0.35μg的每种质粒。
聚集测试 用不含钙和镁的PBS洗两次并与0.02％EDTA(Sigma)孵育至解离来解离CHO细胞，重悬于不含钙和镁的Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Sigma)，用HBSS洗1次并以100000个细胞/ml重悬于添加了2％FBS、且用不含钙和镁的PBS透析的HBSS中。在事先用1％BSA包被的24孔板中每孔加入50000个细胞。此时，绝大多数细胞是单个细胞。如所示加入CaCl2(2mM)和血管生成抑制素(5μg/ml)。让细胞于37℃聚集60分钟，其间在平台旋转器上以80rpm旋转。加入戊二醛至5％的终浓度来终止实验。以10x放大倍率为每个孔拍摄至少5个区域用于分析细胞聚集。计数细胞总数(N0)并计数60分钟时细胞的聚集数(N60)。聚集指数如(Hirata等，2001，J.Biol.Chem.27616223-16231)所述，算作(N0-N60)/N0。每种情况评估约500个细胞。
渗透测试 根据厂商说明来使用Chemicon Inc.的体外血管渗透测试试剂盒，其基于FITC-标记的右旋糖酐扩散穿过生长于24孔型的膜上的细胞层。简而言之，CHO细胞以每个膜插入物10000个细胞来接种并使之以5天形成单层。每种情况重复使用三个或四个插入物。如所示，向孔中加入血管生成抑制素(2μg/ml)，一小时后开始实验。向上室加入FITC-右旋糖酐并在5、15、60和120分钟时从下室取出100μl样品。在Bio-Tek FL 600平板读数仪上用激发波长485nm和发射波长530nm来测量荧光。扣去细胞培养基的背景荧光。平行测量在无细胞情况下FITC-右旋糖酐扩散穿过膜插入物以确证细胞单层的完整性。
定量细胞面积 用C末端血管生成抑制素结合蛋白多克隆抗体对细胞染色，检测阳性细胞，然后用毒伞素染色使整个细胞可视化。用连在Zeiss Axioplan 2显微镜上的AxioCam HRm照相机拍照。用4.0.版Fujifilm image gauge来测量细胞面积。并用Statview 5.0.1绘框图(box plot)和进行统计计算。
伤口体外愈合 细胞于小室载玻片中铺板并生长过夜。用200μl吸液管造伤。30分钟(时间点0)、3.5小时(时间点3小时)和6.5小时(时间点6小时)后拍摄伤口照片。测量伤口边缘细胞之间的距离。时间点3小时和6小时与时间点0作比较，以显示伤口闭合率。用Statview 5.0.1进行统计计算。
迁移测试 如(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254)所述进行Boyden室迁移测试。简而言之，无血清培养基中的30000个细胞上样于每个孔中并使之向0.05％血清迁移4小时。去除未迁移的细胞并固定残留的细胞并用Giemsa染料染色。用显微镜对每个孔的3个视野计数。
如早先所述的(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254)，利用48孔化学向性室(Neuroprobe Inc)在改良的Boyden室中进行迁移测试。简而言之，8微米Nucleopore无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯过滤膜用100μg/ml1型胶原蛋白(Cohension，Palo Alta，USA)包被过夜。hTERT+-BCE细胞在0.2％FCS-DME培养基中饥饿16小时。为了测试血管生成抑制素的抑制活性，hTERT+-BCE、和载体以及血管生成抑制素结合蛋白MAE细胞预先与5μg/ml血管生成抑制素孵育1小时。细胞用胰蛋白酶消化，重悬于含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的DMEM中并向上室的每个孔中加入带有或不带有血管生成抑制素的30,000个细胞。将20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Peprotech EC Ltd.)用作下室中的化学引诱物。化学向性室于37℃在10％CO2下孵育3-5小时，使细胞迁移通过胶原蛋白包被的聚碳酸酯过滤膜。去除滤膜上表面上的未迁移的细胞并用Giemsa染料(VWRInternational Ltd)对滤膜染色。每个视野中迁移细胞的总数以20x放大倍率计数；在三个独立实验中对每个样品重复测试4次。
胎盘组织的收集 所有患者均知情同意，从其收集组织。在1小时的过程收集终止怀孕(6至22周)的胎盘组织，反复用含抗生素的PBS洗涤，并置于冰上。
分离细胞滋养层 通过公开方法(Fisher等，1989，J.Cell Biol.109891-902；Kliman等，1986，Endocrinology，1181567-1582)，从集中的第一个或第二个三月期的胎盘中分离细胞。简而言之，胎盘进行一系列酶消化，其使细胞滋养层先祖细胞与绒毛膜绒毛的基核分开。一旦分开，用Percoll梯度纯化细胞并在无血清培养基中培养于基质胶包被的底物(协同生物医药产物)上15小时，所述无血清培养基DMEM，4.5g/L葡萄糖(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)，并含有2％Nutridoma(Boehringer Mannheim Biochemicals)，1％青霉素/链霉素，1％丙酮酸钠，1％Hepes和1％庆大霉素(UCSF CellCulture Facility)。
侵入测试 如前述(Damsky等，1992，J.Clin.Invest.89210-222；Librach等，1991，J.Cell Biol.113437-449)进行侵入测试。简而言之，分离的细胞滋养层(0.25×106)在带有用基质胶包被的聚碳酸酯滤膜(孔大小为8μm)的Transwell插入物(6.5mm，Costar)上铺板。实验性培养物含血管生成抑制素，以5μg/ml加入到培养基中。48小时后，用特异与人细胞角蛋白反应的7D3抗体染色培养物，从而能使细胞滋养层可视化。从支持物上切下滤膜并装在载片上，其上表面朝下装。计数滤膜下表面上的细胞角蛋白阳性细胞数和细胞突起。每个实验条件重复测试3次并进行完整的测试3次。数据表示成细胞滋养层总数和细胞滋养层突起。用Stufent’s t测验分析数据的统计显著性。
结果 血管生成抑制素结合蛋白新剪接同工型的鉴定 在为了其它目的而设计的免疫沉淀实验过程中，我们在293T细胞中鉴定出了血管生成抑制素结合蛋白的新同工型。对293T细胞进行免疫沉淀分析并通过SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS PAGE)分离免疫沉淀并通过银染检测。切下对应于80和130kDa的两条条带并用胶内蛋白酶水解和质谱来鉴定。对两个蛋白质的胰蛋白酶消化产物测序，鉴定出80kDa条带和作为p80-血管生成抑制素结合蛋白同工型的130kDa蛋白质条带。用血管生成抑制素结合蛋白特异性抗体进行Western印迹分析，确证了在293T细胞中有两种血管生成抑制素结合蛋白的同工型(图1A)。
在p130-血管生成抑制素结合蛋白中，氨基酸1-409位形成p130-血管生成抑制素结合蛋白特有的N末端部分，而氨基酸410-1084位对应于p80-血管生成抑制素结合蛋白，并构成了p130-血管生成抑制素结合蛋白的C末端(图1B)。P130-血管生成抑制素结合蛋白通过外显子2和3间的交互剪接方式来产生，其形成了这种带有N末端延伸的同工型(图1C)。然后我们产生了特异针对p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端结构域的多克隆抗体。通过Western印迹分析，该抗体特异识别p130而不识别p80同工型(图1D)。
血管生成抑制素结合蛋白的表达 P130-血管生成抑制素结合蛋白在胎盘中表达，但在怀孕期间在胚胎本身中不表达。
血管生成抑制素结合蛋白在胚胎发生期间起着重要的作用，因为血管生成抑制素结合蛋白敲除的小鼠显示出在原肠胚形成期间有异常的内脏内胚层的细胞迁移，造成了70％小鼠胚胎死亡(Shimono和Behringer，2003，Current Biol.13613-7)。因此我们分析了在小鼠胚胎发生期间血管生成抑制素结合蛋白同工型的时间表达模式。小鼠胚胎在胚胎期(E)第5至19天的Western印迹显示，在胎儿发育期间，从E6开始表达p80-血管生成抑制素结合蛋白，并增加了蛋白质水平。没有检测到p130-血管生成抑制素结合蛋白的表达(图2A)。E15的胚胎溶解产物的过度曝光显示p130-血管生成抑制素结合蛋白弱表达(数据未显示)。因此，我们推断，p80-血管生成抑制素结合蛋白在胚胎发生期是占优势的表达形式。然后我们用Western印迹法分析了在外胚胎组织中血管生成抑制素结合蛋白的表达，其中使用了来自怀孕不同阶段的胎盘样品。除了从E11至怀孕终止都在表达的p80-血管生成抑制素结合蛋白，p130-血管生成抑制素结合蛋白表达仅仅在E13至E16的胎盘中被检测到(图2B)。分析血管生成抑制素结合蛋白在成体小鼠组织中的蛋白水平，显示p130-血管生成抑制素结合蛋白表达仅限于胸腺和睾丸，而p80-血管生成抑制素结合蛋白则更丰富地在不同成体组织中表达(图2C)。
为了确定p130-血管生成抑制素结合蛋白和p80-血管生成抑制素结合蛋白在细胞水平上的表达，我们检测了来自293T细胞、细胞滋养层、hTERT+-BCE细胞和牛主动脉内皮(BAE)细胞的细胞溶解产物。如图2D所示，所有测试的细胞类型都产生了血管生成抑制素结合蛋白的这两种同工型。
血管生成抑制素结合蛋白的定位 血管生成抑制素结合蛋白定位于原代内皮细胞的紧密连接处并通过细胞密度控制 为了检验原代细胞中的细胞外染色模式。我们用以相似量表达p80-和p130-血管生成抑制素结合蛋白(Ernkvist等，2005，已提交)的BCE细胞进行了相同的实验。在不使用膜渗透的情况下，抗血管生成抑制素结合结构域的抗体能染色10％细胞，其模式与MAE细胞相似。用作阴性对照的抗GST的对照抗体不染色(数据未显示)。我们随后研究了血管生成抑制素结合蛋白在满板的原代细胞中的定位情况。令人惊讶地，抗血管生成抑制素结合结构域的抗体在缺少去污剂的情况下无法显示出对满板的细胞有可检测到的染色，这暗示当细胞满板时血管生成抑制素结合结构域被覆盖了(图3A)。可是，抗血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体在细胞-细胞接触面上展示出强免疫反应性。定位情况与ZO-1(紧密连接(TJ)的标记)重叠。也能在似乎是细胞内聚集物的地方检测到血管生成抑制素结合蛋白，偶尔也呈ZO-1阳性。这与以下观察结果在一起，即当使用抗血管生成抑制素结合结构域的抗体时，仅有10％的亚满板细胞显示出表面免疫反应性，而且完全满板的细胞没有展示出免疫反应性，这暗示血管生成抑制素结合蛋白被补充在细胞表面上，在这些细胞的细胞-细胞接触面上。用血管生成抑制素(5lμg/ml)处理满板的细胞不改变血管生成抑制素结合蛋白的定位情况(数据未显示)。
当BCE细胞更满板时，荧光染色显示得更强。为了研究这一现象，我们以不同密度铺板BCE细胞，并通过Western印迹分析血管生成抑制素结合蛋白表达。血管生成抑制素结合蛋白的p80-和p130-同工型的表达在25000个细胞/cm2时被强烈地诱导了，这时候细胞能与其它细胞相互形成接触面(图3C)。我们推断，血管生成抑制素结合蛋白的表达由细胞-细胞接触面的形成来调节。
血管生成抑制素结合蛋白体内定位于内皮细胞中的细胞-细胞接触面 我们随后在体内分析血管生成抑制素结合蛋白在内皮细胞中的位置。在小鼠视网膜中，出生后(P)第1至14天发生血管生成，血管从视神经中的血管中向视网膜外周萌发，然后进入较深层。我们对出生后P5天小鼠进行视网膜血管的整标本染色，并通过免疫荧光分析血管生成抑制素结合蛋白的表达。血管生成抑制素结合蛋白与内皮细胞的标记——CD31/PECAM一起表达于内皮细胞中(图4A)。这表明，血管生成抑制素结合蛋白的表达是视网膜中内皮细胞特异性的。血管生成抑制素结合蛋白染色与ZO-1信号的重叠表明血管生成抑制素结合蛋白体内定位于内皮细胞中的细胞-细胞接触面上(图4B和C)。
血管生成抑制素结合蛋白定位于CHO细胞中的紧密连接处并能使ZO-1补充 我们使用常用作细胞-细胞接触面的模型系统的CHO细胞，从而研究紧密连接中的血管生成抑制素结合蛋白的功能。我们制造出表达p80-血管生成抑制素结合蛋白、p130-血管生成抑制素结合蛋白或空载体的稳定CHO细胞系。转染导致Western印迹分析中出现预期分子量的条带(图5A)。可是，在p130-血管生成抑制素结合蛋白转染的细胞中，在120kDa和80kDa显示出额外的条带，表明如先前报道的(Ernkvist等，2005，已提交)，在p130 mRNA中额外的读框内ATG可用作转译起始位点。CHO p130克隆表达蛋白质的量有点低于p80克隆。野生型细胞和用空载体转染的细胞仅表达无法检测到的蛋白量。
我们通过免疫荧光分析了血管生成抑制素结合蛋白在CHO细胞中的定位情况。P130-血管生成抑制素结合蛋白定位于细胞-细胞上，而p80定位于细胞质以及紧密连接上。在细胞-细胞接触面中，血管生成抑制素结合蛋白染色与ZO-1重叠(图5B)，表明血管生成抑制素结合蛋白与ZO-1共定位。偶尔，如从前报道的(17)，p130定位于沿着能用毒伞素来染色的F-肌动蛋白应力纤维的焦点上。ZO-1能以对照细胞中不可见的方式被补充到这些焦点上(图5B)，这表明血管生成抑制素结合蛋白能控制ZO-1定位。
p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端结构域定位于肌动蛋白并稳定应力纤维。
如我们以前所报道的，p80-血管生成抑制素结合蛋白定位于片状伪足(图6A-C)(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254)。为了比较p130-血管生成抑制素结合蛋白和p80-血管生成抑制素结合蛋白的亚细胞定位情况，用编码各同工型的构建体逆转染小鼠主动脉内皮细胞(MAE)。多克隆阳性细胞用嘌呤霉素选择并通过Western印迹分析检测表达(图2D)。用p130-血管生成抑制素结合蛋白逆转染的细胞显示出130kDa条带和80kDa处的微弱条带，这表明p130-血管生成抑制素结合蛋白开放阅读框(ORF)可产生这两种同工型。用这些蛋白质逆转染的MAE细胞用C末端特异性抗体染色，并且p130-血管生成抑制素结合蛋白阳性细胞的染色显示出非常有规律的小线性点的形式(图6D)。这种染色形式不限于MAE细胞，因为M21黑素瘤和293T细胞当转染p130-血管生成抑制素结合蛋白时也显示相似的结构(数据未显示)。p130-血管生成抑制素结合蛋白的丝状表达模式暗示p130-血管生成抑制素结合蛋白可能定位于F-肌动蛋白。为了评估潜在的肌动蛋白连接，表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的MAE细胞用得克萨斯红缀合的毒伞素对F-肌动蛋白以及p130-血管生成抑制素结合蛋白染色。截短的p130-血管生成抑制素结合蛋白染色表明在大多数位置上能直接与F-肌动蛋白重合(图6D-F)。染色的有趣观察结果是，载体细胞(图6J-L)和p80-血管生成抑制素结合蛋白细胞不具有与p130-血管生成抑制素结合蛋白相同的肌动蛋白纤维模式。P130-血管生成抑制素结合蛋白诱导应力纤维，而表达载体和p80-血管生成抑制素结合蛋白的细胞只有较少肌动蛋白纤维。这表明，p130-血管生成抑制素结合蛋白能稳定应力纤维。
为了进一步分析p130-血管生成抑制素结合蛋白和F-肌动蛋白的共定位情况，我们使用了计算机化的去卷积以及3D成像软件来确定p130-血管生成抑制素结合蛋白和F-肌动蛋白的重叠。图3M显示血管生成抑制素结合蛋白和肌动蛋白共定位于一个单个应力纤维中。
接下来，我们研究了p130-血管生成抑制素结合蛋白特异性N末端部分是否介导与肌动蛋白的连接。为此，MAE细胞瞬时转染该p130-血管生成抑制素结合蛋白特异性N末端结构域。N末端片段的免疫荧光染色显示出能与应力纤维完美的共定位，但缺少全长p130-血管生成抑制素结合蛋白特有的不时打断的模式(图6G-I)。相似的染色模式也在用N末端结构域转染的HeLa和M21细胞中被观察到(数据未显示)。这些结果显示p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端409个氨基酸与应力纤维相连。
与用p130-血管生成抑制素结合蛋白转染的细胞相似，用N末端转染的细胞比载体和p80-血管生成抑制素结合蛋白细胞有更多的应力纤维，这表明p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端能诱导更多的应力纤维样模式。
为了研究p130-血管生成抑制素结合蛋白是否与F-肌动蛋白相连，我们用肌动蛋白解聚剂——细胞松弛素B处理细胞。如图7D所示，p130-血管生成抑制素结合蛋白的不时打断的染色模式在用细胞松弛素B处理的细胞中被破坏。被破坏的p130-血管生成抑制素结合蛋白染色完全与肌动蛋白聚集结构的毒伞素染色相重合(图7D-F)。接着，我们将p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端结构域转染进MAE细胞(图7G-I)并用细胞松弛素B处理这些细胞。再一次，N末端染色完全与肌动蛋白聚集结构相重合(图7J-L)。为了确保染色不是由于细胞崩溃造成的，我们还对微管蛋白和细胞色素C进行染色。微管蛋白和细胞色素C的染色都不受细胞松弛素B处理影响(数据未显示)。我们还用细胞松弛素B处理转染了p80-血管生成抑制素结合蛋白的MAE细胞。p80-血管生成抑制素结合蛋白的片状伪足染色被破坏，但不影响所有p80-血管生成抑制素结合蛋白阳性细胞的细胞内染色情况(数据未显示)。
血管生成抑制素结合蛋白的拓扑学 血管生成抑制素结合细胞表面上的血管生成抑制素结合蛋白 我们先前报道，用p80-血管生成抑制素结合蛋白转染的小鼠主动脉内皮细胞(MAE细胞)将通过阻断迁移和管的体外形成来应答血管生成抑制素。这暗示p80-血管生成抑制素结合蛋白是血管生成抑制素的受体。可是，如序列分析所判定的，血管生成抑制素结合蛋白不具有明显的能介导蛋白质插入膜中的信号肽。为了研究p80-血管生成抑制素结合蛋白是否有细胞外结构域，我们将MAE细胞与硫代-NHS-LC-生物素(带有能缀合生物素与蛋白质的反应基团的生物素衍生物)一起孵育。硫代-NHS-LC-生物素是水溶性的并不会穿透完整的细胞膜。用硫代-NHS-LC-生物素孵育后，我们对细胞溶解物进行针对血管生成抑制素结合蛋白、或作为阴性对照针对细胞内蛋白质桩蛋白的免疫沉淀。用HRP-缀合的抗生物素蛋白进行Western印迹来分析免疫沉淀。如图8A所见，p80-血管生成抑制素结合蛋白是生物素化的，而桩蛋白不是。可是，桩蛋白能用疏水、膜渗透的类似物——NHS-LC-生物素进行生物素化(数据未显示)。用牛毛细管内皮(BCE)细胞进行相似的实验(图15)时，内源p80-血管生成抑制素结合蛋白也可以在原代细胞中生物素化。这是令人感兴趣的，因为血管生成抑制素最初通过其抑制这些细胞增殖的能力而被鉴定出来(O’Reilly等，1994，Cell，79315-328)。为了验证血管生成抑制素结合蛋白具有细胞外表位，我们用胰蛋白酶处理MAE细胞几次并通过Western印迹分析细胞溶解产物。胰蛋白酶在80分钟内降解了大部分p80-血管生成抑制素结合蛋白，而不降解细胞内的肌动蛋白(图16)。
以前我们表明，转染了血管生成抑制素结合蛋白的HeLa细胞能结合并内在化FITC-标记的血管生成抑制素(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)。为了验证血管生成抑制素与表达血管生成抑制素结合蛋白的细胞结合，稳定表达血管生成抑制素结合蛋白的HeLa细胞与碘化的血管生成抑制素以不同浓度孵育，并测量闪烁值(图8B)。血管生成抑制素以可饱和的方式结合这些细胞，半最大浓度11ng/ml、或0.3nM，其被认为近似于Kd。血管生成抑制素不以任何大的程度结合对照细胞。100倍浓度的冷的血管生成抑制素能竞争结合标记的血管生成抑制素。可是，以完全阻断标记的血管生成抑制素的结合的量加入血管生成抑制素是不可行的，因为这需要1000倍浓度。结果，我们的数据表明血管生成抑制素结合蛋白位于细胞表面上，在那儿它结合血管生成抑制素。
血管生成抑制素结合蛋白的拓扑学 接着，我们研究血管生成抑制素结合蛋白的拓扑学。通过序列分析，p80-血管生成抑制素结合蛋白含3种不同的结构域.N末端的一半预计形成卷曲-卷曲(coiled-coil)(Bratt等，2002，Gene，29869-77)，而C末端具有推测的PDZ结合结构域，其对控制细胞运动力起重要作用(Levchenko等，2003，J.CELL Sci.1163803-3810)。酵母双杂交筛选中鉴定到的血管生成抑制素结合结构域是135个残基的部分疏水的结构域(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)，其位于多肽的中心区域(图9A)。p130-血管生成抑制素结合蛋白含延伸的N末端结构域，其带有保守的富含谷氨酰胺的基序。生物信息学分析暗示，血管生成抑制素结合蛋白在血管生成抑制素结合区疏水部分中含多至3个推测的穿膜螺旋(数据未显示)。我们推测血管生成抑制素结合结构域是在细胞外的，而且N末端卷曲-卷曲以及PDZ结合结构域是在细胞内的。
一般而言，细胞膜必须是抗体可渗透的才能在免疫荧光研究中对细胞内表位染色。为了研究血管生成抑制素结合蛋白的穿膜拓扑学，在预先进行或不进行去污剂Triton X-100处理的情况下，用针对血管生成抑制素结合蛋白不同结构域的抗体免疫荧光染色亚满板的细胞。我们使用了3种不同的多克隆兔抗体一种针对血管生成抑制素结合结构域(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)，一种针对最C末端的24个残基，和一个针对p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端(图9A)。在不先提取膜的情况下，针对血管生成抑制素结合结构域的抗体能进行染色，这暗示该结构域具有细胞外表位(图9B)。作为完整细胞膜的对照，我们对细胞内陷窝蛋白N末端结构域进行染色，其仅仅染色用Triton X-100处理过的细胞。相反，针对血管生成抑制素结合蛋白C末端的抗体为了染色需要渗透(图9B)。当使用Triton X-100时，该抗体以与抗血管生成抑制素结合结构域抗体相似的染色模式对细胞染色。这表明C末端是在细胞内的，然而不能正式排除该表位是在细胞外的、并在用去污剂去除结合c末端的覆盖蛋白质之后变得可为抗体所用。可是，该表位含PDZ结合结构域和该结构域据目前所知总是在细胞内的事实，支持前一结论。通过相同的方法，抗p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端的抗体也仅在首次渗透细胞时才展示免疫反应性，这表明该结构域是在细胞内的(图9C)。最后，为了以相同方式分析p80血管生成抑制素结合蛋白N末端，我们用N末端上带有myc标签的血管生成抑制素结合蛋白的构建体转染MAE细胞。我们用绿色荧光蛋白质(GFP)质粒作为转染标记来共转染。对N末端myc标签的染色需要渗透(图9E)，这表明血管生成抑制素结合蛋白N末端是在细胞内的。结果，这些数据表明血管生成抑制素结合蛋白N末端和C末端是细胞内的，在血管生成抑制素结合结构域侧翼的疏水区能形成两个穿膜螺旋，使血管生成抑制素中心部分在细胞外空间中结合。
p130-血管生成抑制素结合蛋白的血管生成抑制素结合基序暴露在细胞表面 如上和在前研究(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254；Bratt等，2005，已提交)所示，p80-血管生成抑制素结合蛋白含有细胞外血管生成抑制素结合结构域。因此，我们分析血管生成抑制素结合基序在表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的细胞中是否暴露于细胞表面。表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的非渗透的MAE细胞用针对细胞外血管生成抑制素结合结构域的多克隆抗体染色。细胞也与毒伞素一起孵育以验证细胞外膜是完整的。p130-血管生成抑制素结合蛋白的同样的不时打断的模式能在毒伞素染色阴性的非渗透细胞中被观察到(图10A-C)。在用针对血管生成抑制素结合蛋白细胞内C末端结构域的多克隆抗体染色的细胞中没有检测到p130-血管生成抑制素结合蛋白的染色(图10D-F)。这些结果表明，p130-血管生成抑制素结合蛋白像p80-血管生成抑制素结合蛋白那样也包含细胞外血管生成抑制素结合结构域。
血管生成抑制素结合蛋白的功能 血管生成抑制素结合蛋白与MAGI-1相互作用 血管生成抑制素结合蛋白与ZO-1的共定位提示我们尝试免疫共沉淀血管生成抑制素结合蛋白和ZO-1。可是，没有能发现这样的相互作用。也没有能确定闭合蛋白(occludin)和血管生成抑制素结合蛋白间的相互作用。然后，我们将注意力转向MAGI-1——与ZO-1相关的膜相关鸟嘌呤核苷激酶(MAGUK)，据报道其结合内皮细胞中内皮细胞选择性粘附分子(ESAM)的细胞质结构域(Wegmann等，2004，Exp.Cell Res.300121-133)。在瞬时表达p80或p130血管生成抑制素结合蛋白和带flag标签的MAGI-1同工型MAGI-1b和MAGI-1c的CHO细胞中，MAGI-1b、而不是MAGI-1c能与p130-血管生成抑制素结合蛋白免疫沉淀，但不与p80-血管生成抑制素结合蛋白沉淀。而且，p130-血管生成抑制素结合蛋白、而不是p80-血管生成抑制素结合蛋白也能用flag抗体免疫沉淀(图11A)。免疫荧光研究揭示了在CHO细胞中表达时，p130和MAGI-1b共定位(图11B)。因而，p130-血管生成抑制素结合蛋白的N末端结构域能与MAGI-1b或与同MAGI-1b相互作用的蛋白质相连。
血管生成抑制素结合蛋白控制细胞迁移和渗透 为了分析细胞-细胞接触面中的血管生成抑制素结合蛋白功能，我们进行细胞聚集测试。这些表明，血管生成抑制素结合蛋白在短期聚集测试中在缺失或存在钙的情况下不介导细胞聚集，而且血管生成抑制素不对转染了血管生成抑制素结合蛋白的细胞聚集产生影响(数据未显示)。我们随后研究血管生成抑制素结合蛋白在控制紧密连接渗透中的作用。为此，我们使用体外渗透测试，其中测量FITC-标记的右旋糖酐扩散穿过生长于渗透膜上的细胞层。荧光以时间依赖性方式增长，但在表达血管生成抑制素结合蛋白的细胞中显著慢于对照细胞。1小时后，表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的细胞展示出比对照细胞的渗透低88％，而p80-血管生成抑制素结合蛋白细胞展示出渗透低70％(图12A)。这显示，血管生成抑制素结合蛋白不仅定位于紧密连接，而且其本身能影响紧密连接功能。可是，血管生成抑制素不能影响p80-或p130-血管生成抑制素结合蛋白细胞中的渗透(图12B)。在Boyden室测试中，稳定表达p80-血管生成抑制素结合蛋白的MAE细胞通过减少迁移来应答血管生成抑制素，而MAE对照细胞不应答(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-54)。为了研究CHO细胞是否以相似的方式反应，我们用表达p80-或p130-血管生成抑制素结合蛋白的CHO细胞进行Boyden室实验。这些结果如图12C所示。表达p80-或p130-血管生成抑制素结合蛋白的CHO细胞应答血管生成抑制素，其运动性减少50％。因而，血管生成抑制素的效应局限于抑制细胞迁移，而血管生成抑制素不影响血管生成抑制素结合蛋白介导的对紧密连接的控制。
P130-血管生成抑制素结合蛋白影响细胞形态 与表达载体和p80-血管生成抑制素结合蛋白的细胞相比，p130-血管生成抑制素结合蛋白逆转染的MAE细胞含更多应力纤维并展现出扁平的形态。针对血管生成抑制素结合蛋白表达对细胞进行染色，并用毒伞素，以使细胞轮廓可见。对血管生成抑制素结合蛋白染色阳性的细胞被拍照，并如材料和方法中所述的测量细胞面积。如图13A中框图所示，表达p130-血管生成抑制素结合蛋白或N末端结构域的MAE细胞的中值面积比p80-血管生成抑制素结合蛋白或载体细胞大2倍以上。这些结果显示，p130-血管生成抑制素结合蛋白调节细胞骨架组织和细胞形态，而且蛋白质的N末端部分介导这些效应。
P130-血管生成抑制素结合蛋白被血管生成抑制素抑制 我们以前的研究显示，血管生成抑制素结合蛋白促进转染的细胞迁移。因此，我们使用体外伤口愈合测试来研究p130-血管生成抑制素结合蛋白表达对MAE细胞迁移率的影响。在该测试中，用p80-血管生成抑制素结合蛋白、p130-血管生成抑制素结合蛋白或载体转染的MAE细胞生长至满板，然后通过用吸液管刮擦来造伤。通过分析从伤口边缘到迁移细胞的最前端边缘的距离来评估迁移率。伤口愈合的结果证明了，p80-血管生成抑制素结合蛋白的表达刺激向伤口迁移几乎2倍，而载体细胞和p130-血管生成抑制素结合蛋白细胞具有相似的迁移率(图13B)。接着，我们分析了表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的MAE细胞是否应答血管生成抑制素。首先，我们检验了血管生成抑制素是否能影响p130-血管生成抑制素结合蛋白阳性细胞的细胞形态。细胞与5μg/ml血管生成抑制素孵育过夜，第二天固定并进行分析。结果显示，血管生成抑制素的处理不显著影响p130-血管生成抑制素结合蛋白细胞的细胞面积(数据未显示)。
我们以前显示，在Boyden室测试中，表达p80-血管生成抑制素结合蛋白的MAE细胞的迁移被血管生成抑制素抑制了(Troyanovsky等，2001，J.Cell.Biol.1521247-1254)。因此我们比较了p130-血管生成抑制素结合蛋白、p80-血管生成抑制素结合蛋白、和载体细胞在存在或缺失血管生成抑制素的情况下的迁移。转染了载体的细胞的迁移在存在bFGF的情况下被刺激，但在存在血管生成抑制素的情况下不被抑制。在存在血管生成抑制素的情况下，bFGF刺激的p130-血管生成抑制素结合蛋白和p80-血管生成抑制素结合蛋白的迁移分别被抑制百分之160和175，其低于在缺失bFGF的情况下的迁移水平(图13C)。
因为hTERT+-BCE细胞内源表达p80-血管生成抑制素结合蛋白和p130-血管生成抑制素结合蛋白，所以我们在迁移室测试中测试它们。hTERT+-BCE细胞的迁移在bFGF存在的条件下被刺激了，并在用血管生成抑制素处理时被抑制了85％(图13D)。我的结果与以前的报道一致，表明血管生成抑制素抑制内皮细胞迁移(Claesson-Welsh等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955579-5583)。
血管生成抑制素抑制细胞滋养层侵入 细胞滋养层是人胎盘的专门化的内皮细胞，其分化以获得肿瘤样性质，其能使它们侵入子宫，在那儿它们产生内皮样特征(在Red-Horse等，2004，J.Clin.Invest.114744-754中有综述)。它们表达PECAM、VE-钙粘蛋白、VCAM-1、αv和αvβ3整合素也表明了这个事实。以前我们仅仅在内皮细胞中检测血管生成抑制素结合蛋白的表达。可是，由于人细胞滋养层也表达p130-血管生成抑制素结合蛋白和p80-血管生成抑制素结合蛋白同工型(图2D)，因此我们对胎盘切片染色。如图14所示，染色显示，细胞角蛋白和血管生成抑制素结合蛋白共定位于浮动的绒毛、锚定的绒毛和基板中，这表明p80-血管生成抑制素结合蛋白和p130-血管生成抑制素结合蛋白在所有细胞滋养层群体(如先祖、侵入的细胞)中表达，并不在分化的合胞滋养层中表达(图14A-F)。
接着，我们测试了细胞滋养层(其表达大量内源p130-血管生成抑制素结合蛋白和p80-血管生成抑制素结合蛋白)的侵入是否受血管生成抑制素处理影响。侵入测试在存在或缺失血管生成抑制素的情况下进行。48小时后，侵入的细胞用细胞角蛋白单克隆抗体染色，并如材料和方法所述对实验评分。结果显示，在加入血管生成抑制素的实验中，细胞滋养层侵入与对照相比下调了几乎3倍(图14G)。
讨论 我们鉴定出了血管生成抑制素结合蛋白的新剪接同工型，其调节细胞形态并介导血管生成抑制素抑制内皮细胞迁移。p130-血管生成抑制素结合蛋白包含延伸的氨基末端结构域，但其它部分与其较短的80kDa同工型一样。N末端结构域最先的243个氨基酸显示出与Amotl-1和Amotl-2有58％同源性。在这些243个氨基酸中有5个由在3个蛋白质之间100％保守的约8-10个氨基酸组成的、富含谷氨酰胺的保守区岛。关于Amotl-2的细胞位置和功能知道得很少，但显示Amotl-1(JEAP)特异表达于外分泌细胞中并体外和体内定位于紧密连接处中的ZO-1处(Nishimura等，2002，J.Biol.Chem.2775583-7)。p130-血管生成抑制素结合蛋白的亚细胞位置不同于MAE细胞中的p80-血管生成抑制素结合蛋白。与用p80-血管生成抑制素结合蛋白观察到的片状伪足染色情况相反，p130-血管生成抑制素结合蛋白以有规律的不时打断的模式表达，与F-肌动蛋白重叠。该染色模式不与纤维状粘附(fibrillar adhesion)中发现的张力蛋白(Zamir等，1999，J.CELL Sci.1121655-1669)或α-辅肌动蛋白(肌动蛋白结合蛋白质)(Belkin和Koteliansky，1987，FEBS Letts，220291-4；Otey等，1990，J.Cell Biol.111721-9)的模式重叠(数据未显示)。
与表达p80-血管生成抑制素结合蛋白的细胞相比，表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的细胞包含更多应力纤维，这造成了细胞形态的改变以及细胞面积增加约2倍。这依赖于Rho活化的激酶活性，因为加入ROCK抑制剂Y27632能防止应力纤维形成(Worthylake和Burridge，2003，J.Biol.Chem.27813578-13584；Nobes和Hall，1999，J.Cell Biol.1441235-1244)(数据未显示)。对用p130-血管生成抑制素结合蛋白N末端结构域转染的MAE细胞进行染色表明，与用p130-血管生成抑制素结合蛋白质粒逆转染的细胞所观察到的不时打断的模式相反，它与F-肌动蛋白始终如一地共定位。N末端片段的表达造成相似的应力纤维积聚，其造成细胞形状如用p130-血管生成抑制素结合蛋白所见的那样增大。这表明，N末端结构域包含靶向肌动蛋白的序列，所述序列介导应力纤维在转染的细胞中稳定。用细胞松弛素D——肌动蛋白解聚剂处理后，对p130和N末端片段染色都保持了与毒伞素染料的连接，这进一步表明N末端结构域介导p130-血管生成抑制素结合蛋白靶向于肌动蛋白。p130-血管生成抑制素结合蛋白的不时打断的膜位置证实了，对应于p80-血管生成抑制素结合蛋白的C末端区域在沿着应力纤维的隔腔中将p130-血管生成抑制素结合蛋白组织起来。另外，C末端将p130-血管生成抑制素结合蛋白集中到细胞中心部分，而只表达N末端会定位于整个细胞。
p80和p130在小鼠主动脉内皮细胞中不同的细胞内表达模式也支持同工型有不同的细胞功能。我们以前显示，过表达p80-血管生成抑制素结合蛋白的MAE细胞响应化学趋化因子迁移率提高100％(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254)。另外，p80的表达促进肿瘤体内生长并侵入周围肌肉组织(Levchenko等，2004，Oncogene，231469-1473)。血管生成抑制素结合蛋白在细胞迁移中的作用进一步由以下发现所强化血管生成抑制素结合蛋白缺陷型小鼠在胚胎期第7-8天死在子宫内，这是因为在前内脏内皮层中的迁移缺陷造成的(Shimono和Behringer，2003，Curr.Biol.13613-7)。可是，如在Boyden室或伤口愈合测试中分析的，p130血管生成抑制素结合蛋白在MAE细胞中的表达并不显著影响迁移率。p130-和p80-血管生成抑制素结合蛋白同工型包含血管生成抑制素结合结构域，其不存在于血管生成抑制素结合蛋白蛋白家族的其它两个成员中(Bratt等，2002，Gene，29869-77)。我们在本文中显示，p130-血管生成抑制素结合蛋白的血管生成抑制素结合结构域与p80-血管生成抑制素结合蛋白的血管生成抑制素结合结构域相似，暴露于细胞表面。将血管生成抑制素加入到用p130-血管生成抑制素结合蛋白转染的MAE细胞中会以与表达p80的细胞相似的效率抑制细胞迁移。可是，血管生成抑制素不影响表达p130-血管生成抑制素结合蛋白的细胞的应力纤维形成或细胞形状。这些数据表明，血管生成抑制素主要干扰p80结构域引起的潜在的信号传递途径。
p130-血管生成抑制素结合蛋白在胚胎发生期和在成体组织中的分布提示其表达是被紧密调节的；p130-血管生成抑制素结合蛋白仅在胸腺、睾丸和胎盘中被发现，而其较短的同工型分布更广。在胎盘中，血管生成抑制素结合蛋白由内皮细胞和细胞滋养层表达。后者的细胞的特征在于其能侵入蜕膜并替代子宫细动脉内皮壁，并在较少程度上替代静脉。该重要的过程建立了子宫胎盘循环(综述于Bratt等，2002，Gene，29869-77)。有趣的是，侵入的细胞滋养层获得内皮特性并表达特异于内皮的基因(如PECAME和VE-钙粘蛋白)。内皮细胞和人细胞滋养层是至今仅有的显示表达血管生成抑制素结合蛋白这两种同工型的原代细胞。结果，这两种细胞类型也通过抑制迁移或侵入来应答血管生成抑制素。
血管的管的形成包括来自周围组织的诱导性信号传递，其诱导细胞定向迁移(综述于(Carmeliet，2000，Nature Med.6389-395)。顶端细胞通过丝足的伸展来感应化学趋向梯度(Gerhardt等，2003，J.Cell Biol.1611163-1177)。管的形成还涉及重塑细胞的细胞骨架以形成封闭的单层，其围绕充满液体的中空内腔。细胞连接处的形成封住了内皮层，从而防止侧面细胞渗漏并标记了顶端和基底膜部分的边界(综述于Bazzoni和Dejana，2004，Physiol.Rev.84869-901)。我们在本文中显示，内皮细胞表达血管生成抑制素结合蛋白的两种同工型——p80和p130。我们推测这些同工型在血管生成期间起不同作用，其中p80-血管生成抑制素结合蛋白促进细胞迁移，而p130-血管生成抑制素结合蛋白涉及在管形成期间改变内皮细胞的形态。
我们提供了证据，即p80-和p130-血管生成抑制素结合蛋白都是整合型膜蛋白质。我们进一步显示，这两种同工型与ZO-1在体外和体内共定位于内皮细胞中。数据表明，血管生成抑制素结合蛋白是内皮紧密连接蛋白质复合物的新成分，并可在内皮细胞-细胞连接中起功能性作用。
我们提供了以下血管生成抑制素结合蛋白作为膜整合型蛋白质模型的证据 1.血管生成抑制素结合蛋白通过对完整的转染的以及原代内皮细胞进行细胞表面标记而生物素化。
2.血管生成抑制素结合蛋白表位对胰蛋白酶降解敏感。
3.血管生成抑制素特异结合血管生成抑制素结合蛋白转染的细胞的表面。
4.针对血管生成抑制素结合结构域的抗体与转染的细胞的细胞表面上的血管生成抑制素结合蛋白结合。我们推断，血管生成抑制素结合蛋白位于细胞表面上，其中它可用作血管生成抑制素的受体。抗体图谱提示了血管生成抑制素结合蛋白的穿膜模型，其中在血管生成抑制素结合结构域侧翼的疏水区可形成两个穿膜螺旋，使血管生成抑制素结合结构域的中心部分暴露于细胞表面上。
如序列分析所判定的，血管生成抑制素结合蛋白缺少信号肽，其表明它不通过经典的分泌途径到达膜，经典的分泌途径通过在蛋白质合成过程中将肽整合进内质网(ER)膜中而开始(Keenan等，2001，Ann.Rev.Biochem.70755-775)。可是，蛋白质可通过其他机制插入膜，或可被分泌(Nickel，2003，Eur.J.Biochem.2702109-2119)。因而，蛋白质可通过通常被称为非经典分泌来分泌。这些蛋白质的例子有bFGF(Prudovsky等，2002，J.CellBiol.158201-8)、硫氧还蛋白(Tanudji等，2003，Am.J.Physiol.Cell Physiol.284C1272-1279)、和TSAP6(Amzallag等，2004，J.Biol.Chem.27946104-46112)。还有缺少信号肽、因此在蛋白质合成期间不能被插入ER的膜蛋白质的例子。一组膜蛋白质(其通常被称为尾部锚定的蛋白质，例如突触短杆素)翻译后插入膜(Whitley等，1996，J.Biol.Chem.2717583-7586)。可是，我们提供的血管生成抑制素结合蛋白模型不支持抗血管生成抑制素结合蛋白属于该类膜蛋白质。而且，真核细胞中寄生虫利什曼虫表达的蛋白质HASPB也可从细胞质位置插入质膜内小叶，然后穿过膜(Denny等，2000，J.Biol.Chem.27511017-11025)。膜联蛋白(有趣的是，它也结合血管生成抑制素(Tuszynski等，2002，Microvasc.Res.64448-462))是膜结合蛋白质，其能被插入膜并通过包括从膜结合状态转换成跨膜状态的机理获得跨膜构型(Langen等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9514060-14065)。我们的数据提示，血管生成抑制素结合蛋白与膜联蛋白和HASPB具有相似的性质，因为尽管缺少信号肽，但仍能通过将在血管生成抑制素结合结构域侧翼的疏水螺旋插入膜来获得跨膜构型。
以前的数据显示，血管生成抑制素结合蛋白表达与细胞运动性增加相关，而且该效应被血管生成抑制素所阻断，这暗示血管生成抑制素通过阻断血管生成抑制素结合蛋白诱导的细胞运动性来抑制血管生成(Troyanovsky等，2001，J.Cell Biol.1521247-1254；Levchenko等，2003，J.CELL Sci.1163803-3810；Levchenko等，2004，Oncogene，231469-1473；Shimono和Behringer，2003，Curr.Biol.13613-7)。该研究表明，血管生成抑制素结合蛋白除了控制细胞运动性之外(Folkman，1995，NatureMed.127-31)，还在体内和体外定位于细胞-细胞接触面，而且当转染进CHO细胞时(Hanahan和Folkman，1996，Cell，86353-364)，能与紧密连接蛋白质ZO-1共定位(O’Reilly等，1994，Cell，79315-328)，将ZO-1补充到应力纤维(Ji等，1998，Faseb J.121731-8)，控制渗透(Claesson-Welsh等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，955579-5583)并结合紧密连接蛋白质MAGI-1和与其共定位。我们推断，血管生成抑制素结合蛋白是紧密连接蛋白质。以前，我们报道过，在胚胎期第9.5天检测的在内皮细胞中表达显性阴性血管生成抑制素结合蛋白的转基因小鼠展示出渗漏的血管，这造成脑中严重的出血(Levchenko等，2003，J.Cell Sci.1163803-3810)，该发现与血管生成抑制素结合蛋白减少紧密连接渗透的作用一致。
在血管生成期间，细胞迁移到新血管的位点上，然后成熟成带有成熟的紧密连接和粘附连接的功能性血管。在血管生成期间，迁移和成熟是关键的步骤，而且我们的数据与以前的发现暗示，血管生成抑制素结合蛋白能控制这两者。JAM-1(一种穿膜紧密连接蛋白质)以相似的方式减少侧面细胞渗透(Tanudji等，2003，Am.J.Physiol.Cell Physiol.284C1272-9)，而且还为bFGF诱导的内皮细胞运动性所需(Amzallag等，2004，J.Biol.Chem.27946104-46112；Whitley等，1996，J.Biol.Chem.2717583-7586)。在该研究中，血管生成抑制素特异性影响血管生成抑制素结合蛋白诱导的运动性，但不影响血管生成抑制素结合蛋白控制的渗透。这提示，血管生成抑制素专门影响参与血管生成的运动的内皮细胞，而不影响已建立的血管中的内皮细胞。另外，未见临床试验报道血管生成抑制素能增加血管渗透(Denny等，2000，J.Biol.Chem.27511017-11025)。
血管生成抑制素结合蛋白如何控制渗透？血管生成抑制素结合蛋白细胞外结构域能参与同型结合并用于封闭紧密连接，很像闭合蛋白或密蛋白。另一种可能性是血管生成抑制素结合蛋白的效应是次级的，而且是信号传递和/或其它蛋白质补充至紧密连接的结果。血管生成抑制素结合蛋白样蛋白1/JEAP也被报道位于紧密连接上(Dejana，2004，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.5261-270)，但由于该蛋白质以及蛋白质家族成员血管生成抑制素结合蛋白样蛋白2缺少血管生成抑制素结合结构域(Bratt等，2002，Gene，29869-77)，因此我们预测血管生成抑制素结合蛋白是专门的血管生成抑制素效应介导剂。
我们显示过，p130-而不是p80-血管生成抑制素结合蛋白与紧密连接蛋白质MAGI-1b相互作用，这表明p130血管生成抑制素结合蛋白409个残基的N末端延伸结构域是该相互作用所必需的。尽管我们没有显示p130-血管生成抑制素结合蛋白和MAGI-1间直接的相互作用，但是有趣的是，注意到p130的N末端包含几种富含脯氨酸的结构域，包括PpxY基序，其能用作MAGI-1的WW结构域的结合基序(Dobrosotskaya和James，2000，Biochem.Biophys.Res.Comm.270903-9；Kay等，2000，Faseb J.14231-241)。可是，与MAGI-1的相互作用并不是将血管生成抑制素结合蛋白靶向紧密连接所必需的，因为血管生成抑制素结合蛋白本身定位于细胞-细胞接触面并控制渗透。
肌动蛋白细胞骨架和GTP酶的Rho家族都能紧密调节细胞运动性和紧密连接。例如，尽管Rho和Rac都被识别为细胞运动性的两种最重要调节剂(Burridge和Wennerberg，2004，Cell，116167-179)，这两者都分别在调节Par-3和Par-6下游的紧密连接形成中起关键作用(Chen和Macara，2005，Nat.Cell Biol.7262-9；Ozdamar等，2005，Science，3071603-1609；Patrie等，2002，J.Biol.Chem.27730183-30190)。可能的是，血管生成抑制素结合蛋白通过影响肌动蛋白细胞骨架来调节渗透和运动性。实际上，有证据表明血管生成抑制素和血管生成抑制素结合蛋白与Rho信号传递相联系(Ernkvist等，2005，已提交；Gupta 等，2001，EMBO Rep.2536-540)(Bratt和Holmgren)，而且试图推测肌动蛋白细胞骨架的控制是血管生成抑制素结合蛋白两种性质的核心。根据此，MAGI-1结合肌动蛋白结合蛋白质α-辅肌动蛋白4和突触足蛋白(Patrie等，2002，J.Biol.Chem.27730183-30190)。
用VEGF抗体bevacizumab获得的令人激动的结果(Hurwitz等，2004，N.Engl.J.Med.3502335-42)显示，我们正进入抗血管生成疗法的纪元，而且表明需要另外的血管生成抑制剂。我们的结果提供了设计结合血管生成抑制素结合蛋白的血管生成抑制素结合结构域的抗体的基本原理。已经显示，通过阻断VE-钙粘蛋白来影响细胞-细胞相互作用的抗血管生成抗体可以设计成不导致成熟血管的渗透，而仅阻断新血管化(Corada等，2002，Blood，100905-11)。该研究提示，血管生成抑制素模拟抗体可通过专门控制细胞迁移、而不影响成熟血管中的内皮细胞的细胞-细胞接触面来阻断血管生成。
实施例2-优选的药物制剂和给药模式和剂量。
本发明的多肽、多核苷酸和抗体可利用可注射的持续释放药物递送系统而递送。这些被特别设计以减少注射频率。该系统的例子是NutropinDepot，其用可生物降解的微球将重组人生长激素(rhGH)包裹成胶囊，一旦注射，就可在一段持续的时期缓慢释放rhGH。
本发明的多肽、多核苷酸和抗体可通过外科手术植入设备给药，其直接将药物释放到所需的位置。例如，Vitrasert将更昔洛韦直接释放到眼睛中以治疗CMV视网膜炎。该有毒性的试剂向疾病位点的直接应用得到了有效的治疗效果，而没有药物的显著全身性副作用。
电穿孔治疗(EPT)系统也可用于给药。向细胞递送脉冲电场的设备能增加药物向细胞膜的渗透，使得显著增强细胞内药物递送。
本发明的多肽、多核苷酸和抗体也可通过电掺入(EI)来递送。EI发生在皮肤表面上大至30微米直径的小颗粒受到与电穿孔中所用的那些一样或相似的电脉冲的时候。在EI中，这些颗粒被驱动穿过角质层表皮并进入皮肤的更深层。颗粒可装载或包被有药物或基因，或能简单地用作“子弹”在皮肤上产生孔，让药物能进入。
可选的给药方法是热敏的ReGel注射系统。低于体温时，ReGel是可注射的液体，而在体温时，它立刻形成凝胶体缓慢腐蚀并溶解成已知安全的、可生物降解的聚合物。活性药物随着生物聚合物溶解而随时间被递送。
本发明的多肽、多核苷酸和抗体可通过“木马肽(Trojan peptide)”而导入细胞中。这些是被称为penetratin的多肽类型，其具有易位性质并能携带亲水化合物穿过质膜。该系统将寡肽定向靶向于细胞质和核，并可以是非细胞类型特异性的并有高功效(Derossi等，1998，TrendsCell Biol.8，84-87)。
本发明的药物制剂优选是单位剂型，其含每日剂量或单位、每日亚剂量或其合适分数的活性成分。
本发明的多肽、多核苷酸和抗体可通过任何非肠道途径给药，其药学上可接受的剂型的药物制剂的形式包括活性成分，任选形式是非毒性的有机、或无机酸、或碱、加成盐的形式。根据要治疗的疾病和患者以及给药途径，组合物可以各种剂量给药。
在治疗人时，本发明的多肽、多核苷酸和抗体可单独给药，但通常将与根据所希望的给药途径和标准药物实践而选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合给药。
本发明的多肽、多核苷酸和抗体也可非肠道给药，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下给药，或它们可通过融合技术给药。它们最好以无菌水溶液形式使用，其可含其它物质，例如，足够的盐或葡萄糖以制备与血液等渗的溶液。如果需要，水溶液应当是合适的缓冲液(优选pH为3至9)。通过所属领域技术人员公知的标准药物技术，能容易完成在无菌条件下制备合适的非肠道制剂。
适于非肠道给药的制剂包括水溶性和非水溶性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和能使制剂与所希望的接受者血液等渗的溶质；和水溶性和非水溶性无菌混悬液，其可包括混悬剂和增稠剂。制剂可以提供在单位剂量或多剂量容器中，例如在密封的安瓿和小瓶中，并可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件下，其仅需要在使用前立即加入无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和混悬液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
一般而言，在人中，口服或非肠道给药本发明的多肽、多核苷酸和抗体是优选的途径，是最方便的。
对于兽医应用，本发明的多肽、多核苷酸和抗体根据正常兽医实践作为合适的可接受的剂型给药，而且兽医医生将能确定最适于特定动物的剂量方案和给药途径。
本发明药物组合物的制剂可方便地以单位剂量形式提供，并可以通过任何现有公知的制药方法来制备。该方法包括将活性成分与由一种或多种辅助成分构成的载体组合起来。一般而言，通过将活性成分与液体载体或细密分割的固体载体或这两者均一、精密地组合起来，然后如果需要，对产品塑形，由此制备制剂。
优选的单位剂量制剂是含每日剂量或单位、每日亚剂量或其合适分数的活性成分。
本发明优选的递送系统可包含注满本发明的多肽、多核苷酸和抗体的水凝胶，其优选携带在棉塞上，其能被塞入子宫颈，并一旦产生合适的子宫颈成熟或其他对女性生殖系统所需的影响，就能收回。
应当能理解的是，除了上述特别提到的成分，根据所需要的制剂类型，本发明的制剂可包括其他现有常规的试剂。
实施例3-示例性的药物制剂 尽管本发明的多肽、多核苷酸和抗体可以单独给药，优选将其与一种或多种可接受的载体配制成药物制剂。一种或多种载体必须是“可接受的”，其含义与本发明的化合物相容，对其接受者无毒。载体通常是无菌和无热原的水或盐液。
以下例子示例了本发明所述的药物制剂，其中活性成分是本发明的多肽、多核苷酸和/或抗体。
实施例3A眼科溶液 活性成分 0.5g 氯化钠(分析级)0.9g 硫柳汞0.001g 加纯水至 100ml pH调节至 7.5 实施例3B胶囊剂 制剂A 胶囊制剂通过混合以上实施例C中的制剂D的成份并装填入两部分硬明胶胶囊中来制备。制剂B(见下)以相似的方式制备。
制剂B mg/胶囊 活性成分 250 乳糖B.P. 143 葡糖酸淀粉钠 25 硬脂酸镁 2 420 制剂C mg/胶囊 活性成分 250 聚乙二醇4000 BP350 600 胶囊的制备是熔化聚乙二醇4000BP，使活性成分分散于熔化物中并将熔化物装填入两部分硬明胶胶囊中。
制剂D mg/胶囊 活性成分 250 卵磷脂 100 花生油 100 450 胶囊的制备是使活性成分分散于卵磷脂和花生油中并将分散物装填入软的有弹性的明胶胶囊中。
制剂E(控释胶囊) 以下控释胶囊制剂的制备是用挤压机挤压出成份a、b、和c，然后使挤压物呈球形并干燥。然后，干燥的小团用控释膜(d)包被并装填入两片硬明胶胶囊中。
mg/胶囊 活性成分 250 微晶纤维素 125 乳糖BP 125 乙基纤维素 13 513 实施例3C 注射剂 活性成分 0.200g 加无菌、无热源磷酸缓冲液(pH7.0)至10ml 活性成分溶于大部分磷酸缓冲液(35-40℃)中，然后补充至体积并通过无菌微孔过滤膜过滤进无菌的10ml琥珀色玻璃瓶(1型)中，并用无菌塞子密封并打上封印。
实施例3D肌肉内注射剂 活性成分0.20g 苯甲醇 0.10g 四氢呋喃聚乙二醇醚(Glucofurol)751.45g 加注射用水适量至3.00ml 活性成分溶于四氢呋喃聚乙二醇醚中。然后加入苯甲醇并溶解，加水至3ml。然后将混合物通过无菌微孔膜过滤并密封于无菌的3ml瓶(1型)中。
实施例3E糖浆混悬剂 活性成分 0.2500g 山梨醇溶液1.5000g 甘油 2.0000g 可分散的纤维素0.0750g 安息香酸钠0.0050g 桃味调味剂17.42.3169 0.0125ml 加纯水适量至 5.0000ml 安息香酸钠溶于部分纯水中并加入山梨醇溶液。加入活性成分并分散。
在甘油中分散有增稠剂(可分散的纤维素)。混合两种分散物并用纯水加到所需的体积。如需要，通过额外搅拌混悬液来进一步增稠。
实施例3F栓剂 mg/栓剂 活性成分(63μm)* 250 固体脂肪BP(Witepsol H15-Dynamit Nobel)1770 2020 *活性成分被用作粉末，其中至少90％的颗粒是63μm直径的或更小。
将五分之一的Witepsol H15在蒸汽套盘中以最大45℃熔解。活性成分筛过200μm筛子并加到熔化的基质同时混合，用装有切割头的silverson搅拌直至得到平滑的分散物。于45℃保存混合物，将剩下的Witepsol H15加入到混悬液中并搅拌以确保均匀混合。将全部混悬液通过250μm不锈钢屏，期间不断搅拌，使之冷却至40℃。于温度38℃至40℃，将2.02g混合物装填入合适的塑料模具中。将栓剂冷却至室温。
实施例3G阴道栓剂 mg/阴道栓剂 活性成分250 无水葡萄糖 380 土豆淀粉363 硬脂酸镁7 1000 以上成份直接混合，通过直接压缩得到的混合物来制备阴道栓剂。
实施例3H乳剂和药膏 描述于Remington，The Science and Practise of Pharmacy，第19版，ThePhiladelphia College of Pharmacy and Science，ISBN 0-912734-04-3。
实施例3I微球剂型 本发明的化合物也可利用微球剂型来递送，如描述于Cleland(1997，Pharm.Biotechnol.101-43；和2001，J.Control.Release 7213-24)中的那些。
权利要求
1.用于调节血管生成和/或肿瘤形成的分离或重组的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽是分离或重组的哺乳动物p130-血管生成抑制素结合蛋白。
3.权利要求2的多肽，其中所述多肽是分离或重组的人p130-血管生成抑制素结合蛋白。
4.权利要求1至3之任一的多肽，其中所述多肽包含
(i)序列SEQ ID NO1；或
(ii)与SEQ ID NO1具有至少80％和/或至少90％和/或至少95％和/或至少98％同一性、并提供功能性多肽的序列；或
(iii)SEQ ID NO1或(ii)的序列的功能性片段。
而且其中所述多肽不是p80-血管生成抑制素结合蛋白或p80-血管生成抑制素结合蛋白的片段。
5.权利要求4的多肽，其中SEQ ID NO1的功能性片段由SEQ ID NO1的氨基酸残基1至409组成。
6.抗体或其片段，其能结合如权利要求1至5之任一所限定的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽。
7.权利要求6的抗体或片段，其能结合由SEQ ID NO1的残基1至残基409所限定的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽的区域，但不能结合p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽。
8.权利要求6的抗体或片段，其能结合由SEQ ID NO1的残基410至残基1084所限定的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽的区域，但不能结合p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽。
9.权利要求6的抗体或片段，其能结合由SEQ ID NO1的残基871至残基1013所限定的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽的区域，但不能结合p80-血管生成抑制素结合蛋白多肽。
10.如权利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)用于产生能结合如权利要求1至5之任一所限定的p130-血管生成抑制素结合蛋白多肽的抗体的用途。
11.用作药物的如权利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或如权利要求6至9之任一所限定的抗体或片段。
12.如权利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或如权利要求6至9之任一所限定的抗体或片段用于制备调节血管生成和/或肿瘤形成的药物的用途。
13.权利要求12的用途，其中所述药物防止和/或减轻血管生成和/或肿瘤形成。
14.如权利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或如权利要求6至9之任一所限定的抗体或片段用于制备治疗患有血管生成相关疾病或病症的受试者的药物的用途。
15.如权利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或如权利要求6至9之任一所限定的抗体或片段用于制备免疫接种患有血管生成和/或肿瘤形成和/或血管生成相关疾病或病症或处于所述疾病或病症风险的受试者的疫苗的用途。
16.权利要求14或15的用途，其中血管生成相关疾病或病症是癌、实体肿瘤、血管瘤、眼新血管形成、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、类风湿性关节炎、炎症性病况、牛皮癣、慢性肠炎、哮喘或子宫内膜异位症。
17.如权利要求6至9之任一所限定的抗体或片段在检测和/或测量测试样品中血管生成和/或肿瘤形成中的用途。
18.用于调节血管生成和/或肿瘤形成的药物组合物，其包含有效量的如权利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或如权利要求6至9之任一所限定的抗体或片段，和药物赋形剂或稀释剂。
19.权利要求18的药物组合物，其防止和/或减轻血管生成和/或肿瘤形成。
20.用于调节血管生成和/或肿瘤形成的疫苗，其包含有效量的如权利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素结合蛋白多肽和/或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)，和赋形剂或稀释剂。
21.权利要求20的疫苗或权利要求18或19的药物组合物，其进一步包含至少一种用于辅助或增大多肽和/或多核苷酸(和/或反义多核苷酸)和/或其抗体或片段的作用的添加剂。
22.权利要求21的疫苗或权利要求21的药物组合物，其中至少一种添加剂是免疫刺激分子。
23.权利要求22的疫苗或权利要求22的药物组合物，其中免疫刺激分子是细胞因子或编码细胞因子的多核苷酸(和/或反义多核苷酸)。
24.权利要求20至23之任一的疫苗，其中所述疫苗包含细胞或细胞提取物。
25.权利要求24的疫苗，其中细胞是抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞负载有血管生成抑制素结合蛋白多肽、或被编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)所转染。
26.权利要求25的疫苗，其中细胞是表达血管生成抑制素结合蛋白的肿瘤细胞或表达血管生成抑制素结合蛋白的内皮细胞。
27.在哺乳动物中产生针对血管生成抑制素结合蛋白的免疫应答的方法，该方法包括以下步骤
(i)用如权利要求1至5之任一所限定的血管生成抑制素结合蛋白多肽或其编码多核苷酸(和/或反义多核苷酸)先体外后体内刺激收集自哺乳动物的免疫细胞；
(ii)将受刺激的免疫细胞转移回哺乳动物，由此将细胞转移回哺乳动物产生针对血管生成抑制素结合蛋白的免疫应答。
28.权利要求27的方法，其中哺乳动物是人。
29.权利要求27或28的方法，其中免疫应答起预防性或治疗性作用，以抑制血管生成相关疾病的发生或进展。
30.权利要求10至17之任一的用途或权利要求18、19或21之任一的药物组合物或权利要求20至26之任一的疫苗或权利要求27至29之任一的方法，其中编码多核苷酸包含
(i)SEQ ID NO2的多核苷酸(和/或反义多核苷酸)；或
(ii)多核苷酸(和/或反义多核苷酸)，其与SEQ ID NO2有至少80％和/或至少90％和/或至少95％和/或至少98％同一性，和/或能与SEQ IDNO2在65℃、2xSSC的条件下杂交，和/或其编码功能性多肽；或
(iii)SEQ ID NO2的片段，其编码功能性多肽
而且其中多核苷酸(和/或反义多核苷酸)不编码p80-血管生成抑制素结合蛋白或p80-血管生成抑制素结合蛋白的片段。
全文摘要
本发明涉及预防性或治疗性治疗，以阻止血管形成(例如，血管生成)，例如阻止肿瘤生长。本发明尤其涉及疫苗或药物，其包含完整的血管生成抑制素结合蛋白分子或其片段，其可用于产生针对血管生成抑制素结合蛋白的免疫应答。本发明还提供了特异针对完整血管生成抑制素结合蛋白分子或其片段的抗体，用于预防性或治疗性治疗。
文档编号C07K14/435GK101213210SQ200680024095
公开日2008年7月2日 申请日期2006年4月28日 优先权日2005年4月29日
发明者拉斯·霍姆格伦 申请人:生物发明国际公司