MUC1-Fc多肽疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域，尤其涉及一种MUCl-Fc多肽疫苗 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤细胞在其发生、发展过程中，由于细胞的基因突变或表达调控会表达一些新 的抗原或过表达一些抗原，而这些新抗原作为"非己物质"，可以被机体的免疫系统识别和 杀伤，机体可以通过天然和获得性免疫抵抗肿瘤。然而，肿瘤在人体的免疫功能作用下仍然 能够发展、转移，表明肿瘤也有自己的保护机制。肿瘤细胞可以通过对自身表明抗原的修饰 及改变肿瘤周围的微环境来逃避机体的免疫识别和攻击，即肿瘤的免疫逃逸。而肿瘤疫苗 则可以打破自身免疫系统对肿瘤抗原的耐受，活化肿瘤特异性T细胞或诱导产生肿瘤特异 的抗体，激活免疫识别，达到杀伤肿瘤的目的。
[0003] 许多研宄表明，肿瘤细胞表面的抗原多肽能够有效激发肿瘤细胞的免疫应答，有 学者通过从肿瘤表面洗脱的抗原肽以及来自肿瘤内部特异性的蛋白制备出肽疫苗，其可以 通过DC细胞的提呈作用引发CTL反应，另外热休克蛋白-肽复合物具有良好的免疫原性， 可诱导抗肿瘤免疫应答，此外HSP70可诱导T细胞进入肿瘤，并诱发TFA-a、IL-2等细胞因 子的表达。自1989年第一个人类特异性抗原报道以来，目前已经有许多肿瘤抗原被发现。 相对于其他类型的抗原（蛋白质、DNA疫苗、病毒载体抗原等），来源于肿瘤相关抗原的抗 原肽具有特异性高、安全等优势，而且，还可以通过氨基酸置换、改变肽的构象及修饰氨基 酸残基等方法提高肽的免疫原性。然而肿瘤细胞表达递呈的抗原多肽，既有优势表位，也存 在弱势甚至抑制性表位，而且表面抗原肽的表达量很低，必须通过大量肿瘤细胞的免疫，才 能提供足够的抗原。因此不得不探索如何寻找高纯度高效的特异性肿瘤抗原多肽来制备疫 苗。
[0004]MUCl是由mucl基因表达的一种高糖基化（糖基化大于50% )、高分子量 (Mr>200X103)蛋白，又称附膜蛋白，是跨膜分子。它在上皮更新与分化，维持上皮完整性 和癌的发生与转移等方面起到重要的作用。MUCl的多肽骨架含有空间结构稳定一致的可 变数目重复序列（VNTR)，抗原决定簇主要集中在这一区域。正常细胞表面的MUCl的核心 肽被外周糖链掩盖，而在癌变细胞表面，由于畸形糖基化和糖基化不完全等原因，肿瘤细胞 的MUCl在糖链上有所改变，导致蛋白核心肽的部分暴露，使新的肿瘤相关抗原表位和糖原 表位暴露出来。糖基化不完全的MUCl广泛分布（90%的实体瘤和多种非实体瘤）并异常丰 富的表达于癌细胞表面。因此MUCl已经成为一种非常有潜力的治疗性肿瘤疫苗靶标。 [0005] 然而目前所用的MUCl多肽疫苗由于表位太小，因此只能针对MHCI或MHCII，具 有MHC限制性因素，不能有效的激活CTL反应。2011年，以色列的研宄人员开发了一种相对 较长的MUCl多肽肿瘤疫苗，此多肽疫苗同时包含有MHCI和MHCII结合表位，并且经试验 能和超过50%白种人群的CD4+和CD8+T细胞的HLA结合。经体外和小鼠体内实验表明，其 能有效的激活CD4+细胞以及CD8+细胞的CTL反应。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种MUCl-Fc多肽疫苗及其制备方法和应用，特别是一种能同时含 有MHCI和MHCII结合表位的MUCl+免疫球蛋白Fc段的多肽疫苗及其制备方法和应用。
[0007] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 第一方面，本发明提供了一种MUCl-Fc多肽疫苗，其包含带免疫球蛋白Fc段的 MUCl抗原多肽。
[0009] 本发明首先利用生物信息学的方法，在MUCl蛋白原始序列基础上进行MUCl肿瘤 多肽以及人类白细胞抗原（HLA)结合预测，然后对预测的序列进行化学合成多肽，优化改 良，得到效果最好的肽段后将其表达序列与免疫球蛋白Fc段融合表达，最后纯化得到本发 明的带免疫球蛋白Fc段的MUCl抗原多肽序列。
[0010] 本发明中，所述带免疫球蛋白Fc段的MUCl抗原多肽序列如SEQIDNO: 1所示：
[0011]SEQIDNO:I:Kosak序列+MUCl+接头（linker)+Fc段，其序列如下:
【主权项】
1. 一种MUCl-Fc多肽疫苗，其特征在于，其包含带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽。
2. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽的 序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括载体； 优选地，所述载体为生物可降解材料； 优选地，所述载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇、水溶性维生素E衍生物、聚乳 酸、聚己内酯或1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷中的任意一种或至少两种的组合； 优选地，所述载体为1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷。
4. 如权利要求1-3任一项所述的疫苗的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤： (1) 融合免疫球蛋白Fe段到MUCl多肽片段，获得带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽 序列，并通过Red/ET同源重组或酶切酶连的方法制备对应的表达载体，再通过生物表达和 纯化得到带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽； (2) 利用载体包被所述的带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤⑴中，利用Red/ET同源重 组方法，设计上游同源臂：(HindIII) CTCTAGCGTTTAAACTTMOeiI;下游同源臂：(BamHI) GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA，将所述带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽序列构建到载体 上，然后在大肠杆菌中表达和纯化； 优选地，所述载体为pET32a、pET22b、pET28a、pET29a、pET9a或pET3a中的任意一种。
6. 如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，所述载体为生物可降 解材料； 优选地，所述载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇、水溶性维生素E衍生物、聚乳 酸、聚己内酯或1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷中的任意一种或至少两种的组合； 优选地，所述载体为1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷。
7. 如权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，所述包被包括以 下步骤： 1) 将载体用有机溶剂溶解至浓度为I uM/mL ; 2) 用氮气恒流将有机溶剂吹干，使载体形成均匀的膜结构并将其干燥过夜； 3) 加入用PBS稀释过的所述带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽，使载体被充分水合， 超声10-15min，过滤，4°C保存备用； 优选地，所述有机溶剂为氯仿与甲醇的体积比为2:1。
8. 如权利要求3-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 融合免疫球蛋白Fe段到MUCl多肽片段，获得带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽 序列，利用Red/ET同源重组方法，设计上游同源臂：(HindIII) CTCTAGCGTTTAAACTTAAGCTT： 下游同源臂：(BamHI)GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA,将带免疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽 序列构建到pET32a载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化得到带免疫球蛋白Fe段的MUCl 抗原多肽； (2) 将1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷用有机溶剂溶解至浓度为Iy M/mL，其中， 所述有机溶剂为氯仿与甲醇的体积比为2:1 ;用氮气恒流将有机溶剂吹干，使1，2-二油酰 基-3-三甲基氨基内烷形成均匀的膜结构并将其干燥过夜；加入用PBS稀释过的所述带免 疫球蛋白Fe段的MUCl抗原多肽，使1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷被充分水合，水合 结束后，在被冰块预冷的超声洗涤槽中，超声10-15min，用0. 22 yM过滤器过滤3次，4°C保 存备用。
9. 如权利要求1-3任一项所述的疫苗在制备治疗或预防癌症药物中的应用。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、 前列腺癌、宫颈癌或食道癌中的任意一种或至少两种的组合。
【专利摘要】本发明涉及一种MUC1-Fc多肽疫苗及其制备方法和应用，本发明所述的多肽疫苗包含带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO:1所示；通过基因工程技术，将所述的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列构建到载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化，再经脂质体等载体包被即可得到本发明的MUC1-Fc多肽疫苗。本发明的MUC1-Fc多肽疫苗同时包含有MHC I和MHC II结合表位，可以突破MHC限制性因素，有效激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，对肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，可以取得更好的预防和治疗效果。
【IPC分类】A61K39-395, A61P35-00, A61P35-04, A61K39-00
【公开号】CN104800838
【申请号】CN201510175146
【发明人】于浩洋, 李正成, 苏静
【申请人】苏静
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月14日