牛口蹄疫a型多肽疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明设及一种牛A型口蹄疫 多肤疫苗，W及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫任oot and mouth disease,简称FMD)是一种偶蹄动物发生的急性、高度接 触性、发热性传染病，在世界范围内广泛分布。口蹄疫的传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊 等牲畜后将导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，因此严重危害畜牧业的发展和肉 食及其畜产品的生产和供应。目前，口蹄疫使动物及动物产品的市场流通和国际贸易受到 极大的封锁和限制，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。
[0003] 口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV)感染引起的。口蹄疫病毒属于细小核糖核酸病毒， 具有多型性、易变性等特点。目前，已知全世界有7种血清型的口蹄疫病毒；A、0、C、Satl (南 非I型）、Sat2(南非II型）、Sat3(南非III型）和Asia I (亚洲I型）。该些主型中的 每一种又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种。血清型A、0、C和Asia I型的口蹄疫 病毒最为常见，其中血清型A病毒的变种最多，具有超过30种亚型。研究结果表明，口蹄疫 病毒的衣壳蛋白是由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的，每种各60个。VP1-VP3组 成衣壳蛋白亚单位，位于衣壳蛋白的外侧，而VP4位于病毒颗粒的内部。
[0004] 口蹄疫病毒各型之间的抗原性不同，彼此之间不能交互免疫。而且，在同一种血清 型中抗原差异的程度也很大，W至于能够有效地抵抗一种亚型的口蹄疫疫苗可能针对同一 血清型中的另一种亚型没有保护性。此外，口蹄疫毒株的抗原性还在不断发生变化，随着时 间的推移，原有疫苗的效力减弱甚至消失，因此给口蹄疫的防治工作带来了很大的困难。
[0005] 当前在我国牛群中流行的口蹄疫主要是0型、Asia I型和A型口蹄疫。我国对口 蹄疫实行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是，我国现行使用的口蹄疫疫 苗主要是病毒灭活疫苗，其存在着生物安全性差、副反应大、产品质量不稳定等问题。相比 之下，目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜 产品。由此可见，在口蹄疫防治方面，我国已落后于世界发展形势。
[0006] 在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先后有基因工程亚单位疫苗、口蹄疫病毒载体疫 苗、口蹄疫基因工程修饰疫苗的研究报道，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在着诸 多问题，影响了该些新型疫苗的使用。此外，该些疫苗对于当前已经发生变异的流行毒株往 往效果较差，不能有效地保护动物。因此，本领域仍然存在对于安全、有效的口蹄疫新型疫 苗的需求。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种用于制备牛口蹄疫A型多肤疫苗的抗原多肤，多肤组 合物，W及含有该多肤组合物的疫苗。
[000引为实现上述目的，本发明采用了 W下技术方案：
[0009] 一方面，本发明提供一种用于制备牛口蹄疫A型肤疫苗的抗原多肤，含有序列5所 述的多肤片段。
[0010] 具体的，本发明提供的用于制备牛口蹄疫A型肤疫苗的抗原多肤，为a-d中任意一 项所述的多肤：
[0011] a.将序列1所示的多肤片段与序列5所述的多肤片段连接后获得的多肤（多肤 1);
[0012] b.将序列2所示的多肤片段与序列5所示的多肤片段连接后获得的多肤（多肤 2);
[0013] C.将序列3所示的多肤片段与序列5所示的多肤片段连接后获得的多肤（多肤 3) ;
[0014] d.将序列4所示的多肤片段与序列5所示的多肤片段连接后获得的多肤（多肤 4) 。
[0015] 本发明提供的用于制备牛口蹄疫A型疫苗的多肤组合物，包括将序列1所示的多 肤片段与序列5所述的多肤片段连接后获得的多肤（多肤1)。
[0016] 所述多肤组合物中还包括；下述1)-3)中所述多肤之一：
[0017] 1)将序列2所示的多肤片段与序列5所示的多肤片段连接后获得的多肤（多肤 2);
[001引 2)将序列3所示的多肤片段与序列5所示的多肤片段连接后获得的多肤（多肤 3) ;
[0019] 3)将序列4所示的多肤片段与序列5所示的多肤片段连接后获得的多肤（多肤 4) 。
[0020] 本发明中所述的多肤及多肤片段可W是通过固相有机合成得到的肤物质。
[0021] 所述序列5所述的多肤片段通过连接臂与序列1所述的多肤片段、序列2所述的 多肤片段、序列3所述的多肤片段或序列4所述的多肤片段连接，所述连接臂为甘氨酸或者 赖氨酸；当所述连接臂为赖氨酸时，赖氨酸的e位氨基替代a位氨基形成肤键连接。
[0022] 优选的，序列5所述的多肤片段与序列1所述的多肤片段、序列2所述的多肤片 段、序列3所述的多肤片段或序列4所述的多肤片段通过赖氨酸连接，所述序列1所述的多 肤片段、序列2所述的多肤片段、序列3所述的多肤片段或序列4所述的多肤片段的駿基端 与赖氨酸的e位氨基连接成肤键，赖氨酸的駿基与序列5所示多肤片段的氨基端连接成肤 键。
[0023] 具体的上述各个多肤的序列如下所示：
[0024] 多肤 1 ;
[00巧]RMEAAKTGKIAYDERRGk e K-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLG化
[0026] AARVAA化PASFNFGAIR (序列 1- e K-序列 5)
[0027] 多肤 2 ;
[00巧]RMEAKKTGKIAGDERRGk e K-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLG化
[0029] AARVAA化PASFNFGAIR (序列 2- e K-序列 5)
[0030] 多肤 3 ;
[003U KKGAGLAGVMVTESVGF服-e K-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGS
[003引 LAARVAA化PASFNFGAIR (序列 3- e K-序列 5)
[0033] 多肤 4 ;
[0034] KKGAGLTGVMYTESVRF服-e K-VYNGTCKYSTGNAGRRGDLGS
[0035] LAARVAA化PASFNFGAIR (序列 4- e K-序列 5)
[0036] 其中，eK为多肤片段之间的连接臂，即赖氨酸的e位氨基形成肤键，具体原理如 下所示：
[0037] 每个氨基酸至少包含一个"一COOH"(駿基）和一个"一畑3"(氨基），连接在a 碳原子上的駿基和氨基称为"a駿基"和"a氨基"。一般的肤合成反应为上一个氨基酸的 "a氨基"和下一个氨基酸的"a駿基"反应形成酷胺键（肤键）而成。
[003引 Lys(赖氨酸）是一种碱性氨基酸，除了正常的"a氨基"和"a駿基"外，在e位 置上还有一个氨基，如下式。
[0039]
【主权项】
1. 一种用于制备牛口蹄疫A型肽疫苗的抗原多肽，含有序列5所述的多肽片段。
2. -种用于制备牛口蹄疫A型肽疫苗的抗原多肽，为a-d中任意一项所述的多肽： a. 将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽； b. 将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽； c. 将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽； d. 将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽。
3. -种用于制备牛口蹄疫A型肽疫苗的多肽组合物，包括将序列1所示的多肽片段与 序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽。
4. 根据权利要求3所述的多肽组合物，其特征在于：还包括：下述1)-3)中所述多肽之 1) 将序列2所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽； 2) 将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽； 3) 将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽。
5. 根据权利要求3或4所述的多肽组合物，其特征在于：所述序列5所述的多肽片段 通过连接臂与序列1所述的多肽片段、序列2所述的多肽片段、序列3所述的多肽片段或序 列4所述的多肽片段连接，所述连接臂为甘氨酸或者赖氨酸；当所述连接臂为赖氨酸时，赖 氨酸的ε位氨基替代α位氨基形成肽键连接。 优选的，序列5所述的多肽片段与序列1所述的多肽片段、序列2所述的多肽片段、序 列3所述的多肽片段或序列4所述的多肽片段通过赖氨酸连接，所述序列1所述的多肽片 段、序列2所述的多肽片段、序列3所述的多肽片段或序列4所述的多肽片段的羧基端与赖 氨酸的ε位氨基连接成肽键，赖氨酸的羧基与序列5所示多肽片段的氨基端连接成肽键。
6. 根据权利要求3所述的多肽组合物，其特征在于：组成多肽组合物的多肽单链首尾 氨基酸残基之间反应共价连接形成环状多肽或者所述多肽的单链中的两个半胱氨酸的巯 基可以经氧化连接在一起形成二硫键； 优选地，所述多肽的单链首尾氨基酸残基共价连接为羧基与氨基、或者羧基与羟基之 间反应形成共价连接形成环状多肽。
7. 根据权利要求1-4中任意一项所述的多肽组合物，其特征在于：由将序列1所示的 多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽、将序列2所示的多肽片段与序列5 所示的多肽片段连接后获得的多肽；将序列3所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连 接后获得的多肽和将序列4所示的多肽片段与序列5所示的多肽片段连接后获得的多肽组 成；优选的，它们的摩尔比为（0. 5-1. 5) : (0. 5-1. 5) : (0. 5-1. 5) : (0. 5-1. 5);最优选的，它 们的摩尔比为1 :1 :1 :1。
8. 权利要求1或2所述的抗原多肽以及权利要求3-7中任意一项所述的多肽组合物在 制备牛口蹄疫A型多肽疫苗或制备用于预防牛A型口蹄疫的生物制品中的应用。
9. 一种牛A型口蹄疫多肽疫苗，包含权利要求1至7中任一项所述的多肽组合物。
10. 牛口蹄疫A型多肽疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤： (1) 用注射用水将权利要求3-7中任意一项所述多肽组合物稀释为10-100 μ g/ml的浓 度，从而得到多肽抗原水相； (2) 将佐剂灭菌； (3)在20~28°C条件下，按照所述多肽抗原水相与所述佐剂1 :1的体积比，先将佐剂 加入乳化罐内，在90~150rpm下搅拌1. 5~3分钟，然后缓慢加入多肽抗原水相，然后搅 拌20~30分钟，再在8000~1000 Orpm下搅拌15~30分钟，静置3-10分钟，分装。
【专利摘要】本发明提供一种用于制备牛口蹄疫A型多肽疫苗的抗原多肽、多肽组合物及疫苗。多肽组合物包括将序列1所示的多肽片段与序列5所述的多肽片段连接后获得的多肽。本发明的疫苗包括多肽组合物。本发明提供的牛口蹄疫A型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，并且不会引发传统疫苗存在的发热、红肿等问题，因此本发明的疫苗可以有效应对目前口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。本发明还提供了所述多肽和肽疫苗的制备方法以及其制药用途。
【IPC分类】A61P31-14, A61K39-135, C07K14-00
【公开号】CN104672312
【申请号】CN201510124702
【发明人】肖进, 宋芳, 齐鹏, 巴利民, 栗利芳, 王楠, 董春娜, 张蕾, 马爱荣, 张爱民, 何平安
【申请人】中牧实业股份有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月20日