专利名称：：亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法；具体涉及一种用于亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法。
背景技术：
：口蹄疫(footandmouthdisease,简称FMD)是一种发生于偶蹄动物的急性、高度接触性、发热性传染病，在世界范围内分布很广，属于国际间相互传播的全球性流行性传染病。口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的，该病毒属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，呈球形，直径为30nm,无嚢膜。口蹄疫病毒结构简单，由单链核4唐核酸和蛋白质组成，其在病畜水疱皮内以及淋巴液中含量最多，致病力强。口蹄疫病毒共有7种血清型(0、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaI),每种血清型又分成多个亚型，不同亚型之间没有交叉免疫性。近年来，亚洲一型口^帝疫病毒(FMDV)在东南亚和印度半岛呈地方性流行，并且以这两个地区为中心向中东及东南亚周边地区扩散。目前对于该疾病的预防，大多数发展中国家釆用病毒灭活疫苗进行免疫。在国际上，绝大多数生产企业生产口蹄疫疫苗时采取细胞悬浮或细胞转瓶的培养方式，并通过二乙烯亚胺(BEI)将病毒灭活，采用氢氧化铝胶作为吸附剂、矿物油作为乳化佐剂来配制疫苗。虽然口蹄疫灭活疫苗具有较强的免疫效力，但由于其生物安全性差、产品的稳定性欠佳、容易产生过敏副反应等诸多不利因素，并且国际兽医局(OIE)特别规定无口蹄疫的国家或地区禁用灭活疫苗，所以开发新型口蹄疫疫苗的研究就被提上了日程。随着现代生物技术的快速发展，人们对口蹄疫病毒本身以及病毒与动物的免疫应答机制的研究越来越深入，为研制基因工程疫苗、化学合成肽疫苗等分子水平疫苗提供了技术保障。研究发现FMDV是由一条RNA核酸链和衣壳蛋白组成的，基因组RNA全长约8.5kb,可以直接作为信使認A。FMDV基因组RNA由5'UTR、3'UTR和OFR组成。5'UTR长约1300nt，含有VPg、二级结构、P10基因、Poly(c)区段和内部核糖体进入位点等(IRES)。3'UTR由Poly(A)尾和大ORF3'末端与Poly(A)区段5，末端之间92个nt残基组成，长172nt。大ORF由L基因(P20a)、Pl结构蛋白基因、P2和P3非结构蛋白基因以及起始密码子和终止密码子组成，并以L、Pl、P2和P3的顺序依次排列，长约6.5Kb，其中基因组的3D区段是编码FMDV的RNA聚合酶的，是病毒复制中不可缺少的成分，被称为病毒感染相关抗原，它与非结构蛋白3A、3B、3C等常用来检测动物是否接触、感染过活的FMDV(龙永进等，2003)。Pl结构蛋白基因编码4种主要的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4(LoganD,Abu-GhazalehR,BlakemoreW等，1993),它们各60个组成了FMDV的外壳蛋白；VP1~VP3组成衣壳蛋白亚单位，1个蛋白亚单位构成病毒粒子20面体的一个面，VP4位于病毒颗粒的内部。衣壳蛋白VP1~VP4基因均参与抗原位点的形成。Bachrach等于1975年从口蹄疫病毒中分离出衣壳蛋白VP1，配以弗氏不完全佐剂制成一种蛋白亚单位疫苗，具有一定的免疫效果，为研制基因工程疫苗提供了依据。自此，许多科研工作者也将研究目标集中到对VP1蛋白的研究上。20世纪80年代后，国外许多学者将DNA重组技术和FMDV分子生物学的研究成果相结合，用埃希氏大肠杆菌、酵母、杆状病毒、痘病毒、哺乳动物细胞甚至植物表达系统生产口蹄疫病毒的部分结构蛋白或全部结构蛋白，研制基因工程疫苗。我国也对口蹄疫基因工程疫苗进行了深入的研究，并取得了阶段性的成果。2000年，杨志军等用大肠杆菌制备了表达含T细胞和B细胞表位抗O型FMDV的VP1的基因工程疫苗。试验表明，该疫苗能诱导豚鼠和猪产生中和抗体，具有一定的免疫效果。但是由于基因表达产物的量很有限，并且无法获得抗原的立体结构，因此难以提高免疫效力。2003年，郑兆鑫等将VP1和VP4上的T细胞表位和B细胞表位的基因串连起来研制出了针对Asia1型口蹄疫的基因工程疫苗，但是试验结果表明在强毒攻击下并不能达到100%的保护，同时作为疫苗，基因工程疫苗后期处理过于复杂，成本高，效价低。目前为止，国际上还没有一种商业化生产的基因工程多肽疫苗。化学合成多肽疫苗(syntheticp印tidevaccine)就是采用化学合成抗原多肽疫苗。这种疫苗不含核酸，是最为理想的安全性疫苗，也是目前研制预防和控制感染性疾病的疫苗的主要方向之一。研制口蹄疫合成肽疫苗的关键之处是在病毒粒子的衣壳蛋白上找到最主要的抗原决定蔟，理想的合成肽的疫苗一^:应包括抗原的B细胞位点和辅助T细胞位点。目前，抗猪O型口蹄疫病毒的合成肽疫苗已成功研制，但国际上尚无抗亚洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗，而亚洲一型口蹄疫病毒正是我国主要流行的口蹄疫病毒之一，因此研制一种效力好、安全性高、生产工艺稳定、成本低的抗亚洲一型口蹄疫病毒的合成肽疫苗已成为一项紧迫而重要的任务。
发明内容因此，本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点与不足，提供一种具有优于传统疫苗的效力，且安全性好、生产工艺稳定、成本低的基于合成肽的抗亚洲一型口^帝疫病毒疫苗。本发明的另一目的在于提供一种制备上述抗亚洲一型口蹄疫病毒疫苗的方法。实现本发明上述目的的技术方案如下一种用于亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。上述氨基酸序列中一个或者多个缬氨酸可以被正缬氨酸替代；和/或一个或者多个亮氨酸可以被正亮氨酸替代。优选地，上述氨基酸序列中全部缬氨酸被正缬氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。上述氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基可以经氧化连接在一起形成二硫键。上述氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间可以反应形成共价连接。具体来说，上述氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者羧基与羟基之间反应形成共价连才妄。本发明还提供一种亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗，其中包括一种或多种上述多肽或其多肽聚合物，例如具有SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的多肽或其多肽聚合物。该疫苗还可以包含佐剂，例如白油，优选为白油50V。本发明还提供了上述多肽的制备方法，其中包括以下步骤(1)去保护反应在体积百分比为15%-30%的六氢吡啶的N-曱基p比咯烷酮溶液中在20-28。C条件下反应25-40分钟，脱除氨基树脂或肽树脂上的9-芴曱氧羰基(Fmoc)保护基团，氮气吹干，N-曱基吡咯烷酮洗涤；(2)氨基酸的活化将合成用的带有9-芴曱氧羰基保护基团的各个氨基酸与l-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-l-羟基苯丙三唑酯；(3)合成反应使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28。C条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-曱基吡咯烷酮洗涤树脂；(4)乙酰化反应使用重量体积百分比为1.5%-4%的乙酰咪唑的N-曱基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28。C条件下反应20-40分钟，氮气吹干，曱醇洗涤树脂；(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)~(4),反应完成后，用N-曱基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；(6)多肽与树脂的分离向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0。C下反应IO分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基曱醚及二乙醚加入多肽溶液中，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；(7)环化反应将多肽溶液在室温下放置42-47小时，每小时搅拌一次；(8)超滤纯化多肽及无菌处理使用膜包在20-28。C条件下超滤多肽，使用0.2微米在线滤器除菌保存。在上述制备方法中，所述裂解试剂的组分体积比具体为三氟乙酸三异丙基硅烷乙二碌b醇苯酚水=85:8:3:3:1。此外，本发明还提供一种上述疫苗的制备方法，其中包括以下步骤(1)用注射用水将上述多肽或其多肽聚合物稀释至50吗/ml;(2)在20-28。C条件下，按照多肽或其多肽聚合物溶液佐剂=1:l的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，90-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；(3)緩慢加入多肽或其多肽聚合物溶液，搅拌20-30分钟；(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。在上述制备方法中，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。本发明还提供了上述多肽或其多肽聚合物、疫苗在制备治疗和/或预防亚洲一型口3帝疫的药物中的用途。本发明通过对国内口蹄疫流行毒抹的序列测定，研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况。针对主要变异的氨基酸位点，统计其变异的频率，同时7结合计算才几辅助方法进^f于口^帝疫抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，即根据统计的变异频率，在易变异位点上使用不同的氨基酸，得到涵盖当前所有可能变异位点的多种候选多肽抗原。进而经过大量的动物试验对这些候选多肽抗原进行筛选，得到能够引起动物的免疫反应，而且免疫反应水平高，可以很好地保护动物免受口蹄疫流行毒株的攻击的多肽抗原。本发明在此筛选结果的基础上，对口^帝疫病毒抗原位点进行了优化组合，并有效组合了T细胞表位和B细胞表位，制备了抗亚洲一型口3帝疫病毒合成肽疫苗。该疫苗可以有效应对口^帝疫病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。具体实施方式实施例1:合成肽疫苗多肽抗原的固相合成本发明的多肽抗原可以通过ABI433A全自动多肽合成仪，利用Merrifield固相合成法制备，其中采用了Fmoc修饰的氨基酸，固相载体为RinkAmideMBHA树脂。生产过程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。1、合成原料的准备合成肽疫苗多肽抗原序列如SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示。此外还包4舌如下的多肽具有将SEQIDNO:l序列中的亮氨酸和缬氨酸全部由正亮氨酸和正缬氨酸取代后的氨基酸序列的肽。具有SEQIDNO:l所示氨基酸序列的多肽的二聚体。依据上述多肽抗原序列以及lmmol的合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸，加入相应的Cartridge(装氨基酸的小瓶)中。同样按要求称量RinkAmideMBHA树脂，放入反应腔中，将上下盖子柠紧，贴标签，记录所合成的肽的名称，批号，反应腔的皮重以及所称取树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂包括N-曱基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌"定(PIP)、曱醇等并放置到对应的试剂^f瓦中。2、合成仪状态的4企测检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行RunSelfTest程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查N2是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪发送FlowRatel-18到合成仪，选择MainMenu—ModuleTest—按Prer或next找ModuleA、ModuleD、Modulel、Modulel、ModuleA)—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求。3、合成肽疫苗多肽抗原的制备(1)去保护反应在体积百分比为20%的六氬吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中在22。C条件下反应30分钟，脱除氨基树脂或肽树脂上的Fmoc保护基团，氮气吹千，NMP洗涤树脂；(2)氨基酸的活化将合成用的带有Fmoc的各个氨基酸与l-羟基苯丙三唑(HOBT)反应合成氨基酸-HOBT酯；(3)合成反应启动多肽合成仪自动合成程序，使用合成仪自动将上述氨基酸、树脂和二异丙基碳二亚胺加至反应器中，在22。C条件下反应2小时，氮气吹干，NMP洗涤树脂；(4)乙酰化反应使用2.5%重量的乙酰咪唑与步骤(3)中获得的树脂在22。C条件下反应30分钟，氮气吹干，曱醇洗涤树脂；(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复(1)(4)步，反应完成后，用NMP清洗，除去残余的氨基酸，得到干燥的多肽树脂；(6)多肽与树脂的分离.'将干燥的多肽-树脂放入玻璃容器内，将配制好的裂解试剂(三氟乙酸三异丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3:l)加入容器内，匀速搅拌3小时，将玻璃容器置于0。C下反应10分钟，取出恢复至室温，挥去三氟乙酸(TFA),将叔丁基曱醚及二乙醚加到多肽溶液中，搅拌洗涤，过滤分离出多肽溶液；(7)环化反应将多肽溶液在室温下放置45小时，每小时搅拌一次；(8)超滤纯化多肽抗原后进行无菌处理使用膜包在22。C条件下超滤多肽抗原，使用0.2微米在线滤器除菌保存。实施例2:合成肽疫苗的配制用注射用水将实施例1制备的五种多肽抗原溶液分别稀释到50吗/ml，作为水相；将SEPPICMONTANIDEISA50V油佐剂经121°C,30分钟灭菌，备用作为油相。在22。C条件下，按照抗原水相与灭菌的50V为1:1的体积比，先将油相加入乳化罐内，100转/分钟慢速搅拌2分钟，緩慢加入水相，加完后搅拌30分钟，再高速9000转/分钟搅拌20分钟，然后静置5分钟，分装后即得抗亚洲一型口蹄疫病毒的合成肽疫苗，即SEQIDNO:l多肽疫苗，SEQIDNO:2多肽疫苗，SEQIDNO:3多肽疫苗，SEQIDNO:l取代多肽疫苗和SEQIDNO:l聚合多肽疫苗。实施例3:合成肽疫苗对豚鼠的免疫效果研究将300-500g健康豚鼠随机分为七组，每组六只豚鼠，在后腿进行肌肉注射，各组注射试剂及剂量见表1。第一次免疫后四周进行第二次免疫，第二次免疫后第三周攻毒。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1、FMDV特异性抗体的检测以间接ELISA法测定血清抗体的OD492值，在96孔酶标板上以Asia1型FMDV江苏毒为包被抗原(1:IO稀释)，被检豚鼠血清为一抗，过氧化物酶标记的兔抗豚鼠IgG为二抗，在波长492nm处测定每孔的ODi"直，以空白孔调零。每组随机采血3只，以1:32稀释豚鼠血清，取每组间接ELISA方法测定结果的平均值(见表2)。表2显示，除G组外，各免疫组豚鼠的特异性抗体水平在第一次免疫后的第二周明显提高，即抗亚洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗组的特异性抗体水平在第一次免疫豚鼠后的第二周明显提高。同时，其特异性抗体水平高于灭活苗组。表2:间接ELISA检测豚鼠血清FMDV特异性抗体结果(&SE)分组a组B组C组D组e组F组G组免疫前第一周第一第二周次免第三周疫第四周第第一周次第二周免疫第三周0.2215±0.0140.3353±0.0250.5127±0.0270.5542±0扁0.9982±0.0031.5021±0.1721.8139±0.1420.9715±0.1300.1795±0.0220.3257±0.0590.6171±0.0880.6749±0.1251.0123±0.0871.5984±0.0141.8267±0.0291.0918±0.1520.2012±0.0370.3525±0.0760.6285±0.0090.6914±0.1261.1127±0.0921.6072±0.0431.8963±0.0181.1021±0.0910.2256±0.0440.3427±0.0820.6438±0.1370.6844±0,214l細9±0.1491.6125±0.0031.9247±0.0261.1035±0.1470.2179±0.1050.3354±0.1410.6392±0.1290.6793±0.1831.1027±0.1681.6219±0.0721.9139±0,1011.0986±0.1590.2327±0.0090.3498±0.1040.6255±0.1730.6907±0.1181.1106±0.0871.6078±0.1841.9834±0.0031.1062±0.1060.2435±0.0560.2534±.0.1420.3379±.0.0010.2831±0.2130.2795±0.1610.3875±0.0740.2831±0.2510.2314±.0.1672、血清中和抗体的4全测分别选用免疫前(第0天)，第一次免疫后的四周(第28天)，第二次免疫后第三周(第49天)的豚鼠血清用于微量中和试验，每组各测2只豚鼠。将生理盐水稀释的豚鼠血清灭活后，在96孔微量细胞培养板上用稀释液作一系列倍比稀释，每个稀释度作4孔，每孔加入50pl病毒液(100TCID5q),37。C温箱中和lh后每孔加入100^1细胞悬液，置于5%C02培养箱中37。C培养，自48h开始观察，至144h终判。设置阳性和阴性血清对照、病毒回归试验、血清毒性试验、正常细胞对照。按照Spearman-Karber方法，计算出能保护50%孔中的细胞不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。结果如表3所示，除G组外，在第一次免疫后各试验组均出现中和抗体，且B组、C组、D组、E组、F组的中和抗体滴度高于A组，即抗亚洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗免疫后产生的中和抗体滴度高于灭活苗产生的中和抗体滴度。ii表3:免疫豚鼠的中和抗体水平豚鼠编号A组B组C组D组E组F组G组免疫前1<0.6<0.6<0.6<0,6<0.6<0.6<0.6(第o天)2<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6第一次免疫11.61.71.61.71.71.8<0.6(第28天)21.31.51.41.51.61.7<0.6第二次免疫12.02,22.22.12.22.3<0.6(第49天)21.71.91.81.91.82,0<0.63、豚鼠T淋巴细胞增殖试验将无菌采集的"豕鼠"年脏细胞以RPMI1640培养液稀释成2x1(^个/ml置于96孔细胞培养板中，每孔加入50jul细胞悬液和50filPHA溶液(浓度50pg/ml)，设置三个重复孔作为平行，另设对照孔。培养板置于37°C、50/oC02饱和湿度条件下培养45h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10^1,继续培养3h并以10%SDS-0.01mol/lHC1溶液中止反应，」降沉淀溶解后在波长570nm处测定每孔OD值，结果以三个孔的平均值表示。将第一次免疫后第四周(第28天)、第二次免疫后第三周(第49天)釆集的豚鼠脾脏淋巴细胞用于增殖试验。结果显示除G组外，各免疫组的脾脏T淋巴细胞均出现增殖反应。4、合成肽疫苗力豕鼠攻毒试验每组取4只豚鼠，连同阴性对照组(H组)豚鼠4只，在每只豚鼠左后脚掌皮下穿刺及皮内接种0.2mlIOO倍半数感染量(ID50)的Asia1型FMDV江苏毒，接种后1周内观察发病情况。病变的严重程度分别表示为"无，，，即两只后脚掌均无病变(水泡)；"轻微"，即病变(水泡)仅发生于注射的单只后脚掌；"严重"，即两只后脚掌均出现病变(水泡)。以病变出现的严重程度作为保护效果的判定完全保护为不出现任何病变(水泡)；部分保护为病变(水泡)仅发生于注射的单只脚。保护率(％)=完全保护的豚鼠数/每组豚鼠总数x100。表4:豚鼠抗病毒能力检测<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*一只豚鼠怀孕。结果显示(表4),免疫组豚鼠的抗病毒攻击能力远大于G组和H组，其中B组、C组、D组、E组、F组豚鼠在攻毒后均未发病，其保护率分别达到100%、75%、100%、100%和100%。这说明抗亚洲一型口^帝疫病毒合成肽疫苗对于豚鼠具有很好的保护效果。实施例4:合成肽疫苗的豚鼠和小鼠安全性试验用体重350~450g的豚鼠60只，每批疫苗(按照上述实施例配制的抗亚洲一型口^帝疫病毒合成肽疫苗以及抗亚洲一型口^帝疫病毒灭活苗)注射IO只，每只皮下注射2ml;用体重18-22g的小鼠60只，每批疫苗(按照上述实施例配制的抗亚洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗以及抗亚洲一型口蹄疫病毒灭活苗)注射IO只，疫苗每只皮下注射0.5ml。连续观察7曰，判定是否出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。观察结果见表5。表5:疫苗对豚鼠与小鼠的安全性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>从本试验结果可以看出，本发明的抗亚洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗免疫豚鼠和小鼠后连续观察7日，均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。在整个试验过程中，豚鼠和小鼠均没有出现死亡现象。这说明抗亚洲一型口蹄疫病毒合成肽疫苗对于豚鼠和小鼠是安全的。<110>中牧实业股份有限公司<120>亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗<130>DIC08110082<160>3<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>57<212>PRT<213>人工序列<楊>1LysLysSerlielieAsnAsnTyrTyrMetGinGinTyrGinAsnSer151015MetLysValTyrAsnGlyLysCysThrTyrGlyGluGluSerSerArg202530ArgGlyAspLeuAlaAlaLeuAlaArgArgValSerAsnCysLeuPro354045ThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys5055<210>2<211>57<212>PRT<213>人工序列<400>2151015MetLysValTyrAsnGlyLysCysAlaTyrGlyGluValThrThrArg202530354045ThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys5055<210>3<211>57<212>PRT<213>人工序列<400>317LysLysSerlielieAsnAsnTyrTyrMetGinGin丁yrGinAsnSer151015MetLysValTyrAsnGlyLysCysAlaTyrGlyGluGluThrThrArg202530ArgGlyAspLeuAlaAlaLeuAlaArgLysValSerAsnCysLeuPro354045ThrSerPheAsnTyrGlyAlaValLys505权利要求1.一种用于亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO3所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中一个或者多个缬氨酸被正缬氨酸替代；和/或一个或者多个亮氨酸被正亮氨酸替代。3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中全部缬氨酸被正缬氨酸替代；和/或全部亮氨酸被正亮氨酸替代。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列中的两个半胱氨酸的巯基经氧化连接在一起形成二硫键。5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列的首尾氨基酸残基之间反应形成共价连接。6.根据权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸序列的首尾氨基酸残基的羧基与氨基、或者羧基与轻基之间反应形成共价连接。7.—种亚洲一型口i帝疫合成肽疫苗，其中包括一种或多种权利要求1至6中任一项所述的多肽或其多肽聚合物。8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐剂。9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为白油，优选为白油50V。10.—种根据权利要求1至6中任一项所述的多肽的制备方法，其中包括以下步骤(1)去保护反应在体积百分比为15%-30%的六氢吡啶的N-曱基吡咯烷酮溶液中在20-28。C条件下反应25-40分钟，脱除氨基树脂上的9-芴曱氧羰基保护基团，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤；(2)氨基酸的活化将合成用的带有9-芴曱氧羰基保护基团的各个氨基酸与l-羟基苯丙三唑反应合成氨基酸-l-羟基苯丙三唑酯；(3)合成反应使用多肽合成仪将上述各种氨基酸和树脂以及二异丙基碳二亚胺自动加至反应器中，在20-28。C条件下反应0.5-2.5小时，氮气吹干，N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂；(4)乙酰化反应z使用重量体积百分比为1.5%-4%的乙酰咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液与步骤(3)中获得的树脂在20-28。C条件下反应20-40分钟，氮气吹干，曱醇洗涤树脂；(5)合成过程由C端至N端，依照氨基酸序列不断的重复步骤(1)(4),反应完成后，用N-曱基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽树脂；(6)多肽与树脂的分离向干燥的多肽树脂中加入裂解试剂，匀速搅拌1-4小时后置于0。C下反应IO分钟，恢复至室温，挥去三氟乙酸，将叔丁基曱醚及二乙醚加入多肽溶液，搅拌洗涤，过滤得多肽溶液；(7)环化反应将多肽溶液在室温下放置42-47小时，每小时搅拌一次；(8)超滤纯化多肽及无菌处理使用膜包在20-28。C条件下超滤多肽，使用0.2微米在线滤器除菌保存。11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述裂解试剂的组分体积比为三氟乙酸三异丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3r1。12.—种根据权利要求7至9中任一项所述的疫苗的制备方法，其中包括以下步骤(1)用注射用水将多肽或其多肽聚合物稀释至50(ig/ml;(2)在20-28。C条件下，按照多肽或其多肽聚合物溶液佐剂=1:1的体积比，先将佐剂加入乳化罐内，卯-150转/分钟慢速搅拌1.5-3分钟；(3)緩慢加入多肽或其多肽聚合物溶液，搅拌20-30分钟；(4)高速搅拌15-30分钟后静置5分钟，分装后即得。13.根据权利要求12所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述高速搅拌为8000-10000转/分钟。14.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽或其多肽聚合物、权利要求7至9中任一项所述的疫苗在制备治疗和/或预防亚洲一型口蹄疫的药物中的用途。全文摘要本发明提供一种亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗，具体涉及一种用于亚洲一型口蹄疫合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有该多肽或其多肽聚合物的疫苗及它们的制备方法。上述多肽具有SEQIDNo1、SEQIDNo2或SEQIDNo3所示的氨基酸序列。本发明通过对国内口蹄疫流行毒株的序列测定，研究口蹄疫主要抗原位点的变异情况，同时结合计算机辅助方法进行口蹄疫抗原位点的分析预测，对可能的抗原位点肽段进行化学合成，进而经过大量的动物试验对候选多肽抗原进行筛选，得到免疫反应水平高，可以很好地保护动物免受口蹄疫流行毒株的攻击的多肽抗原。由其制成的疫苗可以有效应对口蹄疫病毒的抗原变异，也不存在生物安全性问题，易于大规模合成，具有良好的应用前景。文档编号C07K14/00GK101659696SQ200810118968公开日2010年3月3日申请日期2008年8月27日优先权日2008年8月27日发明者巴利民,李丙首,栗利芳,进肖,郭丽清,鹏齐申请人:中牧实业股份有限公司