一种口蹄疫疫苗宿主细胞dna残留量的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DNA残留量的定量检测方法，特别涉及一种口蹄疫疫苗宿主细胞 DNA残留量的定量检测方法，属于兽用生物制品检测领域。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒（FMDV)引起偶蹄类动物 感染的一种急性、烈性、接触性传染病，主要危害猪、牛、羊等70种家畜和野生动物，人也易 感，对畜牧业危害极大。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性瘆。
[0003] 口蹄疫病毒（FMDV)被认为是最重要的经济兽医病原，是因为其高度传染性的性 质和该病毒已对禽畜业造成的破坏性影响。根据它的特点，口蹄疫被国际兽疫局（0IE)定 为一类传染病，中国农业部也将其列为一类传染病。随着世界经济的发展，各国间的相互交 流日益频繁，现代运输快速发展，这都增加了 口蹄疫预防的难度和复杂度。因此对口蹄疫疫 苗质量要求越来越高，致使用以衡量疫苗质量。
[0004] 根据WHO有关规程规定，用传代细胞系制造的疫苗或疫苗毒种在传代历史中曾经 用过传代细胞系者，其外源DNA污染最低量应低于100pg/剂量。BHK21细胞是目前研制口 蹄疫疫苗的较理想的候选株，为了安全起见，需对口蹄疫疫苗宿主细胞BHK21细胞残余DNA 含量进行检测。近年来，分子生物学的发展推动了诊断技术的进步，核酸探针由于其高度的 特异性和敏感性而备受人们的青睐，尤其对病毒和细菌病的诊断检测，使其具有诱人前景。 用特异性核酸探针做斑点分子杂交，其特异性较稳定，其检测灵敏度可达lpg的同源核酸。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种简单、准确地检测口蹄疫疫苗宿主细胞DNA残留量的 方法，用以衡量疫苗质量及安全性。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：
[0007] -种口蹄疫疫苗宿主细胞DNA残留量的定量检测方法，其特征在于，采用核酸探 针斑点杂交法对BHK21细胞DNA标准品和待测样品中BHK21细胞DNA进行显影，得到两者 的斑点印迹，然后对BHK21细胞DNA标准品的斑点印迹进行分析，根据分析结果对待测样品 中BHK21细胞DNA残留量进行对比定量和精确定量。
[0008] 在本发明中，优选的，采用地高辛随机引物法标记BHK21细胞基因组制成探针。 [0009] 在本发明中，优选的，待测样品无需进行DNA的提取和纯化，直接点在NC膜上进行 烘烤固定。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的对比定量为根据待测样品中BHK21细胞DNA的斑点印 迹对比标准比色条去确定待测样品中BHK21细胞DNA残留量范围；其中，所述的标准比色条 为不同浓度的BHK21细胞DNA标准品的斑点印迹。
[0011] 在本发明中，优选的，所述的精确定量为应用Quantity One软件分析BHK21细胞 DNA标准品斑点印迹积分光密度值，从而得到表示BHK21细胞DNA浓度与其斑点印迹积分光 密度值关系的标准方程，将待测样品中BHK21细胞DNA斑点印迹积分光密度值代入标准方 程，即可得到待测样品中BHK21细胞DNA残留量。
[0012] 在本发明中，优选的，所述的采用地高辛随机引物法标记BHK21细胞基因组制成 探针的具体步骤为：
[0013] (1)、BHK21细胞DNA标准品模板应用超声破碎DNA，超声强度为40%，时间为10分 钟，然后用高压蒸馏水稀释到lug/16ul;
[0014] (2)、BHK21细胞DNA标准品模板120°C加热变性lOmin，迅速冰浴；
[0015](3)、混合地高辛随机引物4ul加入经变性的BHK21细胞DNA标准品模板中，充分 混合并且瞬时离心，37°C孵育20小时；
[0016] (4)、65°C孵育 lOmin，终止反应。
[0017] 在本发明中，优选的，所述的采用核酸探针斑点杂交法对BHK21细胞DNA标准品和 待测样品中BHK21细胞DNA进行显影的具体步骤为：
[0018] (1)样品固定
[0019] 用2 X SSC缓冲液简单洗NC膜1次，吸取待测样品3ul点膜，同时吸取BHK21细胞 DNA标准品3ul与待测样品并列点膜，将膜120°C烘烤30min取出；
[0020] (2)杂交检测
[0021] ①DIG Easy Hyb缓冲液预热到杂交温度，将DNA固定后的膜放入预杂交缓冲液， 在适当的容器中温和振荡30分钟，进行预杂交；
[0022] ②地高辛标记的DNA探针，将探针放入沸水浴中变性，5分钟后立即置于冰上或冰 水浴中冷却；
[0023] ③将变性的地高辛标记探针加入到预热的DIG Easy Hyb缓冲液中，充分混匀；
[0024] ④倒出预杂交液，在膜上加入探针杂交液，37°C下温和振荡孵育至过夜；
[0025](3)免疫检测
[0026] ①用SSC液严谨洗涤后，将膜简单地用洗涤缓冲液漂洗1~5分钟；
[0027] ②在100ml封闭溶液工作液中孵育30分钟；
[0028] ③在50ml抗体溶液工作液中孵育30分钟；
[0029] ④用100ml洗涤缓冲液洗涤2次，每次15分钟；
[0030] ⑤在100ml检测缓冲液中平衡2~5分钟；
[0031] (4)显影
[0032] 将含DNA样品的膜面朝上，置于折叠夹中，向膜上滴加lml CDP-star，ready-to-use，使CDP-star均匀浸润膜，立即盖上封盖并防止气泡的产生，使底 物在膜上的分布更加均匀。擦去溢出折叠夹或杂交袋的多余液体，15~25°C孵育5min。在 15~25°C条件下，用X光片曝光15~25分钟，得到两者的斑点印迹。
[0033] 随机引物标记法是以六聚寡核苷酸为引物，待标记的DNA为模板，在DNA聚合酶 Klenow片段作用下，将DIG-11-dUTP掺入到新合成的DNA链中，适用于100bp~2Kb的DNA 探针的标记。随机序列的六脱氧核苷酸沿DNA的多个位点与热变性的单链模板杂交。这些 寡核苷酸在随后的聚合反应中作为3'-羟基引物，在加入Klenow聚合酶和所有4种核苷 酸（含Digoxigenin-11-dUTP)后，探针合成开始，在Klenow聚合酶催化下，加入的核苷酸 底物沿5' -3'聚合延伸，生成高效标记的探针。该法一般可允许10ng~3yg范围内探 针有效地标记。每20~25个核苷酸中带有一个Digoxigenin-11-dUTP。标记效率高，且模 板DNA片段的大小不影响标记结果。
[0034] 本发明中的待测样品无需进行DNA的提取和纯化，直接点在NC膜上进行烘烤固 定，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，再按常规方法进行 杂交与检测，可以同时检测大量待测样品。
[0035] 本发明应用比色条进行DNA残留量区间估算，可以根据实验得到的斑点印迹，对 比标准品比色条确定待测样品中BHK21细胞DNA残留量范围。
[0036] 在本发明的一个具体实施例中，本发明应用Quantity One软件分析斑点印迹的积 分光密度值，利用标准方程计算待测样品中BHK21细胞DNA残留量。应用Quantity One软 件得到4个BHK21细胞DNA标准品浓度（60ug/ml、50ug/ml、40ug/ml或30ug/ml)所对应的 积分光密度值，依照得到的4个积分光密度值确立标准曲线建立方程。
[0037] BHK21细胞DNA标准品浓度与积分光密度值的对应关系如下：
【主权项】
1. 一种口蹄疫疫苗宿主细胞DNA残留量的定量检测方法，其特征在于，采用核酸探针 斑点杂交法对BHK21细胞DNA标准品和待测样品中BHK21细胞DNA进行显影，得到两者的 斑点印迹，然后对BHK21细胞DNA标准品的斑点印迹进行分析，根据分析结果对待测样品中 BHK21细胞DNA残留量进行对比定量和精确定量。
2. 根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，采用地高辛随机引物法标记 BHK21细胞基因组制成探针。
3. 根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，待测样品无需进行DNA的提取和 纯化，直接点在NC膜上进行烘烤固定。
4. 根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述的对比定量为根据待测样 品中BHK21细胞DNA的斑点印迹对比标准比色条去确定待测样品中BHK21细胞DNA残留量 范围；其中，所述的标准比色条为不同浓度的BHK21细胞DNA标准品的斑点印迹。
5. 根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述的精确定量为应用 QuantityOne软件分析BHK21细胞DNA标准品斑点印迹积分光密度值，从而得到表示BHK21 细胞DNA浓度与其斑点印迹积分光密度值关系的标准方程，将待测样品中BHK21细胞DNA 斑点印迹积分光密度值代入标准方程，即可得到待测样品中BHK21细胞DNA残留量。
6. 根据权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于，所述的采用地高辛随机引物法 标记BHK21细胞基因组制成探针的具体步骤为： (1) 、BHK21细胞DNA标准品模板应用超声破碎DNA，超声强度为40%，时间为10分钟， 然后用高压蒸馏水稀释到lug/16ul; (2) 、BHK21细胞DNA标准品模板120°C加热变性lOmin，迅速冰浴； (3) 、混合地高辛随机引物4ul加入经变性的BHK21细胞DNA标准品模板中，充分混合 并且瞬时离心，37°C孵育20小时； (4) 、65°C孵育lOmin，终止反应。
7. 根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述的采用核酸探针斑点杂交 法对BHK21细胞DNA标准品和待测样品中BHK21细胞DNA进行显影的具体步骤为： (1) 样品固定 用2XSSC缓冲液简单洗NC膜1次，吸取待测样品3ul点膜，同时吸取BHK21细胞DNA标准品3ul与待测样品并列点膜，将膜120°C烘烤30min取出； (2) 杂交检测 ①DIGEasyHyb缓冲液预热到杂交温度，将DNA固定后的膜放入预杂交缓冲液，在适 当的容器中温和振荡30分钟，进行预杂交； ② 地高辛标记的DNA探针，将探针放入沸水浴中变性，5分钟后立即置于冰上或冰水浴 中冷却； ③ 将变性的地高辛标记探针加入到预热的DIGEasyHyb缓冲液中，充分混匀； ④ 倒出预杂交液，在膜上加入探针杂交液，37°C下温和振荡孵育至过夜； (3) 免疫检测 ① 用SSC液严谨洗涤后，将膜简单地用洗涤缓冲液漂洗1~5分钟； ② 在100mL封闭溶液工作液中孵育30分钟； ③ 在50ml抗体溶液工作液中孵育30分钟； ④ 用100mL洗涤缓冲液洗涤2次，每次15分钟； ⑤ 在100mL检测缓冲液中平衡2~5分钟； (4)显影 将含DNA样品的膜面朝上，置于折叠夹中，向膜上滴加ImlQ)P-star，ready-t〇-use， 使CDP-star均匀浸润膜，立即盖上封盖并防止气泡的产生，使底物在膜上的分布更加均 匀。擦去溢出折叠夹或杂交袋的多余液体，15~25°C孵育5min。在15~25°C条件下，用 X光片曝光15~25分钟，得到两者的斑点印迹。
【专利摘要】本发明公开了一种口蹄疫疫苗宿主细胞DNA残留量的定量检测方法，采用核酸探针斑点杂交法对BHK21细胞DNA标准品和待测样品中BHK21细胞DNA进行显影，得到两者的斑点印迹，然后对BHK21细胞DNA标准品的斑点印迹进行分析，根据分析结果对待测样品中BHK21细胞DNA残留量进行对比定量和精确定量。本发明采用地高辛随机引物法直接标记BHK21细胞基因组制成探针并且待测样品直接点NC膜固定无需进行DNA的提取和纯化，此方法更适合细胞侵染扩增病毒后的细胞中DNA检测，较针对部分基因的探针的检测结果更准确、更简单。同时本发明实现了对口蹄疫疫苗宿主细胞BHK21细胞中DNA残留量的定量检测，可以用于衡量疫苗质量及安全性。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104694640
【申请号】CN201510080925
【发明人】赵宏凯, 赵炳武, 武俊兰, 王永伟, 张澍, 何召庆, 吕宏亮, 刘金萍
【申请人】内蒙古必威安泰生物科技有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月15日