用于多重连接扩增技术的探针制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物技术领域，特别是涉及寡核苷酸探针制备，具体地为可用于多重连 接扩增技术（MLPA)的长探针的制备方法。
【背景技术】
[0002] 多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)于2002年由Schouten等首先报道，是近几年发展起来的一种针对待 检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45 个核苷酸序列拷贝数的改变。目前MLPA技术已经应用于多个领域、多种疾病的研究及基因 诊断，并且不断的有新的技术改进。
[0003] 中国专利申请200910108977. 4公开了一种采用PCR方法结合亲和素磁殊法制备 可用于多重连接扩增技术的长探针，该公开的技术方法主要包括：针对目标核苷酸序列和 用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计一对PCR扩增引物，分别为 通用引物和检测引物；通用引物的5'端标记生物素；以所述与待检测靶片段无关的模板核 苷酸序列为模板进行PCR扩增，获得生物素标记的双链核苷酸序列；将生物素标记的双链 核苷酸序列与链霉素素标记的亲和素磁珠混合，使生物素标记的双链核苷酸序列与链霉亲 和素磁珠特异性结合；使生物素标记的的双链核苷酸序列变性，解链形成单链；离心取上 清，获得非生物素标记的单链核苷酸序列。该方法虽然操作简单，但是在磁珠分离过程中不 可避免地会因磁珠结合不完全造成上清中的双链核苷酸残留，影响探针得率。
[0004] 在中国专利申请201210008247. 9中公开了一种采用PCR方法结合入外切酶酶切 制备可用于多重连接扩增技术的长探针，该公开的技术方法主要包括：设计一对与待测靶 片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GP1 (5'端带荧光基团修饰）和GP2,用 于最后的PCR扩增检测，同时合成5'端带磷酸化修饰的右探针RP0-N，由目的右探针序列 与GP2的反向互补序列组成；确定一段与探针及通用引物无关的核苷酸序列S，并用于设计 一对扩增左端长探针的引物，分别为GPL和LP0-N'，其中GPL是由GP1的序列与S序列的前 18bp左右的序列组成，LP0-N'由目的左探针序列的反向互补序列与S序列中的18bp左右 反向互补的序列组成，并且其5'端要带上磷酸化修饰；用GPL和LPN以所述的一段与探针 及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5'端磷酸化修饰的双链核苷 酸序列；纯化回收PCR产物；采用核酸Lamda外切酶对以上双链核苷酸序列进行消化，去除 5'磷酸化标记的那条单链DNA ;采用ssDNA纯化回收试剂盒对消化产物进行回收，便得到左 端长探针。该方法虽然成本低廉，但是混合酶切，容易造成双链核苷酸残留，导致探针得率 不商。
【发明内容】
[0005] 所要解决的技术问题
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种低成本、高得率的可用于多重连接扩增技 术的长探针制备方法，以克服现有技术在磁珠分离过程中由磁珠结合不完全造成双链核苷 酸残留，探针得率不高的缺陷。
[0007] 技术方案
[0008] 本发明的技术方案之一是提供用于多重连接扩增技术的探针制备方法，包括以下 步骤：
[0009] 1)设计一对与待测目的基因及长探针核苷酸序列无关的通用检测引物，分别为上 游引物CF和下游引物CR;
[0010] 2)合成左侧短探针S，5'到3'序列分别由所述上游引物CF序列与目的片段左侧 序列TF组成；
[0011] 3)确定一段与目的基因及通用引物无关的核苷酸序列T，设计一对扩增右侧长探 针的引物，分别为LF和LR，其中LF的5'到3'序列分别是由目的片段右侧序列TR与所述 T序列5'端的10-25bp碱基组成，LR的5'到3'序列分别由下游引物CR序列与所述T序 列3'端的10-25bp碱基的反向互补序列组成，并且LF引物的5'端用生物素标记，LR引物 的5'端憐酸化；
[0012] 4)利用上述引物LF和LR，以所述的核苷酸序列T为模板进行PCR扩增，获得5' 端生物素标记的正义链以及5'端磷酸化标记的互补链形成的双链核苷酸序列；
[0013] 5)将纯化后的上述双链核苷酸序列与链霉亲和素磁珠混合孵育，使5'端标记生 物素的双链核苷酸与磁珠特异性结合；
[0014] 6)利用外切酶对5'端标记磷酸化的互补链DNA进行酶切；纯化回收5'端标记生 物素的正义链DNA，即目的片段的右侧长探针；
[0015] 或者，上述的步骤2)~4)由下列步骤2'）~4'）替代，以获得目的片段的左侧 长探针：
[0016] 2'）合成右侧短探针Z，5'到3'序列分别由所述目的片段右侧序列TR与下游引 物CR的反向互补序列组成；
[0017] 3'）确定一段与目的基因及通用引物无关的核苷酸序列T，用于设计一对扩增左 侧长探针的引物，分别为LF'和LR'，其中LF'的5'到3'序列分别是由上游引物CF序列与 所述T序列5'端10-25bp碱基组成，LR'的5'到3'序列分别由目的片段左侧序列TF的 反向互补序列与所述T序列3'端10-25bp的反向互补序列组成，并且LF'引物的5'端标 记生物素，LR'引物的5'端标记磷酸化；
[0018] 4'）利用上述引物LF'和LR'，以所述的核苷酸序列T为模板进行PCR扩增，获得 5'端生物素标记的正义链以及5'端磷酸化标记的互补链形成的双链核苷酸序列。
[0019] 上述的探针制备方法的优选方案之一为，使用获得的右侧长探针与人工合成的左 侧短探针进行MLPA验证；或者，使用获得的左侧长探针与人工合成的右侧短探针进行MLPA 验证。
[0020] 上述的探针制备方法的优选方案之二为，所述的右侧长探针的5'到3'序列依此 包含TR、T和CR反向互补序列；所述的左侧长探针的5'到3'序列依此包含CF正向序列、 T和TF;右侧长探针的TR序列、或者左侧长探针的TF序列的设计中引入了目的片段的中存 在的核苷酸突变、缺失或者重复位点。
[0021] 上述的探针制备方法的优选方案之三为，步骤1)所述通用检测引物是一对与人 类基因组、长探针核苷酸序列及待测目的基因无关的序列。
[0022] 上述的探针制备方法的优选方案之四为，步骤2)所述短探针为人工合成。
[0023] 上述的探针制备方法的优选方案之五为，步骤3)或步骤3'）所述的一段与目的基 因及通用引物无关的核苷酸序列T为长探针的可变序列，位于目的片段与通用引物之间， 可获得不同长度的探针链；步骤3)所述的引物LF和LR、以及步骤3'）所述的引物LF'和 LR'均由根据目的片段序列设计的5'端或3'端和根据所述序列T设计的5'端或3'端组 成。
[0024] 上述的探针制备方法的优选方案之六为，步骤4)或者4'）获得的双链核苷酸序列 经过纯化后再与链霉亲和素磁珠进行混合孵育。
[0025] 上述的探针制备方法的优选方案之七为，步骤5)所述每1份重量份生物素标记的 双链核苷酸与1-30份重量份的链霉亲和素磁珠混合，混合后需要回收孵育液进行电泳检 测以确认孵育完全并且无双链核苷酸序列残留。
[0026] 上述的探针制备方法的优选方案之八为，步骤6)所述的外切酶为A噬菌体核酸 外切酶，酶切反应中需要回收酶切液进行电泳检测以确认酶切完全并且无双链核苷酸序列 残留；步骤5)及步骤6)回收纯化磁珠后需进行PCR验证以确认完全结合。
[0027] 本发明的技术方案之二是提供一种用于上述技术方案之一制备方法的试剂盒。
[0028] 有益效果
[0029] 本发明所的探针制备方法与现有技术相比，具有以下优点：
[0030] 1)PCR扩增引物简单，通过结合目标序列，针对模版T设计一对引物即可。
[0031] 2)利用简单的PCR和链霉亲和素磁珠亲和纯化以及A噬菌体核酸外切酶消化酶 切即可获得长探针，可4小时内快速制备大量长探针，大大降低了 MLPA技术门槛。
[0032] 3)无需进行克隆制备，无需序列特异性酶切，操作简单。
[0033] 4)探针制备灵活性更强，可针对基因组DNA、质粒、人工基因序列等制备所需探 针。
[0034] 5)探针所需的序列来源方便，可使不同探针的填充T序列保持一致，也可根据需 要选择不同模版扩增所需序列，降低杂交时的非特异性杂交，提高检测成功率。
【附图说明】
[0035] 图1本发明的方法流程图。
[0036] 图2琼脂糖电泳图。
[0037] 图3A本发明实施例中的链霉亲和素磁珠孵育后回收孵育液的琼脂糖电泳图；
[0038] 图3B本发明实施例中的A噬菌体核酸外切酶酶切反应后回收酶切液的琼脂糖电 泳图；
[0039] 图4本发明实施例中的MLPA琼脂糖凝胶电泳分析结果图。
[0040] 图5-图9本发明实施例中的琼脂糖凝胶电泳分析结果图。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0042] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作 手册，或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自国药试剂有限公 司，细菌DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，A噬菌体核酸外切酶购自纽 英伦生物技术有限公司、高保真酶套装购自纽英伦生物技术有限公司，链霉亲和素磁珠购 自英俊生物技术有限公司，引物和