一种利用锁式探针滚环扩增的snp分型检测方法
【专利说明】一种利用锁式探针滚环扩増的SNP分型检测方法 【技术领域】
[0001] 本发明属于生物领域的一种检测方法，具体涉及一种利用锁式探针滚环扩增的 SNP分型检测方法。 【【背景技术】】
[0002]作为第三代DNA遗传标记，单核苷酸多态性(SNP)具有分布广、数量大、易于检测和 在基因组中相对稳定的特点，其不同基因型与个人及群体对很多重要生理现象及其发展进 程有很大相关性。对SNP的基因型进行检测是现代分子生物学重点发展方向，也是现代分子 病理学的研究方向之一，已成为相关研究领域中的热点。
[0003]目前常用的对SNP检测方法多采用先提取相关基因组，然后以PCR技术为基础进行 基因扩增，再联合其他检测方法如DNA测序，内切酶酶切等进行。这些方法虽然能够获取相 关SNP基因型信息，但是操作繁琐、成本高，而SNP的分子生物学特征又决定了只有获取大量 SNP位点信息时才能对重要生理和病理活动进行分子生物学和分子病理学意义上的研究和 预测;在大样本情况下，对血液样品进行基因组提取，不仅进一步增加了操作的繁琐程度、 耗时费力，而且又增加了样品间交叉污染的可能性，同时也增加了操作人员的感染风险。因 此，目前有关SNP的相关性研究多在相关实验室进行，这极大地限制了SNP在分子生物学中 的研究，而针对SNP的研究要进一步发展，最终要在医疗领域起到作用，则需要开发一种快 速、简易、准确、经济的SNP检测方法以推进基因检测和分型的研究与发展。
[0004]锁式探针-滚环扩增(RCA)技术利用锁式探针特异地与待测基因组靶基因序列结 合，在DNA连接酶的作用下成环，然后再以成环产物为模板进行滚环扩增，最后检测是否有 滚环扩增产物，从而研究待测基因组的特征。锁式探针-RCA技术具有准确性好、灵敏度高、 操作方便等特点，在分子生物学领域如植物病毒分型检测、基因多态性或突变中已经得到 了应用，目前也有人尝试在SNP检测中进行应用，但还未见相关文献报道。
[0005]外周血成分复杂，各种酶类、蛋白质、血红素等的影响，造成基因组的暴露不完全 或成环反应被抑制，扩增效率不好等，特别是锁式探针-RCA技术体系，都是以提纯的基因组 为模板，因此当前基于滚环扩增的检测不仅操作繁琐、工作量大、成本高、易造成样本间交 叉污染，还会增加操作者感染几率；因此，目前还没有锁式探针-滚环扩增体系直接针对外 周血样品进行检测的研究报道。 【
【发明内容】
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[0006]本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用锁式探针滚环扩增的SNP分型检测 方法。
[0007]本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种利用锁式探针滚环扩增的 SNP分型检测方法，包括如下具体操作步骤：
[0008] (1)锁式探针与扩增引物的设计：从g e n e b a n k数据库获取E R A P1的S N P位点 (rs27044)的所有参考基因型，并获取每个位点上下游各500bp的基因序列，用primer 5.0 软件设计出两等位基因特异性锁式探针与两扩增引物；
[0009] (2)锁式探针磷酸化:对设计所得的等位基因特异性锁式探针的5'端进行磷酸化 反应，具体地，分别取0.lymol等位基因特异性锁式探针加入到10yLT4磷酸化激酶反应缓 冲液中：往反应体系中加入ImMdATP、2.0U的T4多核苷酸激酶，37°C孵育30分钟;得磷酸化 后的锁式探针；
[0010] (3)锁式探针成环反应:取ΙΟμΜ待检测样品即外周血样或者预提纯得到基因组样 品lyL，加入浓度为ΙΟμΜ的上述磷酸化后的锁式探针0.5yL，并加入lyL10XTaqDNA连接酶 缓冲液、〇. 2mg/ml的BSA、13 %甘油、调整Mg2+浓度为10Mm，PH值为9.3，再加入6.5yL的无菌 双蒸水，接着加入l〇yL的矿物油封闭，95°C5min，室温10min;然后加入40U/yL的TaqDNA连 接酶0.5以1^，95°〇511^11，45°〇4小时成环反应;最后95°(3灭活151^11 ;
[0011] (4)酶切反应:在上述成环反应液中加入l.lyLΙΟΧΕχοIII缓冲液，然后再加入 0.4yLlOU/yL的核酸外切酶I和0.2yLlOOU/yL的核酸外切酶III;于37°C孵育lh，85°C孵育 30min灭活核酸外切酶；
[0012] (5)滚环扩增反应:取上述酶切后的成环反应产物3yL，加入两扩增引物各0.5yL， 接着加入1此1〇XThermoPolReactionBuffer、3.9yL的无菌双蒸水，之后加入10yL的矿物 油封闭，95°C5min，室温 10min，然后于反应液中加入20xBSAlyL、10mMdNTPs0.8yL、8U/yL BstDNA聚合酶0.3yL，并于65°C反应2h;
[0013](6)SNP分型检定:取上述滚环扩增反应所得的反应物并进行1%琼脂糖凝胶电泳 检测，通过电泳检测结果即可判定SNP的基因型。
[0014]进一步地，所述lOXTaq DNA连接酶缓冲液的组分为：200mM Tris-HCl、250mM KAc、100mM Mg(Ac)2、100mM DTT、10mM NAD、0.1%Triton X-100、pH7.6。
[0015]进一步地，所述lOXExoIII缓冲液，缓冲液由500mMpH为8.0的Tris-HCl，50mM MgCl2，100mM疏基乙醇组成，
[0016]进一步地，所述lOXThermoPol Reaction Buffer的组分为：200mM pH为8.8的 Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2S〇4、20mM MgS〇4、0.1%Triton X-100。
[0017]进一步地，所述T4磷酸化激酶反应缓冲液的组分为：70mMpH为7.6的Tris-HCl、 10mMMgCl2、5mMDTT。
[0018]本发明的有益效果在于:建立了一种利用锁式探针滚环扩增的SNP分型检测方法， 其能够直接针对外周血等生物样品进行SNP分型检测，省去了基因组的提取过程，不仅大大 缩短了操作步骤和检测时间，节省了成本、降低了操作人员交叉感染的风险，具有很大的推 广前景，而且检测结果准确、灵敏。 【【附图说明】】
[0019]下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0020] 图1是本发明SNP分型检测方法的原理图；
[0021]图2是本发明中实施例2样品I提纯组DNA的SNP位点（rs27044)基因型时检测时的 1 %琼脂糖凝胶电泳图；
[0022]图3是本发明中实施例2样品Π提纯组DNA的SNP位点（rs27044)基因型时检测时 的1 %琼脂糖凝胶电泳图；
[0023]图4是本发明中实施例3外周血样品I和Π检测时的1 %琼脂糖凝胶电泳图，其中G1、C1泳道为样品I检测结果，G2、C2为样品2检测结果。 【【具体实施方式】】
[0024]请参阅图1，本发明一种利用锁式探针滚环扩增的SNP分型检测方法的具体操作请 详细参照如下实施例1。
[0025] 实施例1
[0026] 一、锁式探针与扩增引物的设计
[0027] 从genebank数据库获取ERAP1基因上SNP位点（rs27044)所有参考基因型，并获取 此单核苷酸多态性位点上下游各500bp的基因序列，用primer5.0软件设计出两等位基因 特异性锁式探针(为了简化描述，后续直接简称为锁式探针)与两扩增引物。其中：
[0028] 检测rs27044位点：两锁式探针（如SEQIDN0: 1、2所示）：卩^-15'-TGAGGCGTCGTAAGCCATAAGTAGGATAGGACAGGAAAGAAACGCTCCTCATCATCAAG-3 '，Pro-25 '-TGAGGCGTCGTAAGCCATAAGTAGGATAGGACAGGAAAGAAACGCTCCTCATCATCAAC-3 '；两扩增引物(如 SEQIDN0:3、4所示）：第一引物5'-CTTTCCTGTCCTATCCTACTTATG-3'，第二引物5'-CTCCTCATCATCAACTG-3'；
[0029] 二、锁式探针磷酸化
[0030] 对设计所得的等位基因特异性锁式探针的5'端进行磷酸化反应，具体地，分别取 0.Ιμπιο?等位基因特异性锁式探针加入到10yLT4磷酸化激酶反应缓冲液中：往反应体系中 加入ImMdATP、2.0U的T4多核苷酸激酶，37°C孵育30分钟;得磷酸化后的锁式探针。
[0031] 三、锁式探针成环反应
[0032] 取ΙΟμΜ待检测样品即外周血样lyL，加入浓度为ΙΟμΜ的上述磷酸化后的