基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因进行电化学检测的方法，在洗净的金电极上滴加适体片段Co3S，冰箱中过夜后取出封闭，在金电极上滴加适体片段Co3B和待测样品，37℃下反应完后，再滴加链酶亲和素溶液温育，然后加入环化DNA溶液温育，滚环扩增，加入检测探针杂交，进行DPV信号检测。本发明首次利用滚环扩增与超分子适体对可卡因进行电化学检测，极大提高了可卡因检测的灵敏度和特异性，使得检测的线性范围达到10～500nM。使用相同体积和相同浓度的链酶亲和素溶液和环化DNA，将识别元件和放大元件分开，仅利用其桥接作用，减少了空白信号，极大提高了检测的灵敏度和线性范围。
【专利说明】基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种可卡因的检测方法，尤其涉及一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因进行电化学检测的方法，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]可卡因(cocaine)是古柯叶中所含的主要生物碱，又名古柯碱。古柯叶中有很多生物碱，主要有可卡因、芽子碱(ecgonine)、苯甲酰芽子碱、肉桂酸可卡因和N-甲醛可卡因等物质，对中枢神经系统有严重的毒害作用。目前对可卡因检测的方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、薄层色谱法(TLC)、电子鼻、电子俘获、显微拉曼技术(MRS, micro raman spectroscopy)、X射线探测技术和热中子断层扫描等。这些技术的检测灵敏度高，但检测步骤繁琐、设备昂贵，测试程序复杂、耗时，成本较高，需要专业技术人才，不适合现场快速筛查使用。针对缉毒工作的实际需求，需要开发灵敏度高、选择性好、便携式、能耗低和易操作的智能化毒品快速检测产品，以达到灵敏和快速的检测目的。目前国内外对吸毒人员快速现场筛查和液体中毒品检测的主要技术是各种基于免疫反应的产品，主要有酶免疫分析和免疫胶体金技术。前者涉及酶反应，检测步骤繁琐，试剂稳定性差，通常不能长时间保存。后者简便，快速，但误判率高，灵敏度较低，只能进行定性测试，难以进行质量控制，即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此，一般只能用于定性试验，不能进行定量分析。
[0003]滚环扩增技术(RCA)是一种在恒温下直接扩增环状单链DNA的方法。不仅能实现靶序列的信号放大，而且扩增是在等温下实现的，反应条件温和，其灵敏度可达到I个拷贝的核酸分子。RCA技术的优势是:高灵敏度、高特异性、简单、易操作、多元性、高通量。
[0004]适配体(Aptamer)是从IO15的随机序列的DNA或RNA库中通过指数富集的系统分子进化方法(简称SELEX)筛选出来的，能够特异性地与靶标分子结合，从而特异性地识别靶标分子。适配体可以用于包括蛋白质、小分子、重金属离子、细胞和病毒等的各种各样的生物分子的检测。与传统的抗体相比，适配体在多个方面具有显著的优越性。适配体稳定性高、价格低廉、不同批次产品质量完全相同，而且具有与抗体相当甚至更好的专一性和亲和性。目前利用适配体进行可卡因检测的方法，主要是使用一段适配体，或使用将一段分开成两段的适配体进行可卡因的检测。在具体的检测方法上主要是利用荧光淬灭、酶催化的颜色反应、电化学或纳米金颜色反应进行可卡因的检测。这些方法的检测线性范围在
0.1μΜ-500μΜ的范围内。
[0005]可卡因的检测方法有以下几种:一种是使用一段适配体的方法(B.R.Baker，et.al，J.Am.Chem.Soc.2006，128，3138-3139)，在该方法中，适配体的一端修饰巯基，通过Au-S键固定在金电极表面，另一端修饰氧化还原基团亚甲基蓝(MB)。在可卡因存在的情况下，可卡因和其适配体相互作用，引起构象改变，导致MB接近电极表面，从而引起电极表面电流的增加，实现可卡因的定量检测，该方法的检测灵敏度为10 μ M。第二种是使用两段式适配体探针(J.Am.Chem.Soc.Vol.131，N0.21,2009，6944-6945.)，将一段探针通过巯基组装到电极上，而将另一段标记MB。在可卡因存在的情况下，MB修饰的探针通过可卡因与在电极表面上的探针形成超分子复合物而使MB靠近电极表面，从而引起电极表面电流的增力口，将检测的灵敏度提高了一个数量级(ΙμΜ)。专利申请CN102650612A提出了利用三段式适配体探针对可卡因进行电化学检测，其将适配体分为三段，灵敏度在0.ΙμΜ。专利CN101948907Β提出了利用未修饰的三段式适配体探针进行均相的可卡因纳米金颜色检测方法，该方法将基于一段或两段式适配体的可卡因纳米金颜色检测，灵敏度由2.5 μ M提高到
0.5μΜ。该专利发明首次证实了将一段适配体探针分割成三段后，依然能够与可卡因自组装形成具有双链DNA结构。以上所述采用未修饰的三段式适配体探针进行可卡因颜色检测的方法，以及采用一段或两段适配体进行可卡因电化学检测的方法存在着以下不足:具有很大的局限性，检测灵敏度不高(0.5 μ M?10 μ M级)，标准偏差大，定量分析误差大。
【发明内容】
[0006]针对以上问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高灵敏度的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因进行电化学检测方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，包括以下步骤:
[0008]I)将裸金电极抛光，洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10?15min，再取出清洗、干燥；
[0009]2)将用TE缓冲液配制的巯基标记的适体片段Co3S滴加于上述金电极上，置于4°C冰箱过夜；
[0010]3)将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭I?1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极2?3h ;
[0011]4)将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加PB缓冲液配制的生物素标记的适体片段Co3B和待测样品溶液，然后在37°C下反应40?50min ；
[0012]5)将步骤4中的金电极取出冲洗，加入PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液，37°C温育30?45min,取出冲洗；
[0013]6)在步骤5中的金电极上加入PB缓冲液配制的环化DNA溶液，37°C温育30?45min,取出冲洗；
[0014]7)在步骤6中的金电极上加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37°C滚环扩增I?1.5h，取出冲洗；
[0015]8)在步骤7中的金电极上加入用2XSSC杂交液配制的生物素修饰的检测探针，37V杂交I?1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；
[0016]9)在步骤8中的金电极上加入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP, 37°C反应30?45min，用DEA缓冲液冲洗，在用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL a -NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，根据标准曲线，得到待检样品中可卡因的浓度。
[0017]所述步骤I中金电极抛光用粒度为0.05 μ m的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H2SO4IH2O2体积比为3:1的溶液。
[0018]所述的巯基标记的适体片段Co3S序列为:5’ -GGGAGTCAAGAACGAAAAAAAA-th i ο 1-(CH2)3，生物素标记的适体片段Co3B序列为:5’-TTCGTTCTTCAATGAAGTGGGACGACAAAAMA-biotin,检测探针序列为:5’ -Biotin-AAAAAAGCGCAGAATGGT,制作环化DNA时所用的引物DNA序列为:5’ -Biotin-AAAAAAAAAAAACAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAGA，待环化模板 DNA 序列为:5 ’-P-TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCAGAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATCTGCCCTGACTTC0
[0019]所述步骤3至7中金电极的冲洗按照如下步骤完成:先用含0.005%吐温20Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次；Tris_HCl缓冲液为含有20mM Tris, 0.1M 氯化钠，5mM 氯化镁，pH 7.4。
[0020]所述步骤3中的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/ml的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制。
[0021]所述步骤4中的待测样品溶液的制备方法为:将尿液离心，取上清，然后用PB缓冲液按体积比1:3稀释；所述步骤4、5、6中的PB缓冲液为含有5mM氯化钾，5mM氯化镁，40 μ MTCEP，0.1M 磷酸盐，pH 7.4。
[0022]所述步骤7中的滚环扩增反应液中含33mM Tris, IOmM氯化镁，66mM氯化钾，ImM二硫苏糖醇，0.1%吐温-20，pH 7.9。
[0023]所述步骤8中的杂交液为2 X SSC缓冲液，含有0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸三钠，pH 7.4 ；DEA缓冲液为含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化镁，IOOmM氯化钾，pH 9.6。
[0024]所述步骤5中用PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液的浓度与步骤6中的环化DNA浓度相同，且加入的量也相同。使用相同体积和相同浓度的链酶亲和素溶液和环化DNA，将识别元件和放大元件分开，仅利用链酶亲和素的桥接作用，减少了空白信号，提高了检测的灵敏度和线性范围。
[0025]该方法可卡因检测的线性范围为10?500nM，灵敏度为9.26nM，比已有生物传感器检测可卡因的灵敏度提高I个数量级，有利于微量或痕量毒品快速检测。
[0026]有益效果:本发明首次利用超分子适体和滚环扩增对可卡因进行电化学检测，极大提高了可卡因适体传感器检测的灵敏度和特异性，使得检测的线性范围达到10?500nM，检测的灵敏度为9.26nM。使用相同体积和相同浓度的链酶亲和素溶液和环化DNA，将识别元件和放大元件分开，仅利用链酶亲和素的桥接作用，减少了空白信号，提高了检测的灵敏度和线性范围。
[0027]说明书附图:
[0028]图1为本发明的检测原理示意图；
[0029]图2为本发明的可卡因浓度与电流信号线性关系图；
[0030]图3为本发明的适体传感器的特异性考察图，其中a为空白对照，b为吗啡，c为甲基苯丙胺，d为氯胺酮，e为可卡因。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
[0032]本发明中的ST-AP 为 Streptavidin-alkaline Phosphatase,中文名称为亲和素标记碱性磷酸酶，购自Sigma公司(美国)。
[0033]本发明中的α-ΝΡ为a-Naphthyl Phosphate,中文名称为1-萘酚磷酸钠，购自Sigma公司(美国)。[0034]本发明中的TCEP 为 Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride,中文名称为三(2-羧乙基)磷盐酸,购自Sigma公司(美国)。
[0035]本发明中的BSA为bovine serum albumin,中文名称为小牛血清白蛋白，购自Sigma公司(美国)。
[0036]实施例一、制备环化DNA
[0037]将IOOnM 5’端磷酸化的待环化模板DNA与IOOn M的生物素修饰的引物DNA混合于100 μ L含有6.6mM氯化镁，IOmM 二硫苏糖醇，ImM ATP，66mMTris、pH 7.6的缓冲液中，接着加入0.2U的T4DNA连接酶，37°C连接反应60min，65V IOmin灭活T4DNA连接酶，得到的环化DNA在-20°C下保存备用。所用的待环化模板DNA序列为:
[0038]5，-P-TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCAGAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATCTGCCCTGACTTC，引物 DNA 序列为:5’ -Biotin-AAAAAAAAAAAACAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAo
[0039]实施例二、基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，按照以下步骤进行:
[0040]I)裸金电极用0.05 μ m氧化招粉抛光，在水中超声洗漆,浸入食人鱼溶液(浓H2SO4IH2O2体积比为3:1) 10?15min，去离子水清洗金电极，室温自然干燥；
[0041]2)将 10μ L 的 TE 缓冲液(pH 8.0, 10 mM Tris, I mM EDTA)配制的 50nM 巯基标记的适体片段Co3S滴加于步骤I中的金电极上，置于4°C冰箱过夜；所述的巯基标记的适体片段Co3S序列为:
[0042]5，-GGGAGTCAAGAACGAAAAAAAA-th1l-(CH2)3 ；
[0043]3)用清洗缓冲液冲洗步骤2中的金电极，用10 μ LlmM的6_巯基_1_己醇封闭I?1.5h，用清洗缓冲液冲洗金电极，然后用10 μ L鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极2?3h ;所述鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/ml的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制。
[0044]4)用清洗缓冲液冲洗步骤3中的金电极，在金电极上同时滴加5 μ L的60ηΜ生物素标记的适体片段Co3B和5 μ L待测样品溶液在37°C下反应40?50min ;所述的生物素标记的适体片段 Co3B 序列为:5’ -TTCGTTCTTCAATGAAGTGGGACGACAAAAAAA-biotin ;待测样品溶液制备方法为:将尿液离心，取上清，然后用PB缓冲液按体积比1:3稀释；所述步骤4、5、6中的PB缓冲液为含有5mM氯化钾，5mM氯化镁，40 μ M TCEP的0.1M磷酸盐，pH 7.4。
[0045]5)用清洗缓冲液冲洗步骤4中的金电极，加入10uL15nM的用PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液，37°C温育30min，清洗缓冲液冲洗；
[0046]6)在步骤5中的金电极上加入10 μ L含15ηΜ环化DNA的PB缓冲液，37°C温育30min，用清洗缓冲液冲洗；
[0047]7)在步骤6中的金电极上加入IOyL含0.5mM dNTP、0.4U phi29 DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37°C滚环扩增lh，用清洗缓冲液冲洗金电极；所述滚环扩增反应液中含33mM Tris, IOmM 氯化镁，66mM 氯化钾，ImM 二硫苏糖醇，0.1% 吐温-20，pH 7.9。
[0048]8)在步骤7中的金电极上加入IOyL的用2XSSC杂交液配制的ΙμΜ生物素修饰的检测探针37 °C杂交lh，用DEA缓冲液清洗金电极；所述的检测探针序列为:5’ -Biotin-AAAAAAGCGCAGAATGGT ;所述杂交液为 2 X SSC 缓冲液，含有 0.3M 氯化钠，0.03M柠檬酸三钠，pH 7.4 ;DEA缓冲液为含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化镁，IOOmM氯化钾，pH 9.6。[0049]9)在步骤8中的金电极上加入IOyL用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的
1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反应30min，先用含有0.005%吐温20的DEA缓冲液冲洗三次，再用不含吐温20的DEA缓冲液冲洗三次，在用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中进行DPV信号检测。根据标准曲线，得到待检样品中可卡因的浓度。
[0050]以上步骤3至7中金电极的冲洗按照如下步骤完成:先用含0.005%吐温20Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次；Tris_HCl缓冲液为含有20mM Tris, 0.1M 氯化钠，5mM 氯化镁，pH 7.4。
[0051]电化学检测DPV信号，DPV信号和可卡因浓度线性关系图如图2所示，计算得到其线性关系为:y=0.02x+2.78，其中y为电流信号强度，x为可卡因浓度。根据得到的电流信号强度值，即可换算得到待检样品中的可卡因浓度值。当电流为4μ A时，可计算得知可卡因浓度为61ηΜ。
[0052]使用该方法分别检测空白对照、已知浓度均为5μ M的吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮和已知浓度为500ηΜ的可卡因，得到各物质利用该方法检测的适体传感器特异性考察图，如图3所示，吗啡、甲基苯丙胺和氯胺酮的浓度是可卡因的10倍，产生的电流信号却和空白对照相近，甚至更低，可见该方法对可卡因有很高的特异性，对吗啡、甲基苯丙胺和氯胺酮特异性很低，该方法适合于可卡因检测。
【权利要求】
1.一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，包括以下步骤: 1)将裸金电极抛光，洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10~15min，再取出清洗、干燥； 2)将用TE缓冲液配制的巯基标记的适体片段Co3S滴加于上述金电极上，置于4°C冰箱过夜； 3)将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭I~1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极2~3h ; 4)将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加PB缓冲液配制的生物素标记的适体片段Co3B和待测样品溶液，然后在37°C下反应40~50min ； 5)将步骤4中的金电极取出冲洗，加入PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液，37°C温育30~45min,取出冲洗； 6)在步骤5中的金电极上加入PB缓冲液配制的环化DNA溶液，37°C温育30~45min，取出冲洗； 7)在步骤6中的金电极上加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37°C滚环扩增I~1.5h，取出冲洗； 8)在步骤7中的金电极上加入用2X SSC杂交液配制的生物素修饰的检测探针，37°C杂交I~1.5h，用DEA缓冲液清洗电极； 9)在步骤8中的金电极上加 入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25 u g/mL的ST-AP, 37°C反应30~45min，用DEA缓冲液冲洗，在用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL a -NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，根据标准曲线，得到待检样品中可卡因的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤I中金电极抛光用粒度为0.05 的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H2SO4 = H2O2体积比为3:1的溶液。
3.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述的巯基标记的适体片段Co3S序列为:5’-GGGAGTCAAGAACGAAAAAAAA-thiol-(CH2)3,生物素标记的适体片段 Co3B 序列为:5’-1TCGITCTTCAATGAAGTGGGACGACAAAAAAA-biotin，检测探针序列为:5’ -Biotin-AAAAAAGCGCAGAATGGT，制作环化DNA时所用的引物DNA序列为:5’ -Biotin-AAAAAAAAAAAACAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAGA，待环化模板 DNA 序列为:5 ’ -P-TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCAGAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATCTGCCCTGACTTC。
4.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤3至7中金电极的冲洗按照如下步骤完成:先用含0.005%吐温20Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次；Tris_HCl缓冲液为含有20mM Tris, 0.1M 氯化钠，5mM 氯化镁，pH 7.4。
5.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤3中的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/ml的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制。
6.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤4中的待测样品溶液的制备方法为:将尿液离心，取上清，然后用PB缓冲液按体积比1:3稀释；所述步骤4)、5)、6)中的PB缓冲液为含有5mM氯化钾，5mM氯化镁，.40 u M TCEP，0.1M 磷酸盐，pH 7.4。
7.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤7中的滚环扩增反应液中含33mM Tris, IOmM氯化镁，66mM氯化钾，ImM二硫苏糖醇，0.1%吐温-20，pH 7.9。
8.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤8中的杂交液为2 X SSC缓冲液，含有0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸三钠，pH 7.4 ；DEA缓冲液为含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化镁，IOOmM氯化钾，pH 9.6。
9.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤5中用PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液的浓度与步骤6中的环化DNA浓度相同，且加入的量也相同。
10.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:可卡因检测的线性范围为10~500nM，灵敏度为9.26nM。
【文档编号】G01N27/48GK103630598SQ201310665141
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】丁世家, 李剑波, 汤华, 唐仁宽, 李永国, 颜玉蓉, 申波, 朱丹, 雷品华, 张伟, 刘刚, 李佳迅 申请人:重庆医科大学