专利名称：：基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法
技术领域：
：本发明属于转基因检测
技术领域：
，特别涉及一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法。
背景技术：
：随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活。由于转基因食品所具有的潜在非安全件，为保护广大消费者的权益，满足其选择权和知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。目前转基因产品检测方法分为两大类-1、免疫学检测法免疫学检测法是从蛋白质水平对转基因食品进行检测，即对外源蛋白质的测定。可将其分为Western杂交、酶联免疫法(ELISA)、试纸条法和快速检测试剂盒法。免疫学检测法，其基本原理是通过抗原(antigen)抗体(antibody)之间的特异反应来实现的。这种方法的不足在于第一，由于抗原抗体反应的专一性，因此一种试剂盒只针对一特定转基因产物，无法高通量、快速地检测具有多种混合成分的食品样品；第二，加工过的转基因食品中的蛋白质抗原性很容易破坏，从而影响检测结果的准确性；第三，有些转基因食品不表达蛋白质或表达量很低或很大时，则无法进行检测。2、PCR检测法PCR检测法是目前转基因存在的检测方法屮最为成熟的，它具有灵敏度较高、特异性强、可准确定量等优点。现阶段常用的PCR技术有定性PCR，定量竞争PCR和实时荧光定量PCR，PCR—ELISA，巢式扩增PCR(NestedPCR)和复合扩增PCR(MultiplexPCR)。但该项技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳件结果，即检测物质本身含有转基因特制而未被检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成分。
发明内容为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法。该方法设计一条靶基因探针，探针的5'端和3'端能够与目标的检测基因序列互补配对，在完全互补配对的情况下，连接酶把能够完全配对的探针连接成环化的探针，再用一条5'端生物素化复制引物以该环化探针为模板进行滚环扩增，扩增出与环形探针模板互补的串联重复序列的DNA单链；然后将产物与钌标记的探针杂交，最后进行电化学发光检测。只有当探针能够与转基因物种的待测序列完全互补才能被连接酶连接成环化探针，从而能产生用于滚环复制的模板；而不含转基因的物种因为不能产生滚环复制的模板，因此不能得到扩增产物；通过对扩增产物与钌探针杂交后进行电化学发光检测能判断转基因的有无。本发明的目的通过下述技术方案实现一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，包括以下步骤(1)从转基因物种样品中提取样品的基因组DNA即靶基因1。(2)将靶基因1与过量的靶基因探针2混合，9095。C变性，然后自然冷却到室温，靶基因1与靶基因探针2退火、杂交。(3)然后加入25个单位(U)DNA连接酶，37'C下进行连接反应2030分钟，耙基因探针2被DNA连接酶连接成环化探针3。(4)在上述环化探针3中加入过量的与环化探针3互补的生物素化的复制引物4、1015个单位(U)DNA聚合酶和13毫摩尔dNTPs，在37°C进行滚环扩增复制反应90分钟左右，产生生物素化滚环扩增产物5。(5)在室温下，步骤(4)得到的生物素化滚环扩增产物5与过量的钌标记的核酸探针6杂交3060分钟，得到杂交产物。(6)将上述杂交产物与链霉亲和素包被的磁珠孵育大约2030分钟，然后用磁分离器分离，去掉上清，收集磁珠吸附的杂交产物于电化学发光仪器样品池中。(7)往样品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，检测样品池中的三联P比啶钌复合物产生的电化学发光信号确定样品中是否含有转基因产品。比较样品检测的信号与非转基因样品的信号，当样品信号大于非转基因样品信号与三倍标准偏差之和的信号时可判断样品为含有转基因的样品。所述步骤(1)的靶基因l提取方法如下对非粉末状的固体样品，采用5研磨处理成粉末状，然后提取样品中的DNA。对于液态样品，采用冷冻干燥法干燥并磨碎成粉末状。所述步骤(l)的转基因物种样品中含有的基因是CAMV35S启动子、NOS终止子、Kmr(抗卡那霉素基因)、Nec/(抗新霉素基因)、Kygf(抗潮霉素基因)或Barr(抗草丁膦基因)的基因，以及人工插入基因组改变物种品质与功能的特异的外源基因。所述步骤(l)的靶基因1为含有CAMV35S启动子、NOS终止子、Kmr(抗卡那霉素基因)、Nec/(抗新霉素基因)、Kygf(抗潮霉素基因)或Bar「(抗草丁膦基因)的基因，以及人工插入基因组改变物种品质与功能的特异的外源基因。所述步骤(2)的靶基因探针2是一段线性单链DNA探针，其长度一般为50200个碱基长度，每条探针有一个5'磷酸末端和一个3'羟基末端。靶基因探针2包括两个部分，分别为位于5'端和3'端的目标基因杂交区，以及位于5，端和3，端的目标基因杂交区中的填充区。杂交区的序列与靶基因l完全互补，并根据不同靶基因而变化，填充区则以最优化于滚环扩增条件而定。当转基因物种样品中含有CAMV35S启动子时，所述靶基因探针2为5TGGGTGTTACGTACGGCAGAGGCATC丁TCAACGA3'。所述步骤(2)的高温变性温度一般为9095r，退火和杂交条件则依据所检测的目标转基因的序列而定，但一般范围为2050'C，也可以从变性温度缓慢降温到室温执行退火和杂交步骤。所述歩骤(3)的DNA连接酶包括￡.co/z'DNA连接酶、T4DNA连接酶、TaqDNA连接酶或其他适合于DNA连接的酶。所述歩骤(4)的生物素化的复制引物4是一段5，端标记上生物素的DNA单链，其长度为1530个碱基长度为宜，它的序列应该与环化探针3的填充区互补。当转基因物种样品中含有CAMV35S启动子时，所述生物素化的复制引物4为5'biotin-TTTTTTAGCGCTATCTTCA3，；所述复制引物4为5，-TTTTTTAGCGCTATCTTCA3，。所述歩骤(4)的DNA聚合酶包括￡.co//DNApolymerase(大肠杆菌DNA聚合酶)、phageM2DNApolymerase(噬菌体M2DNA聚合酶)、T5DNApolymerase(T5DNA聚合酶)、PRD1DNApolymerase(PRD1DNA聚合酶)或者Phi29DNApolymerase(Phi29DNA聚合酶)等。dNTPs为商品化产品。所述步骤(5)钌标记的核酸探针6为标记上钌的核酸探针，其长度一般为1530个碱基长度，其序列与生物素化滚环扩增产物5的重复序列互补。当转基因物种样品中含有CAMV35S启动子时，所述歩骤(5)中钌标记的核酸探针6为5，AATCCAGTTAGAATGAAG3'。所述步骤(6)的链霉亲和素包被的磁珠可以采用商品化的产品，比如美国DynalBiotech公司的链霉亲和素包被的磁珠。所述步骤(7)的电化学发光检测仪器(见本申请人在先申请，申请号02227608.4，发明名称电化学发光检测仪，见图2)包括样品池、恒电位仪2、光纤3、光电倍增管4、模数转换器5、微型计算机6和数据处理软件；其中样品池1由进样管1-1、对电极1-2、工作电极1-3、参比电极1-4、出样管1-5组成。样品池可以用清洗液反复清洗。所述的计算机数据采集软件，如NationalInstruments公司开发的LabV正W软件。所述的光电倍增管，如PerkinElmer公司研制的光电倍增管系列。本发明的原理与非转基因的物种相比，转基因物种含有-段外源转入的基因，如CAMV35S启动子，NOS终止子等。通过检测这些转入基因便可以检测转基因物种。滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基冈复制方式，这种方式口」'使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增。本发明通过设计一条靶基因探针，其5'端和3'端各含有一段可有转基因物种靶序列互补的区域，通过与转基因物种靶序列杂交，便可在DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子，仅仅当检测物种含有相应的转基因片段才能杂交、并被DNA连接酶连接成环化的分子。加入一条特异性的生物素化复制引物，生物素化的复制引物便可以以此环化单链分子为模板，在DNA聚合酶的作用下恒温扩增，产生含有多个重复片段U05109)的DNA线性单链分子。设计特异性的钌探针与该DNA线性单链互补，因此，杂交后生物素化的扩增产物可携带大量钌探针，极大的扩增出信号。加入链霉亲和素包被的磁珠后，由于链霉亲和素能选择性的与生物素产生强大特异的相互作用，因此通过磁分离磁珠，游离的钌探针以及其他非特异的产物能够被分离洗脱掉。在一定电压条件下，三联吡啶钌/三丙胺或者三联吡啶钌/二丁基乙醇胺能够在电极表面发生电化学反应并发出光子。光子经过光纤收集到光电倍增管中，然后将其转化为电信号，经过模式转换器转化为数字信号，经计算机采集处理。通过判断电化学发光强度来检测转基因的有无。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果(1)本发明的连接酶反应需要探针分子和靶序列完全杂交互补才能实现，保证了本发明的特异性。(2)本发明的滚环扩增方法中所扩增的并不是样品中的目标基因而是探针序列，转基因物种中的目标基因只是提供了一个探针环化的互补支架，进一步保证了扩增的特异性。(3)本发明的扩增过程在恒温下进行，不需要特定的PCR仪器和高温条件下稳定的DNA聚合酶，降低了检测的硬件要求和检测成本。(4)本发明所使用的电化学发光检测技术灵敏度很高；而且由于本方法所用的电化学发光探针只发生特异性的化学发光反应，所以测量的准确性也很(5)本发明与传统PCR方法相比，更为快速。(6)本发明所利用的检测装置简单，投资少，实现容易，操作简便。(7)本发明使用范围广泛，可以实现通用的转基因物种检测，因此节省成本。图1为电化学发光滚环扩增技术的原理图。其中，靶基因1，靶基因探针2，环化探针3，生物素化复制引物4，滚环扩增产物5，钌标记的核酸探针6。图2为本发明电化学发光检测仪器的装置示意图。图3为本发明检测转基因大豆的发光信号图。图4为本发明检测转基因番木瓜的发光信号图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1将本发明的方法应用于转基因大豆的检测，检测转基因大豆里的CaMV35S启动子序列。如图1所示为电化学发光滚环扩增技术的原理图。(1)分别提取非转基因大豆(华农1号)和转基因大豆(巴西大豆1号)里的基因组DNA(靶基因l)(对非粉末状的同体样品，采用研磨处理成粉末状，然后提取样品中的DNA)。针对转基因大豆的基因组DNA和非转基因大豆的基因组DNA平行进行如下实验，且步骤一样。(2)将O.l纳摩尔耙基因探针2(见表1)与IO微升上述非转基因大豆基因组DNA混合，0.1纳摩尔靶基因探针2和10微升上述转基因大豆基因组DNA(靶基因1)混合，然后分别在95。C变性5分钟，让其自然冷却到室温促使靶基因探针2退火到35S启动子序列上的靶基因1上并杂交。(3)然后加入2个单位(U)的T4DNA连接酶，37。C条件下孵育30分钟，进行连接反应，靶基因探针2被T4DNA连接酶连接成环化探针3(环化探针3与耙基因探针2的序列相同，只是被连接成环状)。(4)然后在环化探针3中加入过量的与环化探针3互补的生物素化的复制引物4(见表1)，室温下孵育30分钟，生物素化的复制引物4自然退火。(5)往上述产物中加入IO个单位(U)的Phi29DNA聚合酶、毫摩尔浓度dNTPs，37"C条件下滚环扩增反应90分钟，得到含有约为1000个串连重复序列的生物素化滚环扩增产物5。(6)在步骤(5)得到的生物素化滚环扩增产物5中加入0.1纳摩尔钌标记的核酸探针6(见表1)，在室温下，钌标记的核酸探针6与生物素化滚环扩增产物5杂交30分钟，得到杂交产物。(7)往上述杂交产物中加入链酶亲和素包被的磁珠(美国DynalBiotech公司的链霉亲和素包被的磁珠)，室温下孵育30分钟，磁分离器分离杂交产物，去除上清即未杂交的钌标记的核酸探针6，得到磁珠吸附的杂交产物。(8)将步骤(7)中磁珠吸附的杂交产物转入到电化学发光检测仪器样品池中。(9)在电化学发光检测仪器样品池中加入IOO微升三丙胺，给定电压1.25V，打开光电倍增管，电化学发光检测。(9)比较样品检测的信号与非转基因样品的信号，当样品信号大于非转基因样品信号与三倍标准偏差之和的信号时可判断样品为含有转基因的样品。如图3所示，是本实施例中用滚环扩增方法检测转基因大豆中的35S启动子序列的发光信号对比图。样品1为TE缓冲液+三丙胺(本底)，样品2为非转基因大豆(华农1号)，样品3为转基因大豆(巴西大豆1号)，虚线表示9临界值(非转基因大豆信号+3倍标准偏差)。由图可知而转基因大豆的发光值可达到700左右，高于临界值，结果信号很明显，信噪比高，可以准确的判断转基因的有无。表l实施例中所用到的核酸探针的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2将本发明的方法应用于转基因番木瓜的检测，检测转基因番木瓜里的CaMV35S启动子序列。(1)分别提取非转基因番木瓜和转基因番木瓜里的基因组DNA(耙基因1)(对非粉末状的固体样品，采用研磨处理成粉末状，然后提取样品中的DNA)。针对转基因大豆的基因组DNA和非转基因大豆的基因组DNA平行进行如下实验，且步骤一样。(2)0.1纳摩尔靶基因探针2(见表1)分别与IO微升上述非转基因番木瓜基因组DNA和IO微升上述转基因番木瓜基因组DNA(耙基因1)混合，分别在9(TC变性5分钟，然后让其自然冷却到室温，促使靶基因探针2退火到35S启动子序列上的靶基因1上并杂交。(3)然后加入5个单位(U)的T4DNA连接酶，4(TC条件下孵育20分钟，进行连接反应，耙基因探针2被连接成环化探针3(环化探针3与靶基因探针2的序列相同，只是被连接成环状)。(4)然后在环化探针3中加入过量的与环化探针3互补的生物素化的复制引物4(见表1)，室温下孵育30分钟，生物素化的复制引物4自然退火。(5)往上述产物屮加入15个单位(U)的Phi29DNA聚合酶、3毫摩尔浓度dNTPs，37'C条件下滚环扩增卯分钟，得到含有约为1000个串连重复序列的生物素化滚环扩增产物5。(6)在歩骤(5)得到的生物素化滚环扩增产物5中加入O.l纳摩尔钌标记的核酸探针6(见表1)，在室温下，钌标记的核酸探针6与生物素化滚环扩增产物5杂交60分钟，得到杂交产物。(7)往上述杂交产物中加入链酶亲和素包被的磁珠，室温下孵育20分钟，磁分离器分离杂交产物，去除未杂交的钌标记的核酸探针6，得到磁珠吸附的杂交产物。(8)将步骤(7)中磁珠吸附的杂交产物转入到电化学发光检测仪器样品池中。(9)在电化学发光检测仪器样品池中加入IOO微升二丁基乙醇胺，给定电压L25V，打开光电倍增管，电化学发光检测。(9)比较样品检测的信号与非转基丙样品的信号，当样品信号大于非转基因样品信号与三倍标准偏差之和的信号时可判断样品为含有转基因的样品。如图4所示，是本实施例屮用滚环扩增方法检测转基因番木瓜中的35S启动子序列的发光信号对比图。样品1为TE缓冲液+三丙胺(木底)，样品2为非转基因番木瓜，样品3为转基因番木瓜，虚线表示临界值(非转基因番木瓜信号+3倍标准偏差)。由图可知而转基因番木瓜的发光值可达到300左右，高于临界值，结果信号很明显，信噪比高，可以准确的判断转基因的有无。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>华南师范大学<120>基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法<130>48<160>3<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>79<212>DNA<213〉Artificialsequence<220><223>靶基因探针2<400>1tggcctttcctttatcgcaatccagttagaatgaagatagcgcatgaggtgttacgtacg60gcagaggcatcttcaacga79<210>2<211>19<212>DNA<213〉Artificialsequence<220><223>生物素化的复制引物4<400>2ttttttagcgctatcttca19<210>3<211>18<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>钌标记的核酸探针6<400>3aatccagttagaatgaag权利要求1.一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于包括以下步骤(1)从转基因物种样品中提取样品的基因组DNA即靶基因1；(2)将靶基因1与过量的靶基因探针2混合，90～95℃变性，然后自然冷却到室温，靶基因1与靶基因探针2退火、杂交；(3)然后加入2～5个单位DNA连接酶，37℃下进行连接反应20～30分钟，靶基因探针2被DNA连接酶连接成环化探针3；(4)在上述环化探针3中加入过量的与环化探针3互补的生物素化的复制引物4、10～15个单位DNA聚合酶和1～3毫摩尔dNTPs，在37℃进行滚环扩增复制反应90分钟，产生生物素化滚环扩增产物5；(5)在室温下，将步骤(4)得到的生物素化滚环扩增产物5与过量的钌标记的核酸探针6杂交30～60分钟，得到杂交产物；(6)将上述杂交产物与链霉亲和素包被的磁珠孵育20～30分钟，然后用磁分离器分离，去掉上清，收集磁珠吸附的杂交产物于电化学发光仪器检测样品池中；(7)往检测样品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，检测样品池中的三联吡啶钌复合物产生的电化学发光信号确定样品中是否含有转基因产品；所述步骤(2)的靶基因探针2是一段线性单链DNA探针，其长度为50～200个碱基长度，每条探针有一个5’磷酸末端和一个3’羟基末端；靶基因探针2包括两个部分，分别为位于5’端和3’端的目标基因杂交区，以及位于5’端和3’端的目标基因杂交区中的填充区，所述杂交区的序列与靶基因1完全互补；所述步骤(4)的生物素化的复制引物4是一段5’端标记上生物素的DNA单链，其长度为15～30个碱基长度，它的序列与环化探针3的填充区互补；所述步骤(5)钌标记的核酸探针6为标记上钌的核酸探针，其长度为15～30个碱基长度，其序列与生物素化滚环扩增产物5的重复序列互补。2、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于所述步骤(1)的靶基因l的提取方法如下对非粉末状的固体转基因物种样品，采用研磨处理成粉末状，然后提取样品中的DNA;对于液态转基因物种样品，采用冷冻千燥法干燥并磨碎成粉末状。3、根据权利要求l所述的.种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于所述步骤(1)的靶基因1为含有CAMV35S启动子、NOS终止子、抗卡那霉素基因、抗新霉素基因、抗潮霉素基因或抗草丁膦基因的基因。4、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于当转基因物种样品中含有CAMV35S启动子时，所述靶基因探针5、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于所述步骤(3)的DNA连接酶包括五.co//DNA连接酶、T4DNA连接酶或TaqDNA连接酶。6、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于当转基因物种样品中含有CAMV35S启动子时，所述生物素化的复制引物4为5'biotin-TTTTTTAGCGCTATCTTCA3'。7、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于所述步骤(4)的DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶、噬菌体M2DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶或者Phi29DNA聚合酶。8、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于当转基因物种样品中含有CAMV35S启动子时，所述歩骤(5)中钌标记的核酸探针6为5，AATCCAGTTAGAATGAAG3，。全文摘要本发明公开了基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，该方法利用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针与转基因物种的靶基因杂交后在DNA连接酶的作用下形成环化单链探针，该探针在恒温条件下被生物素复制引物滚动复制和支链扩增，产生含有多个串连重复片段的生物素化滚环扩增产物，扩增产物与钌标记的DNA探针杂交，再通过链霉亲和素包被的磁珠分离、电化学发光检测，判断转基因的有无。本发明的滚环扩增检测方法中所扩增的基因并不是转基因物种的原基因序列而是探针序列，转基因物种的原基因只是提供了一个探针环化的互补支架，保证了扩增的安全性和特异性；另外所有的扩增过程都可在恒温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。文档编号G01N21/76GK101260431SQ20081002765公开日2008年9月10日申请日期2008年4月24日优先权日2008年4月24日发明者周小明,朱德斌,达邢申请人:华南师范大学