专利名称：转基因油菜rf2品系pcr-dhplc检测引物及检测方法
技术领域：
本申请涉及转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测弓I物及检测方法。
背景技术：
目前对转基因油菜的检测方法主要采用常规PCR，实时荧光PCR、PCR_基因芯片等检测方法。传统的常规PCR检测方法在平台扩展方面具有一定的局限性，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较多重常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展，并且检测成本高。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance Liquid Chromatography,DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，具有分辨率好、扩展性强、灵敏度高等优点。该方法在50°C条件分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定，样品的碱基对数量不同洗脱顺序也不同，从而产生不同的样品峰。具体的，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与DNA marker比较确定分子量大小，从而判定样品中是否含有目标检测基因。PCR-DHPLC，是将PCR与DHPLC相结合的技术，即先采用PCR扩增出靶标序列，然后再对扩增产物进行DHPLC分析，从而提高检测的灵敏度和特异性。目前，尚没有转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC的检测方法。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的用于转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测的引物，以及基于该引物的转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测方法。为实现上述目的，本申请采用了以下技术方案:本申请公开了一种用于转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测的引物，该引物的上游引物含有Seq ID N0.1所示序列，下游引物含有Seq ID N0.2所示序列；Seq ID N0.1:5，-GCGAATTTGGCCGGTGAGT-3，Seq ID N0.2:5，-TCAACAACATCCATGGTGCCAT-3，。需要说明的是，本申请的引物是针对转基因油菜RF2品系而设计的特异性引物，能够对转基因油菜RF2品系进行特异性扩增，因此，可以理解，该引物除了用于本申请的PCR-DHPLC检测以外，同样适用于常规的PCR检测，以及其它的基于PCR扩增的检测，如实时荧光PCR、基因芯片等等。本申请的另一面还公开了一种转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测方法，该检测方法包括采用本申请设计的引物，以待检测样品的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行变性高效液相色谱分析。需要说明的是，本申请设计的引物是针对转基因油菜RF2品系的特异性引物，因此，可以理解，如果待检测样品中含有足量的转基因油菜RF2品系成分，即可扩增出相应的靶标片段，并在DHPLC分析时产生相应的洗脱峰。进一步的,本申请的检测方法还包括以DNA marker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与DNA marker的变性高效液相色谱分析结果进行比对。优选的本申请的检测方法包括如下步骤:(A)采用本申请的引物，以待检测样品的DNA为模板，进行PCR扩增；(B)以步骤(A)的PCR扩增产物为样品进行DHPLC分析，同时以DNAmarker为参考标准进行DHPLC分析；(C)将步骤(B)中PCR扩增产物的DHPLC分析结果与DNA marker的DHPLC分析结果进行比较，确定PCR扩增产物的 分子量大小，从而判断是否含有检测的靶标序列。需要说明的是，理论上，本申请的引物是根据转基因油菜RF2品系设计的特异性引物，能够对待检测样品中的转基因油菜RF2品系成分扩增出约259bp的片段，因此，能够通过DHPLC分析出259bp的洗脱峰；而对其它成分不会有扩增，即不会有其它洗脱峰出现。本申请中，判断是否含有转基因油菜RF2品系的靶标序列的依据即，是否有259bp的洗脱峰。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于:本申请的转基因油菜RF2品系检测引物具有较强的特异性，能够用于后续的多重PCR扩增以及DHPLC分析。本申请针对传统的电泳分析PCR扩增结果不理想的问题，将PCR与DHPLC相结合，提供了一种操作简便、扩展性能好、分辨率高的转基因油菜RF2品系检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，对不同大小的PCR产物片段区分率可达数个碱基，甚至能够区分出I个碱基大小差异的片段。本申请的引物和检测方法为转基因油菜RF2品系的检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于Π岸检验检疫等部门使用。
图1:是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；图2:是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；图3:是本申请实施例中PCR扩增产物的DHPLC分析的部分结果图；图1中自上而下的曲线分别代表M为DNA marker、W为水空白、al为转基因油菜品系MSl、bl为转基因油菜品系RFl、cl为转基因油菜品系RF2、dl为转基因油菜品系RF3、el为转基因油菜品系RT73、fl为转基因油菜品系MS8、gl为转基因油菜品系T45、hi为转基因油菜品系Topasl9/2、il为非转基因油菜、jl为转基因玉米品系3272、kl为转基因玉米品系59122，图2中自上而下的曲线分别代表a2为转基因玉米品系Btll、b2为转基因玉米品系Btl76、c2为转基因玉米品系GA21、d2为转基因玉米品系MIR604、e2为转基因玉米品系M0N810、f2为转基因玉米品系M0N863、g2为转基因玉米品系M0N88017、h2为转基因玉米品系M0N89034、 2为转基因玉米品系NK603、J2为转基因玉米品系TC1507、k2为转基因玉米品系T25、L2为非转基因玉米、m2为非转基因玉米，图3中自上而下的曲线分别代表a3为转基因大豆品系A2704-12、b3为转基因大豆品系A5547-127、c3为转基因大豆品系GTS40-3-2、d3为转基因大豆品系M0N89788、e3为非转基因大豆、f3为大豆盲样、g3为转基因棉花品系GHB614、h3为转基因棉花品系LLCotton25、i3为非转基因棉花、j3为转基因水稻品系LL Rice62、k3为非转基因水稻、L3为转基因马铃薯品系EH92-527_l、m3为木瓜。marker 的各峰值从左至右依次为 80bp、102bp、174bp、257bp、267bp、296bp、434bp、458bp、587bp。
具体实施例方式本申请提供了用于转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测的引物，该引物针对转基因油菜RF2品系的特异序列进行设计，能够用于转基因油菜RF2品系的特异性扩增检测。在此基础上本申请还提供了基于本申请的引物的转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测方法。需要说明的是，本申请的引物是针对转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测而设计的，但是，可以理解，该引物本身也是作为PCR扩增使用的，因此，同样可以用于常规的PCR扩增、实时荧光PCR扩增、与基因芯片结合的PCR扩增等。下面通过具体实验例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实验例仅仅对本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。实施例1DNA提取(I)DNA提取:参照植物基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN，Cat.N0.69104)所提供的方法稍作改进提取DNA，具体操作步 骤如下:①65°C 预热的 APl 溶液和 Buffer AE ；②液氮研磨样品至粉末状后，取适量样品入1.5mL的离心管中；③向离心管中加入400 μ L预热的APl溶液和4 μ L100mg/mL的RNA酶，充分混匀后，65°C水浴10min-15min，期间振荡混匀2-3次；④水浴完成后，直接加入130 μ L ΑΡ2溶液，充分振荡混匀后冰浴5min，冰浴时不可震荡，14000r/min 离心 5min ；⑤吸取上清加入到QIA shredder Mini spin column柱子中，即试剂盒中的紫色柱子，14000rpm/min离心2min,记录吸取的上清液的体积数；⑥弃上面的柱子，向过滤后的溶液中加入1.5倍体积的Buffer AP3/E溶液，用移液枪轻轻混匀；⑦每次取650 μ L步骤⑥的混勻的溶液转移到DNeasy Mini spin column柱子内，即试剂盒中白色的柱子，14000rpm/min离心Imin,弃滤液,直至步骤⑥的混勻的溶液完全过滤完；需要说明的是，进行过滤时DNeasy Mini spin column柱所能容纳的体积约为650 μ L，而步骤⑥的溶液一般都是大于650 μ L的，因此，每次只能取650 μ L溶液，过滤、弃滤液后才能再加入剩余的溶液；⑧弃下面的收集管，将spin column柱放入一个新的2mL收集管中，加入500 μ LBuffer Aff溶液，14000rpm/min离心Imin洗脱杂质，重复洗脱杂质的操作一次，弃滤液，12000rpm/min 空管离心 Imin ；
⑨弃下面的收集管，换一新的1.5mL离心管，加入100 μ L预热后的Buffer AE溶解DNA，室温静置5min沉淀DNA，12000rpm/min离心lmin，收集的溶液即DNA溶液；需要说明的是100 μ L预热后的Buffer AE可以分两次或多次加入；⑩弃上面的柱子，_20°C保存DNA溶液。(2)DNA纯化:当DNA中含蛋白质等杂质的量较高时，其纯度不能满足实验要求，需要对其进行纯化，具体纯化步骤如下:①将提取的DNA溶液稀释到500 μ L-700 μ L后，加入等体积的酚和氯仿，充分混匀；②14000rpm/min 离心 IOmin,取上清液；③在上清液中加入0.6倍体积的异丙醇，-20°C静置30min以上；④在4°C条件下14000rpm/min离心lOmin，弃上清；⑤向步骤④中弃上清液的沉淀中加入lmL4°C预冷的70%的乙醇，14000rpm/min离心lOmin，弃上清，重复操作一次；⑥将经过步骤⑤的乙醇洗涤的沉淀在无菌条件下风干，加适量AE Buffer溶解DNA，即获得纯度较高的DNA溶液。需要说明的是，AE Buffer的加入量根据具体实验要求而定，如果希望获得DNA溶液的浓度较高，则可以加入较少量的AE Buffer,如10 μ L-50 μ L，也可以直接再加入IOOyL Buffer AE，则DNA浓度与纯化前相当，或者加入更多量的BufferAE以获得较低浓度的DNA溶液。 实施例2DNA浓度测定对提取的样品DNA进行浓度和纯度测定；采用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下:DNA 纯度=0D260/0D280DNA 浓度=5O X 0D260mg/mLDNA的纯度比值在1.7 L 9之间，浓度大于IOng/μ L。实施例3PCR扩增 根据转基因油菜RF2品系的DNA序列设计引物(表I )，并提取以下样品的DNA进行特异性检测:转基因油菜品系MS1、转基因油菜品系RF1、转基因油菜品系RF2、转基因油菜品系RF3、转基因油菜品系RT73、转基因油菜品系MS8、转基因油菜品系T45、转基因油菜品系Topasl9/2、非转基因油菜、转基因玉米品系3272、转基因玉米品系59122、转基因玉米品系Btll、转基因玉米品系Btl76、转基因玉米品系GA21、转基因玉米品系MIR604、转基因玉米品系M0N810、转基因玉米品系M0N863、转基因玉米品系M0N88017、转基因玉米品系M0N89034、转基因玉米品系NK603、转基因玉米品系TC1507、转基因玉米品系T25、非转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆品系A2704-12、转基因大豆品系A5547-127、转基因大豆品系GTS40-3-2、转基因大豆品系M0N89788、非转基因大豆、大豆盲样、转基因棉花品系GHB614、转基因棉花品系LLCotton25、非转基因棉花、转基因水稻品系LL Rice62、非转基因水稻、转基因马铃薯品系EH92-527-1、木瓜。表I转基因油菜RF2品系的检测弓丨物
权利要求
1.一种用于转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测的引物，其特征在于:所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物含有Seq ID N0.1所示序列，所述下游引物含有SeqID N0.2所示序列；Seq ID N0.1:5’ -GCGAATTTGGCCGGTGAGT-3’Seq ID N0.2:5’ -TCAACAACATCCATGGTGCCAT-3’。
2.—种转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测方法，其特征在于:所述检测方法包括采用权利要求1中的引物，以待检测样品的DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行变性高效液相色谱分析。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于:所述检测方法还包括以DNAmarker为参考标准进行变性高效液相色谱分析，将PCR扩增产物的变性高效液相色谱分析结果与DNA marker的变性高 效液相色谱分析结果进行比对。
全文摘要
本申请公开了一种转基因油菜RF2品系的PCR-DHPLC检测引物及检测方法，该引物具有较强的特异性，能够用于PCR，并特异性的扩增出转基因油菜RF2品系的DNA片段，并且其扩增产物能够适合于后续的DHPLC分析。该检测方法提供了一种操作简便、扩展性能好、特异性强的转基因油菜RF2品系的检测方法。利用DHPLC对PCR扩增产物进行分析，其片段大小区分率可达数个碱基，分辨率高。本申请的引物和检测方法为转基因油菜RF2品系的检测提供了一种简单、方便、有效、可靠的检测方法，特别适合用于口岸检验检疫等部门使用。
文档编号C12N15/11GK103173548SQ201310079328
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者章桂明, 向才玉, 潘广, 凌杏园 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心