专利名称：用于检测火鸡出血性肠炎病毒的lamp引物的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种用于检测火鸡出血性肠炎病毒(HEV)的 LAMP 引物。
背景技术：
LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)技术是由 Notomi 等在 2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物(两条外引物，两条内引物)及具有链置换活性的BstDNA聚合酶，在60 65°C进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到IO9 IOltl个拷贝数量级；整个反应仅需50min，在扩增反应中副产物焦磷酸镁沉淀与SYBR Green I或钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光，不需要借助其他仪器便可辨别实验结果。LAMP技术具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。目前，国内外尚未见采用LAMP引物检测HEV的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物。本发明的目的通过下述技术方案实现:一种用于检测火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物，其核苷酸序列如下所示:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATTGTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3，。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:(I)本发明以4条精确设计的引物严格识别靶核苷酸序列上的6个独立区域，从而避免反应混合物中存在的非靶序列的影响，特异性高。(2)本发明的扩增模板量为100拷贝，比常规PCR检测高I 2数量级，灵敏性比较闻。(3)本发明的LAMP不需通过温度循环变化来扩增，免除变温过程耗费的时间，使反应在30 60min就能将几个拷贝的靶基因高效扩增，反应时间短。(4)本发明的设备简单，不需凝胶成像系统，只需一台普通水浴锅或者浊度仪，且检测结果可肉眼直接观察，易于判定。
图1是实施例1的火鸡出血性肠炎病毒的LAMP浊度检测结果。图2是实施例1的火鸡出血性肠炎病毒的LAMP可视化检测结果；其中:A为SYBRgreen I的可视化检测结果；B为钙黄绿素可视化检测结果；C为SYBR green I反应后在紫外灯下的荧光效应结果；代表阴性反应，“+”代表阳性反应。图3是实施例2的酶切电泳鉴定LAMP反应产物的结果图；其中:M为DNA分子质量标准DL2000的电泳鉴定结果图；NC为阴性对照的电泳鉴定结果图；1为HEV LAMP阳性扩增产物的电泳鉴定结果图；2为HEV LAMP阳性扩增产物经Tsp45I酶切产物的电泳鉴定结果图。图4是实施例3的不同浓度的火鸡出血性肠炎病毒的LAMP浊度检测结果；其中:A为IO5拷贝/管的阳性质粒的LAMP浊度检测结果；B为IO4拷贝/管的阳性质粒的LAMP浊度检测结果；C为IO3拷贝/管的阳性质粒的LAMP浊度检测结果；D为IO2拷贝/管的阳性质粒的LAMP浊度检测结果。图5是实施例3的不同浓度的火鸡出血性肠炎病毒的LAMP在SYBR green I反应后于可见光下的荧光效应结果；其中:A为IO5拷贝/管的阳性质粒的LAMP在SYBR greenI反应后于可见光下的荧光效应结果；B为IO4拷贝/管的阳性质粒的LAMP在SYBR greenI反应后于可见光下的荧光效应结果；C为IO3拷贝/管的阳性质粒的LAMP在SYBR greenI反应后于可见光下的荧光效应结果；D为IO2拷贝/管的阳性质粒的LAMP在SYBR greenI反应后于可见光下的荧光效应结果；E为IO1拷贝/管的阳性质粒的LAMP在SYBR greenI反应后于可见光下的荧光效应结果；F为10°拷贝/管的阳性质粒的LAMP在SYBR greenI反应后于可见光下的荧光效应结果；G为阴性反应的LAMP在SYBR green I反应后于可见光下不出现荧光效应结果；H为阴性反应的LAMP在SYBR green I反应后于可见光下的不出现荧光效应结果。图6是效果实施例的火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物浊度特异性检测结果；其中:A为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对EDSV毒株DNA的浊度特异性检测结果；B为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对IBDV毒株cDNA的浊度特异性检测结果；C为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对ALV-J毒株cDNA的浊度特异性检测结果；D为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对AIV毒株cDNA 的浊度特异性检测结果；E为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP弓I物对ARV毒株cDNA的浊度特异性检测结果；F为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP弓丨物对HEV毒株DNA的浊度特异性检测结果。图7是效果实施例的火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物荧光显色特异性检测结果；其中:A为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对EDSV毒株DNA在SYBR green I反应后于可见光下不出现荧光效应结果；B为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对IBDV毒株cDNA在SYBR green I反应后于可见光下不出现荧光效应结果；C为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对ALV-J毒株cDNA在SYBR green I反应后于可见光下不出现荧光效应结果；D为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对AIV毒株cDNA在SYBR green I反应后于可见光下不出现荧光效应结果；E为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对ARV毒株cDNA在SYBR green I反应后于可见光下不出现荧光效应结果；F为火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物对HEV毒株DNA在SYBR green I反应后于可见光下的荧光效应结果。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1(I)材料:Bst DNA 聚合酶(Bst DNA ploymerse large fragment, New EnglandBiolab公司);甜菜碱(Betaine, Sigma公司);病毒DNA提取试剂盒(OMEGA公司，D3892-01);电泳用SYBR Green I (Invitrogen公司)；|丐黄绿素(Calcein, Sigma公司)；三联水浴锅(温度可达70°C即可)。(2)用于检测火鸡出血性肠炎病毒(HEV)的LAMP引物的制备:I)通过NCBI (美国国立生物信息中心)上已公布的HEV (Hemorrhagic EnteritisVirus)的Virginia Avirulent Strain (AY849321)的病毒全基因序列，与国外其他几株(AC_000016, NC_001958, AF074946) HEV全基因序列进行同源性比较，确定火鸡出血性肠炎病毒基因组的特异序列区，特异序列区为240bp ；2)特异序列在线提交 Primer Explorer (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index, html)生成LAMP弓丨物，得到如下引物:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATTGTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3’ ；3)生成的LAMP引物(F3和B3，BIP和FIP)，送上海英俊生物技术有限公司合成；(3) LAMP反应体系:引物稀释成25pmol/μ L ;25 μ L反应体系中，各成分的量如表I和表2 ；
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运用上述引物检测火鸡出血性肠炎病毒的方法，包括如下步骤:I)实验条件参考 Notomi 等建立的 LAMP 方法(Notomi T, Okayama H, MasubuchiH, et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic AcidsRes.，2000，28(12):E63)加以改进，以制备的病毒DNA为模板，LAMP的反应体系25μ L，添加各组分的体积见表I和表2 ;反应在62°C水浴锅中进行，反应时间为50min，反应结束后于85°C灭活8min ；2)反应结果的判定:A、实时浊度判定:用LA-320C浊度仪对LAMP副产物焦磷酸镁的形成每6s进行实时监测，当浊度超过阈值(0.1)形成明显扩增时判断为阳性反应，否则为阴性反应；结果如图1所示，阳性反应浊度在超过30分钟时曲线呈明显扩增状态；B:反应前，在体系中加入SYBR green I或者钙黄绿素，若反应为阳性，则可见光下反应管呈现黄绿色；若反应为阴性，则可见光下反应管呈现橘红色；且阳性反应在紫外灯下会产生荧光效应。结果如图2所示，A为体系中加入SYBR green I阳性反应在可见光下反应管呈现黄绿色，阴性反应在可见光下反应管呈现橘红色；B为体系中加入钙黄绿素(Calcein)阳性反应在可见光下反应管呈现黄绿色，阴性反应在可见光下反应管呈现橘红色；C为加入SYBR green I阳性反应在紫外灯下会产生荧光效应，而阴性反应管则无荧光效应。表I环介导等温扩增技术反应体系I
权利要求
1.一种用于检测火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物，其特征在于核苷酸序列如下所示:F3:5’ GCAATTTTATGAATATGGGTGAA3’ ；B3:5， TGAAGCAGTTCCAGTAGC3，；FIP:5’ CAGGCATTGGATCAACATTAAATGTGACTGACCTTGGACAGAG3’ ；BIP:5’ AGTGTTTTTGATT·GTGTTAGGGTCAAAAAGGAGTTCTGAAATAAGCT3’。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测火鸡出血性肠炎病毒的LAMP引物。该LAMP引物由一对外围引物和一对内引物组成，其核苷酸序列如SEQ NO.1～4所示。该引物特异性强，能严格识别靶核苷酸序列上的6个独立区域，从而避免反应混合物中存在的非靶序列的影响；扩增模板量低至10拷贝，灵敏性高。本发明的LAMP不需通过温度循环变化来扩增，反应在30～60min就能将几个拷贝的靶基因高效扩增，反应时间短；而且设备简单，检测结果可肉眼直接观察，易于判定。
文档编号C12Q1/70GK103243173SQ20131007906
公开日2013年8月14日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者曹伟胜, 刘雪美, 廖明, 徐成刚 申请人:华南农业大学