专利名称：人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药和基因工程技术领域，具体涉及人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法和应用。
背景技术：
丙型肝炎是由人丙型肝炎病毒(HCV，!fepatitis C Virus)感染引起的传染病，在全球广泛流行，尤其我国是HCV流行较严重的国家之一，人群感染率约为3.2%，有4000万以上的感染者。血源性传播是一种非常重要的传播途径，由于没有有效的预防性疫苗及有效的治疗手段，因此早期诊断及血液筛查对控制HCV的传播具有十分重要的作用。目前临床上HCV的诊断与筛查以检测HCV抗体为主，由于HCV抗体检测一般存在7-10周的窗口期，建立早期、简便、敏感、特异的HCV核心抗原诊断试剂，缩短检测的窗口期是降低HCV感染的有效途径。虽然RT-PCR可定性和定量的检出HCV RNA并有效的缩短窗口期，但因RT-PCR操作复杂，容易污染且价格昂贵，使之不能广泛应用。研发基于丙型肝炎核心抗原的单克隆抗体，对于早期检测丙型肝炎病毒感染，通过双抗体夹心ELISA筛选能高灵敏度检测丙型肝炎核心抗原，建立丙型肝炎核心抗原检测系统并结合检测血清丙型肝炎抗体，为抗原抗体联检应用打基础。虽然丙型肝炎核心抗原的高度保守性并兼有很强的免疫原性，但是丙型肝炎核心抗原蛋白需要宿主信号肽酶剪切其C端内信号肽序列从而加工形成成熟的核心抗原蛋白(p21)，因而造成通过基因工程尤其是原核表达出构像天然的丙型肝炎核心抗原蛋白变得异常困难。另外核心抗原蛋白极易与核酸和脂蛋结合，且其C端有很强的疏水性，也都为核心抗原蛋白的体外表达和纯化增加了难度。近年一些研究人员利用酵母和哺乳动物细胞成功表达了全长的核心抗原白(191aa，p23)，并发现p23可以被细胞的信号肽酶剪切形成成熟的p21蛋白，并可在体外自组装形成直径约35nm的核衣壳样颗粒(nucleocapsidelikeparticles, NLPs) 。有研究者发现利用E.coli表达丙型肝炎核心抗原N端前120个氨基酸，在一定条件下也可形成病毒样颗粒(VLPs, Virus Like Particles)。并且用该VLPs免疫小鼠、兔和山羊后会产生强且持久的体液和细胞免疫应答。由于通过真核途径大量表达并纯化HCV core重组抗原在方法上并不成熟，因此很多研究者选择用大肠杆菌系统表达核心抗原蛋白，并避开核心抗原蛋白C端信号肽部分的氨基酸。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明通过基因重组技术，分段克隆HCV核心抗原基因，表达并分离纯化HCV核心抗原的GST融合蛋白抗原，该抗原用于研制HCV诊断试剂盒，尤其是在免疫阶段，用于免疫产生具有更佳亲和力与识别特性的抗核心抗原抗体，用于早期HCV感染的HCV核心抗原的检测。因此，本发明的目的在于提供一种丙型肝炎病毒核心抗原的基因工程融合蛋白抗原及其制备方法和应用、编码该融合蛋白抗原的DNA分子、包含该DNA分子的表达载体，以及被该表达载体转化的原核宿主细胞。
本发明的目的是这样实现的:—种人丙型肝炎病毒核心抗原，它为多肽或蛋白分子，所述的多肽或蛋白分子的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 或 SEQ ID N0:5 所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。一种DNA分子，它编码上述的多肽或蛋白分子。在本发明的一个较佳的实施例中，上述的DNA分子编码所述多肽或蛋白分子的核苷酸序列如 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7,SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 9 或 SEQ ID NO: 10 所示。一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。一种原核宿主细胞，它被上述的表达载体转化。优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌。进一步优选地，所述的原核宿主细胞是大肠杆菌BL21。试验证明，上述的人丙型肝炎病毒核心抗原可以用于制备诊断丙型肝炎病毒的试剂或药物。一种制备上述人丙型肝炎病毒核心抗原的方法，包括如下步骤:(I)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列；(2)用步骤(I)所述的表达载体转化原核宿主细胞；(3)在适合所述的多肽或蛋白分子抗原表达的条件下培养步骤(2)所得的原核宿主细胞；(4)分离纯化获得所述的多肽或蛋白分子抗原。上述的制备方法，其中所述的表达载体为融合表达载体，表达的融合蛋白抗原具有正确折叠的结构，以可溶性的目标蛋白形式存在于胞质内，并且目标蛋白能够通过二步亲和层析法获得纯化蛋白。本发明采用一种全新的分段表达方式，并采用与GST蛋白融合在大肠杆菌中获得表达，且这种表达是可溶性蛋白，其蛋白结构以接近天然折叠方式，从而为HCV的基础研究及诊断试剂研制及应用打下了基础。与现有技术相比，本发明涉及的人丙型肝炎病毒核心抗原及其制备方法具有如下优点和显著的进步:(1)采用核心抗原基因的分段和全长分子克隆方法，获得的一组基因工程融合蛋白抗原；(2)采用GST融合表达技术，获得的融合蛋白抗原具有可溶性表达，其结构特征更接近天然蛋白的特点。
图1为丙型肝炎病毒核心抗原基因编码序列及引物配对组合示意图。图2为PCR产物克隆示意图。图3为融合表达载体pET41_HCVCorel91的构建示意图。
具体实施例方式本发明涉及的基因工程融合蛋白抗原的制备方法包括如下步骤:1、以含有HCV全长基因组DNA的质粒pM-HCV_Genomeo为模板，并用针对核心抗原基因各片段设计引物，进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离并胶回收相应的特异扩增基因产物，并亚克隆到pMD-18 (TaKRa，Inc)载体中，分别得到各个基因重组质粒。2、设计的引物如表I所示表1.丙型肝炎核心抗原基因各区段抗原引物序列设计表
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权利要求
1.一种人丙型肝炎病毒核心抗原，为多肽或蛋白分子，其特征在于:所述的多肽或蛋白分子的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4 或 SEQ IDN0:5所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
2.—种DNA分子，编码权利要求1所述的多肽或蛋白分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:它编码所述多肽或蛋白分子的核苷酸序列如 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 或 SEQ IDN0:10 所示。
4.一种表达载体，包含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。
5.一种原核宿主细胞,它被权利要求4所述的表达载体转化。
6.根据权利要求5所述的原核宿主细胞，其特征在于:它是大肠杆菌。
7.根据权利要求5所述的原核宿主细胞，其特征在于:它是大肠杆菌BL21。
8.权利要求1所述的人丙型肝炎病毒核心抗原在制备诊断丙型肝炎病毒的试剂或药物中的用途。
9.一种制备权利要求1所述人丙型肝炎病毒核心抗原的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求2所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列； (2)用步骤(I)所述的表达载体转化原核宿主细胞； (3)在适合所述的多肽或蛋白分子抗原表达的条件下培养步骤(2)所得的原核宿主细胞； (4)分离纯化获得所述的多肽或蛋白分子抗原。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:所述的表达载体为融合表达载体,该表达载体能表达具有正确折叠的， 可溶性的目标蛋白质，并且目标蛋白能够通过两步亲和层析得到有效纯化。
全文摘要
本发明公开了一种人丙型肝炎病毒核心抗原，利用这种抗原蛋白可应用于免疫产生针对丙型肝炎核心抗原的单克隆抗体。本发明采用基因工程方法研制重组融合蛋白可溶性抗原，特点是抗原具有相对完整的天然蛋白空间结构，在用于免疫产生抗核心抗原抗体上，具有较线性的合成肽抗原，抗体特异性高，对天然样品中的核心抗原特异性和亲和性更佳的特点。
文档编号C12R1/19GK103214561SQ201310078878
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者庄明强 申请人:浙江家和制药有限公司