玉米wrky基因内含子长度多态性分子标记的制作方法

专利名称：玉米wrky基因内含子长度多态性分子标记的制作方法
技术领域：
本发明 涉及生物基因工程技术和遗传育种领域，具体涉及到玉米WRKY基因内含子长度多态性分子标记。
背景技术：
玉米(Zea maize)是重要的粮食作物，在国民经济中发挥着重要作用。根据玉米种质的不同遗传背景，可以把我国玉米划分为旅大红骨(丹340)、唐四平头(黄早四)、Lancaster (M017)和Reid(B73)四个遗传类群，很多农业生产上推广使用的玉米杂交种都是由这四种不同类群种质杂交组配而来。玉米自交系黄早四、B73、Mol7、丹340分别属于唐四平头、ReicULancaster和旅大红骨类群，除具备各自代表类群的典型遗传特性，还具有高产、配合力高、抗病、对光周期不敏感等优异性状，是玉米遗传改良和育种过程中利用不同类群组配杂交种中的代表性骨干自交系，在玉米育种过程中应用最广泛。WRKY是一类转录因子，在植物中具有多个家族成员。很多WRKY基因和抗病、抗盐、抗旱、抗低温、抗高温等多种逆境胁迫有关。基因内含子是两个毗邻的外显子的一段非编码序列，由于进化时受到的选择压力较小，所以在长期的栽培环境条件下不同自交系间存在长度或核苷酸序列的差异。基因外显子核苷酸编码氨基酸，在进化过程中为保证基因正确行使功能受到选择压力大，在进化时受到过程中相对保守，在不同自交系间核苷酸长度及序列的变化都很小。根据这种特性可以将两个毗邻的外显子之间的内含子序列开发为分子标记。内含子长度多态性标记ILP (Intron length Polymorphism,简称ILP)是将功能基因(如WRKY基因)序列开发而成的一种分子标记，目前虽然已经有些基因通过ILP进行了开发，并应用于构建遗传连锁图谱，但迄今为止WRKY-1LP标记的开发及应用尚无报道。本发明通过对玉米WRKY基因的两个毗邻的外显子区域的序列设计ILP特异引物，即WRKY-1LP分子标记。在四个玉米类群的代表性骨干自交系中经过特殊PCR体系和反应条件，通过PCR扩增得到长度有差异的片度，电泳凝胶显示为不同玉米自交系的WRKY-1LP分子标记。这将为玉米WRKY基因的高效转育并改良普通玉米栽培品种提供了分子辅助选择基础。

发明内容
本发明的目的是提供玉米WRKY基因内含子长度多态性分子标记。根据本发明的玉米WRKY基因内含子长度多态性分子标记,包括:ZmffRKYl-1LP-Fl: 5，-GACATCCCTTCGGACGAGTA-3 ’ZmWRKYl-1LP-Rl: 5，-CCTCGTACGTCACCACCAG-3，；或ZmffRKY2-1LP-F2:5，-GCAAGTACGGCCAGAAGC-3，ZmffRKY2-1LP-R2:5，-ACGTGACGATCACCTTGTCC-3 ；或ZmffRKY3-1LP-F3:5，-GTACCGCTGGAGGAAGTACG-3'ZmWRKY3-1LP-R3:5，-CCCTCGTAGGTGGTGATGA-3，；或ZmffRKY4-1LP-F4:5，-GACAGCTGACGCTGAGAGACT-3，
ZmffRKY4-1LP-R4:5’ -GTAGGCGATGATCTCGGTGA-3’ ；或ZmffRKY5-1LP-F5:5，-GCTGAGCCTCACCTGTCG-3，ZmffRKY5-1LP-R5:5，-ACTCGTAGCCGTCGTCGTAG-3 ；或ZmffRKY6-1LP-F6:5，-CCTCCACCACCACTTCCAT-3，ZmWRKY6-1LP-R6:5，-CTTGTTGGCGATGATCGTG-3，；或ZmffRKY7-1LP-F7:5，-AGAGGCGACCATGGAGGT-3，ZmffRKY7-1LP-R7:5，-CATCCCTGGTCCTTGTGC-3，。根据本发明的WRKY基因内含子长度多态性分子标记,其中，基因ZmffRKYl (GRMZM2G071907)，位于玉米自交系 B73Chr2 的 11，677，947 到11，679，542，共 1596bp ；基因ZmWRKY2 (GRMZM2G040298)，位于玉米自交系 B73Chr3199, 190, 076 到199，191，712，共 1637bp ；基因ZmffRKY3 (GRMZM2G018721)，位于玉米自交系 B73Chr7 的 I, 923，404 到
I,925，109，共 1706bp ；基因ZmffRKY4 (GRMZM2G125653)，位于玉米自交系 B73Chr7 的 109，903，288 到109，905，118，共 1831bp ；基因ZmffRKY5 (GRMZM2G099593)，位于玉米自交系 B73Chr2 的 148，933，289 到148，934，702，共 1414bp ；基因ZmWRKY6(GRMZM2G151444)，位于玉米自交系 B73Chr3 的 9，028, 660 到9，036，594，共 7935bp ；基因ZmffRKY7 (GRMZM2G059562)，位于玉米自交系 B73Chr3 的 183，069，351 到183，070，645，共 1295bp。因此，根据本发明的技术方案，不仅能为构建玉米四个遗传群体间的遗传图谱提供了多态性分子标记，还能为玉米WRKY基因高效转育到栽培玉米背景中提供分子信息基础。通过本发明开发出特异扩增玉米WRKY基因的特异标记引物，能够应用普通PCR技术快速精确鉴定WRKY基因的在不同遗传群体玉米中的内含子长度多态性。为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下:(I)从MaizeGDB数据库中获得玉米WRKY基因相关序列，并对获得的序列进行鉴定，筛选两个毗邻的外显子(内含子序列较长)核苷酸序列进行深入分析；

(2)根据WRKY基因两个毗邻的外显子核苷酸序列设计若干WRKY-1LP特异引物；(3)将步骤(2)中获得WRKY-1LP特异引物对中国玉米四个遗传类群旅大红骨、唐四平头、Lancaster、Reid的代表骨干自交系丹340、黄早四、M017和B73进行扩增，并不断优化改进弓丨物，获得不同长度WRKY基因片段。验证WRKY-1LP引物在自交系丹340、黄早四、M017和B73中的特异性和稳定性，并确定针对不同引物的PCR扩增程序与反应体系。本发明的积极性效果及应用如下:1、本发明使用的PCR体系，不需要特殊的PCR仪器和特殊的反应试剂，普通商业公司生产的产品均能达到要求。2、本发明的PCR条件中对扩增效果影响最大的是特异引物的设计。本发明中所开发的WRKY-1LP特异分子标记均来自本发明所获得的WRKY基因片段，且用于扩增的特异标记引物PCR扩增片段在长度上差异较大，不会出现相互混淆或者干扰，可以保证结果准确。3、利用碱基特异性设计了 7对引物，结构简明，使用方便，且利用PCR技术检测快速高效，在短时间内能够精确鉴定不同来源的玉米自交系，效果快捷明显，有良好的推广前
景4、本发明所获得的玉米WRKY-1LP特异分子标记为玉米WRKY基因的高效转育并改良普通玉米栽培品种提供了分子辅助选择基础。


图1显示玉米ZmWRKY-1LP特异分子标记检测图谱，由左至右依次为1:ZmffRKYl-1LP特异分子标记检测图谱；2:玉米ZmWRKY2_ILP特异分子标记检测图谱；3:玉米ZmWRKY3-1LP特异分子标记检测图谱；4:玉米ZmWRKY4_ILP特异分子标记检测图谱；5:玉米ZmWRKY5-1LP特异分子标记检测图谱；6:玉米ZmWRKY6_ILP特异分子标记检测图谱；7:玉米ZmWRKY7-1LP特异分子标记检测图谱。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例1:1、基因组DNA提取采用CTAB法提取基因组DNA (自交系丹340、黄早四、M017和B73中)。2、WRKY-1LP特异弓丨物设计从MaizeGDB数据库中获得ZmWRKYl基因相关序列GRMZM2G071907，依据DNASTAR2.0软件序列比对结果，在ZmWRKYl基因毗邻的两个上下游外显子2和3分别设计引物，通过多次优化筛选获得上游ZmWRKYl-1LP-Fl和下游ZmWRKYl-1LP-Rl特异引物，由于WRKY基因内含子在长期进化过程中选择压力小，在不同遗传群体玉米自交系中存在长度差异。而外显子在进化过程中相对保守，在不同遗传群体的玉米自交系中编码区很保守，基本不存在编码序列长度差异，所以用某个WRKY基因的两个毗邻的外显子区域的序列设计引物，该特异引物即代表了某个特定WRKY基因的特异引物。电泳凝胶显示为不同玉米自交系的WRKY-1LP分子标记。该引物具体如下:ZmffRKYl-1LP-Fl: 5，-GACATCCCTTCGGACGAGTA-3 ’ZmffRKYl-1LP-Rl: 5，-CCTCGTACGTCACCACCAG-3，ZmffRKYl基因特异分子标记扩增:3.1PCR反应体系
权利要求
1.玉米WRKY基因内含子长度多态性分子标记，其特征在于，所述玉米WRKY基因内含子长度多态性分子标记包括:ZmffRKYl-1LP-Fl:5，-GACATCCCTTCGGACGAGTA-3， ZmWRKYl-1LP-Rl:5， -CCTCGTACGTCACCACCAG-3，；或 ZmffRKY2-1LP-F2:5，-GCAAGTACGGCCAGAAGC-3，ZmWRKY2-1LP-R2:5， -ACGTGACGATCACCTTGTCC-3 ;或ZmffRKY3-1LP-F3:5， -GTACCGCTGGAGGAAGTACG-3’ ZmffRKY3-1LP-R3:5，-CCCTCGTAGGTGGTGATGA-3，；或 ZmffRKY4-1LP-F4:5，-GACAGCTGACGCTGAGAGACT-3，ZmWRKY4-1LP-R4:5’ -GTAGGCGATGATCTCGGTGA-3’ ；或ZmffRKY5-1LP-F5:5，-GCTGAGCCTCACCTGTCG-3，ZmWRKY5-1LP-R5:5， -ACTCGTAGCCGTCGTCGTAG-3 ;或ZmffRKY6-1LP-F6:5，-CCTCCACCACCACTTCCAT-3，ZmffRKY6-1LP-R6:5，-CTTGTTGGCGATGATCGTG-3，；或 ZmffRKY7-1LP-F7:5，-AGAGGCGACCATGGAGGT-3，ZmffRKY7-1LP-R7:5， -CATCCCTGGTCCTTGTGC-3，。
全文摘要
本发明涉及生物基因工程技术和遗传育种领域，具体涉及到玉米WRKY基因内含子长度多态性分子标记。通过在WRKY基因两个毗邻的外显子区域设计引物，在不同类群的玉米自交系黄早四、B73、Mo17、丹340中经过PCR扩增后获得不同长度的DNA片段，并确定针对不同引物的PCR扩增程序与反应体系。本发明能够作为功能基因标记用于构建玉米的遗传连锁图谱，效果快捷明显，有良好的推广前景，为克隆玉米基因和QTL位点提供了分子辅助选择基础。
文档编号C12N15/11GK103160505SQ20131007878
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者张素芝, 荣廷昭, 潘光堂, 高世斌, 兰海, 邱林权, 刘海岚 申请人:四川农业大学