专利名称：甘露聚糖酶及其突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及甘露聚糖酶及其突变体，属于微生物工程技术领域。
背景技术：
β -1, 4-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)又称为甘露聚糖酶，它能水解含有β _1，4-D-甘露糖苷键，生成甘露寡糖或甘露多糖，属于半纤维素酶类。在自然界中，甘露聚糖是仅次于纤维素的第二大可再生的半纤维素碳水化合物，广泛存在于植物细胞壁，尤其是在豆科植物种子中，半乳糖-甘露聚糖含量高达干重的20%以上。同时，甘露聚糖的结构也有很多种，如半乳糖-甘露聚糖、葡萄糖-甘露聚糖和半乳糖-葡萄糖-甘露聚糖等。半 乳糖-甘露聚糖的结构是主链由β_1，4-D-甘露糖苷键连接而成的甘露聚糖，侧链则是α-1，6-半乳糖苷键连接的半乳糖。葡萄糖-甘露聚糖主链是由β-l，4-D-甘露糖苷键连接而成，但其主链上一些甘露糖被葡萄糖取代。半纤维素酶，包括甘露聚糖酶、木聚糖酶和葡聚糖酶等，广泛用于纤维素生产乙醇、食品、饲料和造纸等行业。饲用酶制剂要适应动物如猪和禽类等的消化道特点，需要具有耐酸性强，同时在ΡΗ6.(Γ7.0范围活性最强等特点。大豆柏是生产饲料的重要原料，如果在饲料中添加适量甘露聚糖酶，既能提高饲料的消化率，又能降低饲料成本(杨鸿昆等，2007，饲料研究；段蕾等，2008，饲料研究；范志恒，2008，饲料工业)。很多微生物能产甘露聚糖酶，包括曲霉，芽孢杆菌甚至是链霉菌等。但是，通过菌种的筛选和诱变选育的自然菌株所产的甘露聚糖酶的酶活水平< 100U/ml，往往不能满足工业生产的需要(杨文博，1995，微生物通报)。因此，克隆基因进行异源表达而获得高效表达工程菌是当前开发甘露聚糖酶的热点(丁宏标等，2006，畜牧与饲料；谭秀华等，2005，微生物学报)。作为饲料添加剂，寻找高酶活、耐酸和最适温度接近体温的甘露聚糖酶是当前研究的热点和难点。而蛋白质工程改造是获得理想蛋白的重要手段之一。定向进化是获得理想的饲用甘露聚糖酶的重要手段(毛绍名等，2007，微生物通报)。定向进化是利用随机突变而筛选大量突变体来获得目的蛋白，其工作量大，偶然性也非常大(张红缨等，1999，科学通报；许钦坤等，2005，生物技术通讯)。而理性设计虽然工作量相对较小，但是往往难于找到合适氨基酸位点进行突变改造(张秀艳等，2006，生物工程杂志；王凡业等，2006，应用化工)。本发明提供了 pH偏中性的甘露聚糖酶及其多个酶的突变体。这些突变体是从地衣芽孢杆菌的不同菌株中克隆得到，它们间不完全同源，同源性为99%。尽管这些突变体的同源性非常高，但是彼此间活性(比活)存在很大的差异。这说明这些突变/取代位点是影响其活性的关键位点，这为甘露聚糖酶的定向进化和理性设计通过提供了可供选择的关键位点和方向。
发明内容
本发明的目的是提供高酶活的甘露聚糖酶及其变体。本发明提供了新的重组甘露聚糖酶及其突变体，其中所述重组甘露聚糖酶的氨基酸序列:
(a)包含选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、、SEQ IDNO: 10或SEQ ID NO: 12其中之一；或者
(b)是在选自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、、SEQ IDNO: 10或SEQ ID NO: 12其中之一上取代、缺失或添加一个或数个氨基酸残基得到。在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。在一个实施方案 中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 4，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 3。在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 6，，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 5。在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 8，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 7。在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 10，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 9。在一个实施方案中，所述甘露糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 12，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 11。酶活实验结果表明:本发明提供的甘露聚糖酶具有良好的酶活。其中氨基酸为SEQID NO: 12的高比活甘露聚糖酶具有很好的稳定性。在701:、801:、851:和901:条件下水浴5分钟，分别还能保持90%、30%、20%和18%的酶活。最适pH分析显示，该酶在pH5.0-9.0范围内均有活性，且有2个最适pH作用峰，即pH6.5和pH8.5。另一方面，本发明还提供了一种制备重组甘露聚糖酶的方法，该方法包括:
Ca)提取地衣芽孢杆菌的基因组DNA ；
(b)以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；
(c)将PCR扩增产物克隆入表达载体；
Cd)用步骤(C)得到的重组表达载体转化表达宿主；
Ce)分离、鉴定并纯化表达产物。在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增使用的引物对为 Pl:GCACACACCGTTTCTCCGGTG，和
P2:CACGACAGGCGTCAAAGAATCG 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增条件为:95°C 4min ；94°C 30s ；55°C 40s, 72°C Imin 30 个循环；72°C 7min。在本发明的一个优选实施方案中，所述表达载体为pET28。在本发明的一个优选实施方案中，所述表达宿主为大肠杆菌BL21。
在本发明的具体实施方案中，所述扩增产物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9 和 SEQ ID NO: 11。在本发明的一个优选实施方案中，利用pPIC9K质粒构建了 SEQ ID NO: 11的重组表达载体，并转化毕赤酵母GSl 15菌株，获得了高效表达的毕赤酵母工程菌，为规模化的发酵和应用奠定了基础。本申请用生物软件DNAMAN6.0分析显示所述酶编码基因之间存在不同位点的不同程度突变。为研究这些突变对酶学活性的影响，分别将这些突变基因进行了重组表达。通过N1-agarose纯化重组蛋白并分析其酶学性质。酶学性质分析显示6个突变体的酶活(t匕活)存在明显的差异，说明这些位点氨基酸残基是影响甘露聚糖酶活性的关键位点。本发明提供了地衣芽孢杆菌6个甘露聚糖酶突变体基因及其相应的氨基酸序列。6个甘露聚糖酶氨基酸序列之间存在 20、27、31、48、64、78、81、89、102、105、122、123、179、187、195、234、248、254、255、292、302、312、313和325位点上存在突变。这些位点氨基酸残基的突变造成酶活的较大差异，这为甘露聚糖酶的理性设计和定向进化提供了参考。另一方面，本发明还提供了一种测定甘露聚糖酶测定方法，该方法包括:
以0.6%槐豆胶甘露聚糖(Sigma公司，Batch#125K0091)为底物。以0.1M醋酸-醋酸钠(pH5.5)为缓冲液，将甘露聚糖底物37°C平衡20min ;将待测酶液37°C平衡lOmin。取4支试管，分别加入酶液2ml，取其中3支作为测定管，分别加入2ml底物溶液，另一支作为空白管加入5ml DNS溶液，在37°C ±0.5°C水浴30分钟，三支测定管分别加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml，以空白管调零，在分光光度计540nn处测吸光度。酶活定义是在37°C pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生I μ mo I甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。蛋白含量测定参照Bradford法。
`图1图示的是用DNAMAN比对分析蛋白序列
图2图不的是Clustal X分析蛋白序列的系统发育 图3图示的是Man6酶学性质最适温度和pH分析 本发明优点:
从不同地衣芽孢杆菌菌株中克隆多个甘露聚糖酶基因的突变体，并分析甘露聚糖酶突变体酶学特性。这些甘露聚糖酶氨基酸序列同源性最高达99%以上，但是不同位点的突变取代造成了酶活性的明显差别。这为蛋白质的定向进化和蛋白质工程改造提供了选择位点，为选择高活性的甘露聚糖酶进行异源高效表达奠定基础实施例
以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1地衣芽孢杆菌甘露聚糖酶基因的克隆 1.1提取地衣芽孢杆菌不同菌株的总基因组DNA
将本实验室保存的6株地衣芽孢杆菌过夜培养，各取1.5ml，12000rpm离心I分钟，除上清；加入 200 μ I 裂解缓冲液(60mM Tris-HCl, pH7.8，20mM Na-Ac, ImM EDTA, 1.5%SDS)，用移液器剧烈吹打；加入66 μ I 5Μ高氯酸钠溶液混匀，12000rpm离心10分钟，取上清；加入等体积苯酚抽提一次，12000rpm离心2分钟，取上清；加入等体积异丙醇沉淀5分钟，12000rpm离心5分钟;70%乙醇洗涤两次；最后将干燥的DNA溶于ddH20。基因克隆
以1.1中提取的基因组总DNA为模板，分别利用引物对(GCACACACCGTTTCTCCGGTG和CACGACAGGCGTCAAAGAATCG)进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件为 95 °C 4min ；94°C 30S ；55 °C40S，72°C Imin 30个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。测序分析
将1.2中回收的扩增产物分别连接到pMD18 T-载体，相应的克隆载体分别命名为pMDT-Manl、pMDT-Man2、pMDT_Man3、pMDT_Man4、pMDT_Man5 和 pMDT_Man6 ;最后把阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果为:Manl、Man2、Man3、Man4、Man5、Man6的核苷酸序列分别为 SEQ ID NO: K SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ IDNO: 9和SEQ ID NO: 11。其编码蛋白的氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 12。实施例2甘露聚糖酶的序列分析
将测序结果在NCBI上BLAST比对分析显示这些序列与甘露聚糖酶基因高度同源。利用生物软件DNAMAN6.0分析核酸序列发现6个序列不是完全同源。把相应的核酸序列翻译为氨基酸序列，并分别命名为Manl、Man2、Man3、Man4、Man5和Man6。对氨基酸序列同源比对分析，结果显示以下一个位点或几个位点存在突变，S卩:20、27、31、48、64、78、81、89、102、105、122、123、179、187、195、234、248、254、255、292、302、312、313 和 325 位点。这些位点的氨基酸残基可能的取代是 Y20N，D27N，N31 S，L48 T，V64I，E78 K, V81D, S89R, R102Q, L105M,S122P, S123N, S179T, A187E, R195Q, H234Y, H248Y, D254E, Q255E, N292K, G302E, G312D,A313T，D325E，序列比对分析结果见图1。生物软件Clustal X分析蛋白的氨基酸序列的系统发育，6个突变体亲缘关系特别近，见图2。实施例3甘露聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达及纯化
分别以质粒 pMDT-Manl、pMDT_Man2、pMDT_Man3、pMDT_Man4、pMDT_Man5 和 pMDT_Man6为模板，利用引物(AGA化X^OiCACACACCGITTCTCCGGTG—Nhel 和 ACACTTG^CACGACAGGCGTCAAAGAATCG—Xhο I)进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件是 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S,72°CImin 30个循环；72°C 7min。扩增产物凝胶回收后，先进行MeI酶切，然后回收酶切产物进行通ol酶切。同样，对表达质粒pET28a也分别进行酶切和ZAoI酶切。用T4连接酶把双酶切产产物即克隆基因和表达载体4°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒分别命名为pET-Manl、pET-Man2、pET-Man3、pET-Man4、pET_Man5 和 pET_Man6。把阳性克隆菌落接种5ml LB培养基，37°C培养至0D600=0.3时加入ImM IPTG诱导表达4-5小时。离心收集表达细胞于_20°C冻存过夜，然后加入ImL裂解缓冲液(50 mMNaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)进行超声波破碎，不时进行显微镜观察，待细胞完全破碎后按照QIAGEN公司的N1-NTA SPIN试剂盒所提供的方法进行蛋白纯化回收。电泳结果显示回收得到相应的目的蛋白。实施例4酶学性质分析以0.6%槐豆胶甘露聚糖(Sigma公司，Batch#125K0091)为底物。测定在实施例3中所纯化的重组甘露聚糖酶的活性，步骤如下:以0.1M醋酸-醋酸钠(pH5.5)为缓冲液，将甘露聚糖底物37°C平衡20min ;将待测酶液37°C平衡IOmin。取4支试管，分别加入酶液2ml，取其中3支作为测定管，分别加入2ml底物溶液，另一支作为空白管加入5ml DNS溶液，在37°C ±0.5°C水浴30分钟，三支测定管分别加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml，以空白管调零，在分光光度计540nn处测吸光度。酶活定义是在37°C pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生I μ mo I甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。蛋白含量测定参照Bradford法。纯化蛋白酶活为5.5 5620IU/ml不等，比活测定为12 7020IU/mg不等。其中SEQID N0.4和SEQ ID N0.5编码的蛋白Man4和Man5活性极低。此外，还测定了 Man6在不同pH和温度条件下酶学活性，其中缓冲液分别是0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液(PH4.0、pH 5.0,pH 6.0),0.1M磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(ρΗ6.5、7.0,7.5、8.0)和0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(ρΗ8.5、9.0、10.0)。结果如图3所示，最适温度为50°C，在ρΗ6.5和ρΗ8.5是2个最适峰，而且在ρΗ6.0-7.0之间甘露聚
糖酶酶活很稳定。实施例5在毕赤酵母中的表达
5.1表达质粒pPIC-Man2的构建
设计引物 Man2-F 和 Man2-R (ATAG^/TTGCACACACCGITTCTCCGGTG [BcoRI]和 ATAGCG^^CACGACAGGCGTCAAAGAATCG {Not I])以质粒 pET_Man2 为模板，以 Man2_F 和 Man2_R 为引物进行 PCR 扩增。PCR 条件为:95°C 4min ；94°C 40s, 54°C 40s, 72°C lmin，共 30 个循环；72°C 7min。凝胶回收PCR产物，并以RI和Afoi I双酶切。同样，以RI和AfoiI双酶切PPIC9K，然后把两个 酶切产物连接过夜后导入大肠杆菌DH5 α，获得重组表达质粒pPIC-Man6o重组工程菌的构建
表达质粒pPIC-Man2用Sal I酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3 μ g/μ L浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，最后重悬于I mL预冷的电泳缓冲液中(含ImM MgC12,10mM HEPES, 250mM蔗糖，pH 7.8)。在80 μ L感受态细胞中加入5 μ L线性化重组质粒；电转化(条件为1500V、200 Ω、25 μ F);最后涂布于丽平板(丽培养基组分:1.34%ΥΝΒ, 4X 1(Γ5%生物素，0.5%甲醇)，挑选重组菌株。摇瓶诱导表达
将挑选工程菌接种于5ml BMGY ( I %酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 % YNB,4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基(1%酵母提取物，2%蛋白陈，1.34 % YNB, 4X10_5%生物素，0.5%甲醇)，每12小时补加50 μ L甲醇。酶活测定
不同时间取样测定上清酶活，结果显示其上清液最高酶活为600 IU/mL。
权利要求
1.重组甘露聚糖酶及其突变体，其中所述重组甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQID NO:12。
2.编码权利要求1所述甘露聚糖酶的DNA分子。
3.权利要求2所述的DNA分子，其核苷酸序列为SEQID NO: 11。
4.一种重组表达质粒，其中含有权利要求2或3所述的DNA分子。
5.—种表达宿主，其被权利要求4所述的重组表达质粒转化。
6.权利要求5所述的表达宿主,其选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、酵母或芽孢杆菌。
7.权利要求6所述的表达宿主，其中所述的酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。
8.权利要求6所述的表达宿主，其中所述的芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)。
全文摘要
本发明属于微生物工程技术领域。本发明提供了高酶活的甘露聚糖酶及其突变体。本发明提供了6个从地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)不同菌株中克隆得到的甘露聚糖酶基因及其编码的甘露聚糖酶，并通过生物信息学分析了6个突变体间的差异和亲缘关系。本发明提供的甘露聚糖酶在中性pH条件下具有高活性，其最适温度适中，可作为作饲用酶制剂。
文档编号C12N9/42GK103184206SQ201310077948
公开日2013年7月3日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者黄亦钧, 程斯达, 许韡, 王华明, 陈亮珍, 刘鲁民, 陈刚 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司