专利名称：用于甾体化合物a环1,2位脱氢的基因工程菌及发酵剂的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和微生物发酵领域，涉及用于留体类化合物高效转化(A环1，2位脱氢)的简单节杆菌，尤其是一种用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌及发酵剂。
背景技术：
留体类药物具有重要的生理活性，在临床上有广泛的应用，是仅次于抗生素的第二大类药物。醋酸可的松Cl，2位上导入双键后成醋酸泼尼松，抗炎作用能够提高3-4倍，并且减少由钠滞留而带来的副作用。目前留体药物生产中常用的方法有化学合成和微生物转化两种，化学方法进行Cl，2位脱氢一般采用二氧化硒法，该方法常使产品中带有少量难以除尽对人体有害的硒，微生物转化法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)的Cl, 2位脱氢反应是工业生产醋酸泼尼松及其同系物最有价值的一种反应，也是采用发酵法工业生产留类药物的典型代表。目前甾体微生物转化主要研究的领域主要在以下几个方面:提高水不溶性底物的溶解度，细胞和酶的固定化以利于酶的重复利用，发展经济有效的产物连续回收方式等用来提高产量，但是寻找、筛选更优良菌种来提高转化率才是更加长期有效的方法。目前国内在这步反应中仍在使用原始菌株，很少在分子水平上进行深入的探索，尚无基因工程菌研发成功，这也限制了国内留体药物生产的进一步发展。随着分子生物学的发展和人们对留体代谢机制研究的深入，基因工程菌在留体药物生产中必将得到广泛的应用。Choi 等(1995，Journal of bacteriology 1779 (5), 4152-4156)描述了简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)菌株中Cl，2位脱氢基因(KsdD)的基因序列、成功的将此基因异源表达于链霉菌并研究了此酶的性质，但并未对简单节杆菌本身进行分子改造，简单节杆菌本身的遗传背景不清楚 ，通过同源重组构建高效生物转化简单节杆菌还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌及发酵齐U，本发明通过基因工程技术，对简单节杆菌进行同源重组，利用质粒PXJM19上携带的氯霉素抗性基因的启动子启动A环1，2位脱氢酶目的基因转录，实现A环1，2位脱氢酶在出发菌中高水平表达。本发明的另一个目的是利用该工程菌株进行生物转化方法改进，使工程菌的转化效率达到最闻。本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌，所述基因工程菌的宿主菌为简单节杆菌(Arthrobacter Simplex),保藏编号为ACCC 12070,所述基因工程菌内含有如序列10所述的重组基因片段。
而且，所述基因工程菌的发酵底物包括醋酸可的松、含氟皮质激素、4-AD。而且，所述基因工程菌的培养基为:酵母提取物5wt%_8wt%、磷酸盐1.5wt%_3wt%、玉米楽.10wt%_15wt% 和葡萄糖 8wt%_12wt%。而且，所述基因工程菌采用分次补加底物、酒精、水的乳浊液的连续缓慢流加的发酵方法。用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌在发酵生产A环1，2位脱氢酶中的应用。一种留体化合物A环1，2位脱氢发酵剂，包括权利用于留体化合物A环1，2位脱
氢的基因工程菌。本发明的优点及有益效果如下:1、本发明构建的工程菌在含有酵母提取物(5%_8% )、磷酸盐(1.5%_3% )、玉米浆(10%-15%)和葡萄糖(8%-12%)等营养成分的基础上，通过恒温通气搅拌发酵，在留体化合物浓度不高于10% (g/L)时，采用一次加投留体化合物底物，在32 48小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上；在留体化合物浓度高于10%时，采用连续补加留体化合物底物的情况下，在60小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上。
2、本发明构建的菌株为进一步为通过分子手段改善生物转化制剂以及提高医药中间体和化学品的生物转化效率提供一种有效的方法，具有重要的实用意义。
图1为本发明中重组载体的构建过程；图2为本发明所构建载体pTY5PCR验证的核酸电泳图其中M:DNA Markerl、2均表示重组载体验证结果；图3为本发明所构建菌株中PCR验证的核酸电泳图其中M:DNA Marker K 2:同源重组成功，3:未被重组；图4为本发明所构建菌株中整合位点验证的核酸电泳图其中M:DNA Markerl:原始菌PCR验证结果2:重组菌PCR验证结果，目的基因正确的整合在相应的位置上。图5为本发明所构建菌株提取RNA结果；图6为本发明所构建菌株与原始菌不同时间段的目的基因转录水平比较结果，Oh(刚添加诱导物时)，IOh (诱导10小时)，20h (诱导20小时)48h (诱导48小时)。工程菌与原始菌在不同时间转录水平相比明显提高。图7为本发明所构建菌株与原始菌不同时间段转化醋酸可的松能力的比较，工程菌最终转化率提高了 15.67%左右。图8为本发明所构建菌株遗传稳定性验证结果，此法获得的同源重组菌具有较高的遗传稳定性。图9为本发明质粒命pTY2的结构示意图。具体的实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明在分析发现来源于(Corynebacterium glutamicum)的穿梭表达载体pXJM19 (1999,Biotechnology techniquesl3 (6)，437-441)能在简单节杆菌里复制表达的基础上，设计并构建了一株高效用于留体化合物A环1，2位脱氢的简单节杆菌工程菌的构建及其生物转化方法。在含有酵母提取物、磷酸盐、玉米浆和葡萄糖等营养成分的基础上，通过恒温通气搅拌发酵，在留体化合物浓度不高于10%(m/V)时，采用一次加投留体化合物底物，在32 48小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上；在留体化合物浓度高于10%时，采用连续补加留体化合物底物的情况下，在60小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上。本发明的出发菌株名为简单节杆菌(Arthrobacter Simplex),保藏编号为ACCC12070，是一种模式Cl，2位脱氢微生物，由于其发酵工业背景清楚，操作技术成熟等特点，已经广泛用于醋酸可的松Cl，2位脱氢等领域。一种用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌，其特征在于:所述工程菌的宿主菌为简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)，保藏编号为ACCC 12070，所述基因工程菌内含有如序列2所述的重组基因片段。处于对数期的细胞形态比较细长，呈杆状，随着培养时间延长，菌体逐渐变短变粗，开始时菌体形态比较整齐，衰老后则呈点状，属于革兰氏阳性菌，生长温度范围为16 45°C，本基因工程菌是上述简单节杆菌(ACCC 12070)通过同源重组将目的基因在氯霉素抗性基因的启动子控制下整合在简单节杆菌16S rDNA上而构建的。上述工程菌的构建及检测步骤为:一、以pXJM19上的Cm启动子作为目的基因KsdD的启动子，并以Cm作为筛选标记构建重组载体PTY5。二、重组载体ρΤΥ5通过Bam H I以及Hind III双酶切得到带有筛选标记Cm (氯霉素抗性基因)基因的重组片段。然后通过电转仪，将重组片段转入简单节杆菌中。重组片段在重组酶的作用下与基因组上的位点基因发生重组，从而将原来的基因置换下来。得到整合有目的基因的工程菌。三、通过荧光定量PCR测定工程菌在不同时间的目的基因转录水平。四、测定工程菌在甾体化合物浓度不高于10%(m/V)时，采用一次加投甾体化合物底物的转化能力。五、测定在留体化合物浓度高于10%时，采用连续补加留体化合物底物的情况下，工程菌的转化能力。六、测定工程菌的遗传稳定性。上述步骤的详细叙述如下:一、同源重组载体的构建、各基因的扩增(I) Cl, 2位脱氢基因(ksdD)的扩增首先，以简单节杆菌ACCC 12070基因组为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因 片段。所需要的引物如下:Pl 5' -CCCATCGATATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3' (ClaI)P2 5' - TGCTCTAGATCATCGCGCGTCCTCGG-3' (XbaI)反应体系为50 μ L,配比如下:IOXbuffer 5 μ L ；dNTP5 μ L ;上游引物Pl 2μ L ；
下游引物P2 2μ L ；模板2 μ L ;Taq 酶0.2 μ L ;ddH2033.8 μ L0PCR程序如下:95°C预变性 5min ;94°C变性45s ；62.5°C退火45s ;72°C延伸 lmin30s ;30个循环后72°C延伸 IOmin ;4°C保存。⑵简单节杆菌16S rDNA的基因扩增以简单节杆菌ACCC12070基因组为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段。所需要的引物如下:P3 5' -CGCGGATCCCTTACCATGCAAGTCGAGCG-3' (BamHI)P4 5' -CCCAAGCTTCCAACCTTTCGACGGCTCC-3' (HindIII)反应体系为50 μ L,配比如下:IOXbuffer 5 μ L ；dNTP5 μ L ;上游引物Ρ3 2·μ L ；下游引物Ρ4 2μ L ；模板2 μ L ;Taq 酶0.2 μ L ;ddH2033.8 μ L0PCR程序如下:95°C预变性 5min ;94°C变性 45s ;58°C退火 45s ;72°C延伸 lmin30s ；30 个循环后72°C延伸 IOmin ;4°C保存。⑶氯霉素抗性基因(Cm)的扩增以质粒PXJM19为模板进行PCR，再通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收得到目的基因片段。所需要的引物如下:P5 5' -GGCCACTAGTCGGGCGCCGGGGATCAGC-3/ (SpeI)P6 5' -GGACTAGTGCGCCCCGGGTTCGAAGGGCA-3/ (SpeI)反应体系为50 μ L,配比如下:IOXbuffer 5 μ L ；dNTP5 μ L ;上游引物Ρ3 2μ L ；下游引物Ρ4 2μ L ；质粒pXJM19 2 μ L ;Taq 酶0.2 μ L ;ddH2033.8 μ L0PCR程序如下:95°C预变性 5min ;94°C变性 45s ;60°C退火 45s ;72°C延伸 lmin30s ；30 个循环后72°C延伸 IOmin ;4°C保存。
二、打靶载体的构建如图1构建过程如下(I) pUC18经Bam H I及Hind III双酶切后连接16SrDNA基因后得到质粒pTYl。⑵根据NCBI (GenBank accession N0.AJ132968)查找Cm启动子和终止子序列，在启动子和终止子之间引入多克隆位点和组氨酸标签。具体序列见序列I。序列合成委托invitrogen公司，合成的质粒命名为pTY2,质粒见图9。⑶将氯霉素抗性基因用限制性内切酶SpeI酶切后连到ρΤΥ2的SpeI酶切位点上得到质粒ΡΤΥ3。⑷质粒ΡΤΥ3用限制性内切酶EcoRV酶切得到线性片段，将此线性片段连接在质粒PTYl得到质粒pTY4。(5)目的片段通过ClaI和XbaI双酶切与ρΤΥ4相连接得到重组载体ρΤΥ5。(6)用Bam H I及Hind III双酶切重组载体ρΤΥ5得到线性ρΤΥ5重组片段，ρΤΥ5重组片段的序列如序列2。重组质粒ρΤΥ5验证电泳图见图2。步骤⑴-(6)载体构建连接过程所用的连接酶均为T4DNA连接酶，连接体系为20 μ L，连接体系如下:目的基因:载体(摩尔浓度之比)=3:1-9:1，加入适量0.2ul连接酶混匀，在16° C下，过夜反应。三、ΡΤΥ5重组片段电转进简单节杆菌以及重组转化子的验证1.将冻存的简 单节杆菌ACCC12070感受态细胞在冰上溶化后，取50 μ L加入重组片段混合均匀，然后转移到冰预冷的电击杯中。使用高压脉冲电击转化电击该细胞混合物电脉冲结束后，迅速将细胞悬液转移到室温复苏培养基的EP管中，振荡培养一段时间，复苏后培养基连续稀释后取150 μ L涂布于含40 μ g/mL氯霉素的LB琼脂平板上在30°C培养箱里培养24小时获得单菌落，经以下验证成功后即为基因工程菌。2.重组转化子的验证⑴挑选抗性平板上的单菌落，接种于含40 μ g/mL氯霉素LB培养基中，32°C摇床培养24小时，提取基因组。(2) 0 验证，验证引物为？3、卩4。反应体系为20 μ L,配比如下:IOXbuffer 2 μ L ；dNTP2 μ L ;上游引物Ρ3 2μ L ；下游引物Ρ4 2μ L ；菌悬液2yL;Taq 酶0.2 μ L ;ddH209.8 μ L ；PCR程序如下:95°C预变性 5min ;94°C变性 45s ;61°C退火 45s ;72°C延伸 lmin30s ；30 个循环后72°C延伸 IOmin ;4°C保存。验证结果见图3。3.PCR进一步验证目的基因是否整合在相应位置
根据16S rDNA测定序列，根据16S rDNA非同源臂序列以及氯霉素基因序列设计验证引物。引物序列如下:P7 5' -ACCTTCCGGTACGGCTACCTTGT-3'P8 5' -GCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTG-3反应体系为20 μ L,配比如下:IOXbuffer 2 μ L ；dNTP2μ L ；上游引物Ρ3 2μ L ；
下游引物Ρ4 2μ L ；菌悬液2yL;Taq 酶0.2 μ L ;ddH209.8 μ L ；PCR程序如下:95°C预变性 5min ;94°C变性 45s ;57°C退火 45s ;72°C延伸 lmin30s ；30 个循环后72°C延伸 IOmin ;4°C保存。验证结果见图4。四、目的基因转录水平的测定1.原始菌和重组菌5%的接种量30°C (180rpm)震荡培养27小时后加诱导物，分别在诱导时、诱导后10小时、20小时、48小时获得。诱导物为醋酸可的松。2.样品RNA的提取实验试剂
TRIzol 试剂invitrogen
氯仿BBI
无水乙醇BBI
洗液 RWsangon
Rnase-free ddH20BBI
ΙΠ BBI
溶菌酶溶葡球菌酶BBI操作步骤(I)取 Iml 菌液 IOOOOrpm 离心 Imin,弃上清。(2)加ImllxTE吹打混匀使沉淀完全溶解，离心至9000rpm停，弃上清。(3)重复步骤2.
(4)加入溶菌酶(100mg/ml)和溶葡球菌酶(25mg/ml)各lOOul，震荡混匀。37°C 水浴 lh。(5)加入600ul Trizol充分震荡混匀，室温静置lOmin。(6)加入200ul氯仿，剧烈振荡15s,静置3min。(7) 4°C离心，12000rpmX IOmin,取上清至 Rnase-freel.5mlEP 管。
(8)再加入0.2ml无水乙醇,轻轻颠倒混勻，过柱吸附5min。(9) 4°C离心，IOOOOrpmX Imin，倒掉回收柱中的废液。(10)加 400ul 洗液 RW 于吸附柱上，静置 3min，4°C IOOOOrpm lmin，弃废液。(11)重复步骤 10。(12) 40C 12000rpm空甩3min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱转入一个新的Rnase-free 1.5mlEP管中，置于冰盒上风干15min。(13)加入 35ul Rnase-free ddH20,静置 5min。从冰盒中取出，4°C 12000rpm2min得到RNA溶液，RNA溶液于-70°C保存。RNA电泳检测结果见图5。3.反转录实验试剂和操作步骤BBI 第一链 cDNA 合成试剂盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)cDNA第一链合成(I)在0.2-ml PCR管中加入以下试剂:5 μ I total RNAI μ I Random Primer p(dN)6 (0.2 μ g/ μ I)
5 μ I Rnase-free ddH20(2)70° C 温浴 5min。(3)冰浴lOsec，离心加入下列试剂:
4.0μ -SliiReaction Buffer
2.0μ dNTP Mix UOmmol/L)
1.0μ I Rnase inhibitor C 20U/,ul)
2.0μ! AMV Reverse Transcriptase \ I OU/μΙ)
20.0μ! Total volume(4)37° C 温浴 5min。(5)42° C 温浴 60min。(6)70° C 温浴 lOmin。终止反应。(7)将上述溶液-20° C保存。4、荧光定量PCR检测(I)实验样本将cDNA样品稀释8倍作为模板上机检测。(2)实时定量PCR试验材料及仪器定量PCR 试剂:ABI SybrGreen PCR Master Mix (2X)定量PCR仪:ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪(3) PCR反应步骤配制反应混合液
权利要求
1.一种用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主菌为简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)，保藏编号为ACCC12070，所述基因工程菌内含有如序列10所述的重组基因片段。
2.根据权利要求I所述的用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的发酵底物包括醋酸可的松、含氟皮质激素、4-AD。
3.根据权利要求I所述的用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的培养基为酵母提取物5wt%-8wt%、磷酸盐I. 5wt%-3wt%、玉米浆10wt%-15wt% 和葡萄糖 8wt%_12wt%。
4.根据权利要求I所述的用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌采用分次补加底物、酒精、水的乳浊液的连续缓慢流加的发酵方法。
5.如权利要求I所述用于留体化合物A环1，2位脱氢的基因工程菌在发酵生产A环1，2位脱氢酶中的应用。
6.一种留体化合物A环1，2位脱氢发酵剂，其特征在于包括权利要求I所述的基因工程菌。
全文摘要
本发明涉及一种用于甾体化合物A环1,2位脱氢的基因工程菌及发酵剂，所述工程菌的宿主菌为简单节杆菌，保藏编号为ACCC 12070，所述基因工程菌内含有如序列2所述的重组基因片段，所述基因工程菌的发酵底物包括醋酸可的松、含氟皮质激素、4-AD。本发明构建的工程菌在含有酵母提取物、磷酸盐、玉米浆和葡萄糖等营养成分的基础上，通过恒温通气搅拌发酵，在甾体化合物浓度不高于10%(m/V)时，采用一次加投甾体化合物底物，在32～48小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上；在甾体化合物浓度高于10%时，采用连续补加甾体化合物底物的情况下，在60小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上。
文档编号C12R1/06GK103255095SQ20131007760
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者路福平, 田耀, 张会图, 刘晓光 申请人:天津科技大学