专利名称：：一种产热稳定性重组胰蛋白酶的酵母工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种产热稳定性重组胰蛋白酶的酵母工程菌及其应用，属于遗传工程领域。
背景技术：
：迄今为止，酶制剂已被广泛地应用于制革、食品、发酵和纺织等行业。酶在制革工业中的应用，最早仅限于酶脱毛和酶软化。随着科学技术的不断发展和进步，酶制剂在制革行业中的应用范围也不断拓展、扩大，逐渐应用于制革准备工段乃至整个制革过程。种种迹象表明，基于酶制剂的制革工艺方法的研究与开发，必将催生具有生态概念的制革新技术——生物制革。其中在制革工业中应用较为广泛且应用时间较长的是胰酶，胰酶是一类广泛应用于医药、食品、化工及制革等工业的混合酶制剂。胰酶最早是通过新鲜动物胰脏来制备，通过绞碎，配料，磨浆，消化，过滤，干燥，球磨等工艺制备成为胰酶原粉，随后加填充剂稀释成为不同酶活力标准的胰酶成品。动物源胰酶成分复杂，其中具有主要作用的是胰蛋白酶(EC3.4.21.4)，虽然胰酶制备简便，但是制备过程比较粗放，产品不同批次间质量参差不齐，品质难以控制，而对其进行精制则成本较大；另外动物源胰酶在皮革工业中存在生物安全性低和标准化困难的缺点；制革工业中常用的的酶为蛋白酶，蛋白酶种类可分为四大类:丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶类、天冬氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类，链霉菌属可以产生其中的除了半胱氨酸蛋白酶类的其他三类蛋白酶，已经发现了多种可产生蛋白酶的链霉菌，主要包括灰色链霉菌(Streptomycesgriseu)、变铅青链霉菌(S.lividans)、弗氏链霉菌(S.fradiae)和带小棒链霉菌(S.clavuligerus)等。通过对目前皮革工业中应用较为普遍的动物源胰酶与链霉菌属(Streptomyces)胰蛋白酶的理论比较,链霉菌源胰蛋白酶的酶活性质和作用方式均与动物源胰蛋白酶相同，而经过链霉菌胰蛋白酶氨基酸序列和胰蛋白酶基因结构的比较，发现链霉菌源胰蛋白酶的氨基酸序列和基因结构同动物源胰蛋白酶具有高度同源性，氨基酸序列相似度80.9%，酶基因序列相似度79.8%。然而，链霉菌源胰蛋白酶的生产却由于链霉菌的发酵周期长，野生菌表达酶活低，及胰蛋白酶基因表达调控复杂等因素而受到制约。对于动物源胰蛋白酶的重组基因工程菌的构建和表达研究较多，但是由于通过原核生物表达真核生物蛋白在转录和翻译的调节上存在差异，因此得到外源表达胰蛋白酶多数为包涵体蛋白，小鼠的胰蛋白酶编码基因同细菌碱性磷酸酶启动子(PhoA)在E.coli中进行融合表达，并且通过添加外源激酶激活胰蛋白酶原，实现了胰蛋白酶的外源表达，但是需要添加外源激酶激活，且产量较低，而链霉菌胰蛋白酶的活性表现不需要添加任何外源激酶，对于链霉菌胰蛋白酶的研究起始较早，但是其集中在酶学性质和生理生化特性方面的研究。对于链霉菌的胰蛋白酶的外源表达研究则主要集中在胰蛋白酶在不同的链霉菌宿主中表达的生理生化作用的研究，且链霉菌的发酵周期普遍较长，发酵控制等相对较为困难，并且链霉菌本身具有的蛋白质水解功能也会影响目的蛋白酶的产量。然而胰蛋白酶在实际应用中的作用温度通常为37°C，在此条件下，胰蛋白酶具有较高的酶催化效率，但会由于热力因素导致其缓慢失活，而导致其效力下降。而目前针对胰蛋白酶的热稳定性改造尚未有报道，但是近些年国内外有较多的N端融合短肽来改善酶热稳定性的报道，比如在酶的N端融合双亲短肽可以明显提高RNaseHI的热稳定性。据此，对链霉菌胰蛋白酶进行重组改造，通过融合人工设计双亲短肽来实现链霉菌胰蛋白酶的热稳定性改造，并且进行热稳定性提高的重组链霉菌胰蛋白酶基因工程菌的构建，来实现链霉菌胰蛋白酶的外源表达，及提高重组菌胰蛋白酶的表达量。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种产热稳定性重组胰蛋白酶(thermostabletrypsin,EC3.4.21.4)的酵母工程菌，表达热稳定性提高的的重组胰蛋白酶编码基因(Exmt)ο所述热稳定性提高的胰蛋白酶(thermostabletrypsin)基因(Exmt)的序列为SEQIDNO:1所示。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种类胰蛋白酶酵母工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，所采用的技术方案包括如下具体步骤，见图1:第一步热稳定性提高的胰蛋白酶基因的获得及分析首先，对灰色链霉菌(Streptomycesgriseu)[StreptomycesgriseusubspgriseusATCC10137，2010年5月26日购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)]，对其类胰蛋白酶基因进行PCR扩增及测序，其次，毕赤酵母(Pichiapastoris)的表达系统有着特殊的密码子偏好性，如果不对类胰蛋白酶基因要表达的密码子的进行一定的分析，毕赤酵母(Pichiapastoris)可能无法正确翻译类胰蛋白酶基因。通过类胰蛋白酶基因在毕赤酵母中进行表达的密码子适用指数(CAI)分析，发现在类胰蛋白酶基因中并无毕赤酵母无法识别及利用的稀有密码子，其次，在进行PCR扩增所得胰蛋白酶基因，并在其上游利用融合PCR技术融合进去多肽编码基因Ex(TACGTTGAATTT)，并在此片段上游再次融合毕赤酵母(Pichiapastoris)a-factor信号肽，同时在最终融合长片段上下游分别加入BamHI限制性内切酶位点和NotI限制性内切酶位点，进而获得编码热稳定性提高的胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列为:SEQIDNO:1；第二步热稳定性提高的胰蛋白酶重组质粒的构建为了使Exmt基因能在酵母中的可控高效表达，选用带有醇氧化酶基因(AOX)的启动子AOXI的毕赤酵母表达载体(例如pPIC9K，美国Invitrogen公司)，利用PCR技术扩增得到胰蛋白酶编码基因mt(所述类胰蛋白酶的基因的核苷酸序列为:SEQIDNO:1),结合融合PCR技术，在mt基因的5’端人为添加多肽Tyr-Val-Glu-Phe的编码序列Ex(TACGTTGAATTT)(所述类胰蛋白酶的基因的核苷酸序列为:SEQIDNO:1),得到融合后的基因Exmt,再次利用融合PCR技术在其5’端融合Saccharomycescerevisiaea-factor信号肽，得到亚克隆片段a-factorsignalpeptide+Exmt,之后将亚克隆片段利用BamHI和NotI酶切亚克隆至表达载体pPIC9K。由于在AOXI强启动子后面有一段α-因子信号肽序列，这也为类胰蛋白酶在酵母中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于PPIC9K载体中含有卡那霉素、氨苄青霉素抗性基因，在筛选重组菌时较为方便。第三步热稳定性提高的胰蛋白酶基因工程菌的构建将重组质粒pPIC9K-Exmt电击转化宿主毕赤酵母GSl15，构建高效表达类胰蛋白酶的组成型毕赤酵母重组菌株。本步骤采用的热稳定性提高的胰蛋白酶基因的重组表达质粒pPIC9K-Exmt可转化毕赤酵母(Pichiapastoris),成为能分泌表达外源胰蛋白酶的功能酵母菌:由于含外源基因的重组表达质粒pPIC9K-Exmt上有毕赤酵母AOX基因的部分序列，当重组表达质粒进入酵母细胞后，通过体内同源重组，pPIC9K-Exmt可以定向整合到毕赤酵母染色体DNA上。在外源诱导物甲醇存在的情况下，AOXI启动子启动外源Exmt基因，信号肽指导表达产物进入毕赤酵母的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。毕赤酵母的转化常采用电激法或化学转化法:首先接种活化后的毕赤酵母GS115一环于25mLYPD液体培养基中，28°C30°C振荡培养过夜，然后将上述培养液转入IOOmLYPD(500mL三角瓶)液体培养基中，28°C30°C振荡培养，每隔Ih测定，培养直至菌体浓度OD6tltl为1.31.5，在冰水中冷却IOmin以上，然后在4°C环境下，8000r/min离心收集菌体，用40mL预冷的无菌水悬浮细胞，在冷水中放置lOmin，如此重复步骤4三次，即无菌水洗涤3次,用300μL预冷lmol/L山梨醇悬浮细胞,从而获得受体菌。然后取5080μL受体菌和590μg线性化重组表达质粒DNA混匀，电击(电压:1500V:电容:25yF;电阻:200Ω)处理，然后涂布于卡那霉素(10μg/mL)抗性平板筛选重组子，对阳性转化子进行PCR验证。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产热稳定性提高的胰蛋白酶的方法，具体方法如下:接种一环上述酵母工程菌入250mL三角瓶，装液量50mL的种子培养基，培养温度28°C30°C，摇床转速200r/min，培养24h;离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL发酵培养基的三角瓶(500mL)中，发酵温度30°C，摇床转速200r/min,发酵时间:34天。培养基组成(g/L):种子培养基:蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5_15；优化种子培养基为:蛋白胨15，酵母提取物8，葡萄糖15，氯化钠10；发酵培养基:酵母氮源基础培养基1215，生物素0.00020.0005,甲醇1050;微量元素溶液，MnSO4.4H20100,ZnCl270,Na2MoO4.2H2035,H3B0360,CoCl2.6H20200,CuSO4.5H2029,NiCl2.6H2025,37%盐酸0.9mL。胰蛋白酶酶活测定方法:胰蛋白酶能够选择性的切断赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，利用人工合成的具有上述肽链的N°-苯甲酰-DL-精氨酸-对-硝基苯酰胺(ΒΑΡΝΑ)作为底物，在410nm下测定类胰蛋白酶催化ΒΑΡΝΑ的产物对硝基苯胺的吸光系数，利用吸光系数在IOmin内的变化率来反映类胰蛋白酶的酶活大小。酶活定义为:在25°C下，每水解Iyg的BAPNA所需的类胰蛋白酶的量，即为类胰蛋白酶的I个BAPNA水解单位。具体测定方法为:将43.5mgBAPNA先溶解于ImL二甲基甲酰胺中，之后再将该混合体系溶解于pH8.0的，含有IOmMCaCL2的50mMTris-HCL缓冲液中，此即为类胰蛋白酶的底物溶液，测定过程为:在25°C下，测定10μL粗酶液同990μLΒΑΡΝΑ溶液在光径Icm的反应池中，在410nm下IOmin内的吸光值变化，得到AA4icinmAiin，之后利用下面的公式计算得到粗酶液酶活:权利要求1.一种产热稳定性重组胰蛋白酶的酵母工程菌及其应用，其特征在于采用毕赤酵母宿主(Pichiapastoris)GS115为宿主，表达重组胰蛋白酶基因，所述重组胰蛋白酶基因核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。2.权利要求1所述酵母工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤为:1)热稳定性提闻的重组膜蛋白酶基因的获得利用融合PCR技术或化学全合成的方法，将人工设计前导肽Ex核苷酸序列和灰色链霉菌(Streptomycesgriseu)胰蛋白酶编码基因mt进行融合，并将连接至pMD19Tsimple载体中；所述前导肽Ex核苷酸序列为TACGTTGAATTT；2)融合前导肽的重组酶表达质粒的构建利用融合PCR技术在其5’端融合Saccharomycescerevisiaea-factor信号肽，得到亚克隆片段a-factorsignalpeptide+Exmt,之后将亚克隆片段利用BamHI和NotI酶切亚克隆至表达载体PPIC9K,获得重组表达质粒pPIC9K_a-factorsignalpeptide+Exmt；3)融合双亲短肽的重组酶表达菌株的构建将重组质粒pPIC9K_a-factorsignalpeptide+Exmt转化宿主毕赤酵母宿主(Pichiapastoris)GS115。3.一种应用权利要求1所述所述酵母工程菌发酵生产重组胰蛋白酶的方法，其特征在于以权利要求1所述的酵母工程菌为生产菌株，接种一环转化子入250mL三角瓶，装液量50mL的种子培养基，培养温度28°C30°C，摇床转速200r/min，培养24h;离心，收集种子，用无菌生理盐水洗涤两次，按10%的接种量接入装液量为50mL发酵培养基的三角瓶中，发酵温度30°C，摇床转速200r/min，发酵时间:34天。4.权利要求3所述的方法，其特征在于所述种子培养基IL组成为:蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化钠5-15。5.权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基IL组成为:酵母氮源基础培养基1215，生物素0.00020.0005,甲醇1050;微量元素溶液，MnSO4.4H20100,ZnCl270,Na2MoO4.2H2035,H3B0360,CoCl2.6H20200,CuSO4.5H2029,NiCl2.6H2025，37%盐酸0.9mL。全文摘要本发明公开了一种产热稳定性重组胰蛋白酶的酵母工程菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明通过将体外扩增所得的胰蛋白酶基因融合前导短肽YVEF，并将其整合连接到毕赤酵母GS115(Pichiapastoris)染色体上，构建了一株高效分泌表达重组胰蛋白酶的价目工程菌，纯化后得到热稳定提高的重组胰蛋白酶，在40℃、50℃和60℃下，热稳定性分别比野生胰蛋白酶提高了1.77,2.6和31倍的重组胰蛋白酶，解决了胰蛋白酶热稳定性低的问题。应用该菌种生产胰蛋白酶，产量相对较高、工艺相对简单、所使用工程菌株遗传及应用背景清晰，便于工业化应用。文档编号C12N1/19GK103173367SQ201310076829公开日2013年6月26日申请日期2013年3月11日优先权日2013年3月11日发明者陈坚,令桢民,马腾博,堵国成,康振,李江华申请人:江南大学