重组酵母转化体和用其制备免疫球蛋白Fc片段的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重组酵母转化体、和用其制备免疫球蛋白Fc片段的方法。更具体地， 本发明涉及通过将包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸的表达载体导入毕赤酵母属 (Pichia sp.)酵母制备的转化体；生产免疫球蛋白Fc片段的方法，包括培养转化体和从培 养物回收免疫球蛋白Fc片段；和通过上述方法制备的免疫球蛋白Fc片段，用作药物载体。
【背景技术】
[0002] 随着生物工程和生物技术的进步，已研发出许多生物活性多肽（蛋白质）和肽药 物作为多种疾病的治疗选择。然而，由于其低稳定性，这种多肽或肽药物容易变性，因此非 常容易被肾或肝清除。因此，包括多肽作为医学活性成分的蛋白质药物具有必须频繁给予 患者以维持其适当血清水平和效价的缺点。因此研发能够在不频繁给予的情况下在体内维 持适当水平的蛋白质药物至关重要。
[0003] 为解决这些问题，很多尝试致力于提高蛋白质药物的血清稳定性和长时间维持血 液高药物浓度水平以最大化药物的药效，因此已尝试与其它蛋白质或结合聚合物融合，提 高蛋白质配制的变化。近年来最好的方法其中之一致力于免疫球蛋白与蛋白质的融合。
[0004] 已做出很多尝试来通过利用免疫球蛋白和其片段增加蛋白质药物的稳定性，如美 国专利号5, 045, 312所述，其中人生长激素通过交联剂缀合至牛血清白蛋白或小鼠免疫球 蛋白。缀合物与无修饰的生长激素相比具有增强的活性。还制备了其它多种在使免疫球蛋 白的Fc片段连接至干扰素（韩国专利公开号10-2003-0009464)、白介素-4受体、白介素-7 受体或促红细胞生成素（韩国专利号10-249572)后在哺乳动物体内表达的融合蛋白。PCT 专利公开号W0 01/03737公开了一种融合蛋白，其中细胞因子或生长因子通过寡肽连接物 连接至免疫球蛋白的Fc片段。而且，美国专利号5, 116, 964描述了利用基因重组技术融合 至免疫球蛋白Fc片段的氨基或羧基端的蛋白质。美国专利号5, 349, 053公开了其中IL-2 通过肽连接物连接至免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。
[0005] 很多其它利用基因重组技术构建的Fc融合蛋白已被公开，其实例包括免疫球蛋 白Fc片段与干扰素或其衍生物的融合蛋白（PCT专利公开号W0 00/23472)、和免疫球 蛋白Fc片段与IL-5受体的融合蛋白（美国专利号5, 712, 121)。进一步，免疫球蛋白Fc片 段已被用作载体，而非融合配体，如美国专利号7, 736, 653公开。
[0006] 免疫球蛋白或免疫球蛋白Fc片段的生产主要在大肠杆菌（E.coli)中进行。 美国公司AmgenInc.在美国专利号6, 660, 843和美国专利公开号2004-0044188和 2004-0053845中描述了一种人IgGIFc衍生物，其铰链区前五个氨基酸残基的氨基酸被删 除，其融合至治疗蛋白或肽模拟治疗蛋白的氨基或羧基末端；和其利用大肠杆菌宿主的生 产。然而，这种不具有信号序列的融合蛋白作为包含体表达，因此一定会经历额外的重折叠 过程。这种蛋白质重折叠过程降低产率，特别在作为同质二聚体或异质二聚体存在的蛋白 质中，明显减少二聚体产量。而且，当不具有信号序列的蛋白质在大肠杆菌中表达时，基于 大肠杆菌蛋白质表达系统的特点，甲硫氨酸残基添加至表达产物的N端。上述AmgenInc. 的表达产物具有N端甲硫氨酸残基，其在反复或过度给予身体时可引起免疫应答。而且，由 于通过将编码治疗蛋白的基因连接至Fc基因来在大肠杆菌中以融合蛋白形式表达这些融 合分子，其难以在大肠杆菌中表达，并且治疗蛋白难以在大肠杆菌中生成一一如果其以融 合形式在大肠杆菌中表达导致活性显著减少或丧失。进一步，由于两种分子的融合在两种 蛋白质之间的连接区产生非天然存在的异常氨基酸序列，该融合蛋白可能被免疫系统认作 外源物质，因此引起免疫应答。
[0007] 如上所述，使用大肠杆菌的优势之处在于治疗有效的蛋白质可以基于大肠杆菌的 快生长速率以及发酵和生物工程的积累技术以非糖基化形式以高产率表达，但劣势之处在 于重组蛋白与天然蛋白相比具有甲硫氨酸作为第一个氨基端残基，并且考虑到大肠杆菌衍 生的热原（内毒素）的去除和蛋白质重折叠，需要复杂的纯化过程。
[0008] 另一方面，使用动物细胞有利的是生产的融合蛋白是与天然免疫球蛋白形式同类 的糖基化蛋白质，但不利的是具有高生产成本，并且非常容易被动物衍生的病毒或蛋白质 污染。因此，对上述问题解决方案的需求正在增加。推荐利用同时具有大肠杆菌和动物细 胞作为宿主细胞的优势的酵母的策略。
[0009] 酵母中用于蛋白质生产的代表是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。除对 人体安全外，真核生物酿酒酵母还容易遗传操纵和大规模培养。而且，真核生物的多种表 达系统已被建立。在利用重组方法生产高级细胞衍生的蛋白质如人蛋白质时，这种微生物 另外提供给蛋白质在细胞外分泌和翻译后修饰（如通过糖基化）的能力。另外，酵母的重 组蛋白在分泌信号驱动的胞外分泌期间进行折叠、和二硫键形成、糖基化，因此演变成完全 生物活性形式。酵母还在经济上有利，因为其不需要低效率细胞溶解和蛋白质重折叠。然 而，酿酒酵母的蛋白质分泌系统已显示的问题是，根据人蛋白质种类，分泌速率有很大差 异。通常，作为高价值人用药物使用的蛋白质难以在酿酒酵母中表达和分泌（韩国专利号 10-0798894)。
[0010] 发明的公开内容
[0011] 技术问题
[0012] 关于本发明，发明人进行的关于酵母在生产蛋白质用于人用药物中的应用的大量 且全面的研究导致如下发现：毕赤酵母属酵母，一种甲醇营养型酵母物种，可用于在无额外 重折叠过程也无用额外氨基酸进行N端修饰的情况下以高表达水平生产可用作药物载体 的分泌型免疫球蛋白Fc片段，并且分泌型免疫球蛋白Fc片段可用简单方法纯化，具有最低 负载（load)的内毒素或动物衍生型外源病原。
[0013] 问题的解决方案
[0014] 本发明的一个目的是提供转化体，其通过将包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多 核苷酸的表达载体导入毕赤酵母属酵母来制备。
[0015] 本发明的另一目的是提供生产免疫球蛋白Fc片段的方法，包括培养转化体，和从 培养物回收免疫球蛋白Fc片段。
[0016] 本发明的进一步目的是提供通过该方法生产的免疫球蛋白Fc片段，用作药物载 体。
[0017] 发明的有益效果
[0018]本发明的重组转化体可克服与大肠杆菌或动物细胞在生产免疫球蛋白Fc片段时 用作宿主细胞相关的问题，可用作药物载体，并且可在药物的高效和经济生产中得到应用。
[0019] 附图简述
[0020] 图1是示例重组表达载体pPIC9K_IgG4Fc的构建方法的示意图。
[0021] 图2是示例重组表达载体pPIC9K-mPSCFc的构建方法的示意图。
[0022] 图3是显示目标基因通过3mg/ml和4mg/ml遗传霉素（Geneticin)整合入选定的 多拷贝克隆基因组DNA的PCR图。
[0023] 实施发明的最佳方式
[0024] 在这方面的一个实施方式中，本发明涉及通过将包括编码人免疫球蛋白Fc片段 的多核苷酸的表达载体导入毕赤酵母属酵母而修饰的转化体。
[0025] 如本文所用，术语"免疫球蛋白"，也被称为"抗体"，指代由免疫系统响应抗原刺激 生成并且在警戒（vigilance)期间通过血液和淋巴特异性地结合至具体抗原以发生抗原 抗体反应的蛋白质。免疫球蛋白基本上由两条相同的全长轻链和两条相同的全长重链组 成，重链之间以及重链和轻链之间通过二硫键连接。重链基于其恒定区氨基酸序列的差异 具有五种不同类型：gamma( y )、mu ( y )、alpha( a )、delta( 5 )和 epsilon ( e )，并且重链 包括下列子类：ga_a 1 ( y 1)、ga_a 2 ( y 2)、ga_a 3 ( y 3)、ga_a 4 ( y 4)、alpha 1 ( a 1) 和alpha 2(a2)。根据重链恒定区的特征，免疫球蛋白分成五种同种型：IgG、IgA、IgD、IgE 和IgM。代表性同种型IgG进一步分成IgGl、IgG2、IgG3和IgG