QIDN0:5)被设计以包含SnaBI限制性位点，用于融合至a 因子分泌信号序列，同时反向引物（SEQIDN0:4)被配置以具有EcoRI限制性位点。利用 这些引物通过PCR扩增编码免疫球蛋白G4Fc片段的DNA。PCR进行30次下列循环：在95°C 下变性40sec，在60°C下退火30sec，和在68°C下延伸50sec。
[0061] 5'-GCTTACGTACCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCC-3'（SEQIDN0:5)
[0062] 将由此获得的免疫球蛋白G4Fc片段DNA (ca. 680bp)克隆到pPIC9K载体 (Invitrogen)中。为与a因子分泌信号序列同在框架内，将免疫球蛋白G4Fc片段的PCR 产物用限制性酶SnalB I和EcoR I消化，然后在T4连接酶存在的情况下连接至之前用相 同限制性酶处理过的PPIC9K载体。所得重组表达载体包含紧邻a因子分泌信号序列下游 的免疫球蛋白G4Fc基因，但通过正向引物表示的SnB I识别位点也留在了载体上，使得免 疫球蛋白G4Fc片段，若由该载体表达，在N端会具有不期望的两个氨基酸残基。为删除插 入a因子分泌信号序列和免疫球蛋白G4Fc基因之间的接合处的SnaB I识别位点，利用由 SEQ ID N0S:8和9表示的引物对进行定点突变，所得表达载体被命名为pPIC9K-mPSCFc(图 2) 〇
[0063] 5'-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCCATCATGCCCAGCACCTGAG TTCCTG-3' （SEQ ID NO: 8)
[0064] 5'-CAGGAACTCAGGTGCTGGGCATGATGGAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG AGAGA-3' （SEQ ID NO: 9)
[0065] 图2是示例构建重组表达载体pPIC9K-mPSCFc的方法的示意图。如图2可见， pPIC9K-mPSCFc表达载体包含在5'醇氧化酶1(A0X1)基因启动子的控制下的SEQ ID N0:2 的DNA，并且可通过位于免疫球蛋白G4Fc基因下游的3'醇氧化酶1 (A0X1)基因整合到宿主 细胞的基因组DNA。用该表达载体转化的宿主细胞可通过a因子分泌信号序列驱动，将缺 少部分铰链区的免疫球蛋白Fc片段分泌至培养基。
[0066]实施例3 :转化巴斯德毕赤酵母和诜择多拷贝克降
[0067] 为用于稳定转化和基因组DNA整合，通过用限制性酶Sail消化，使分别在实施例1 和2中获得的重组载体pPIC9K-IgG4Fc和pPIC9K-mPSCFc线性化。线性化的重组IgG Fc片 段表达载体被设计以通过与宿主的醇氧化酶基因位点重组而整合到宿主的基因组DNA中。 巴斯德毕赤酵母KM71和GS115用作所要用实施例1和2获得的重组表达载体转化的宿主。 转化通过电穿孔实施，电穿孔已知最普遍和最有效用于酵母。为用于转化，根据Invitrogen USA提供的方案制备巴斯德毕赤酵母KM71和GS115的球形体。
[0068] 将10ug各线性化的重组载体与80ul的KM 71或GS115球形体充分混合，然后 将混合物在冰上的0. 2cm-缺口-电击杯中培育5min。然后，在Gene Pulser电穿孔装置 (BI〇-Rad)中向电击杯施加2000￥，20(^，251^的电击，以引起转化。反应混合物中加入 lml的1M冷山梨醇，并散布在MD (最小葡萄糖）琼指平板上，然后将该平板在28°C下培育 3天，选择His+阳性转化体。为辨识多拷贝克隆，将MD琼指平板上形成的每种His+阳性 转化体均匀地悬浮于lml无菌蒸馏水中，并将相当于105细胞的量的悬浮液散布在包含不 同遗传霉素浓度（〇. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0mg/ml)的YH)琼指平板上，然后在28°C下培育5 天。将由此选择的抗遗传霉素的多拷贝克隆--包含3. 0mg/ml和4. 0mg/ml的YH)琼指平 板上形成的菌落一一进行菌落PCR，以检测免疫球蛋白片段基因是否整合到了基因组DNA。 简而言之，PCR利用SEQ ID N0S:3和4的引物对来检测免疫球蛋白Fc片段基因的整合，和 SEQ ID N0S:5和4的引物对来检测编码缺少部分铰链区的免疫球蛋白Fc片段的基因的整 合。PCR进行30次下列循环：在95°C下变性40sec，在60°C下退火30sec，和在68°C下延伸 50sec (图3)。图3是显示目标基因在通过3mg/ml和4mg/ml遗传霉素选择的多拷贝克隆 的基因组DNA中的整合的PCR图。如图3可见，PCR证实免疫球蛋白Fc片段基因整合到宿 主细胞的基因组。
[0069] 通过用携带各自的免疫球蛋白Fc片段基因的表达载体pPIC9K_IgG4Fc和 pPIC9K-mPSCFc转化巴斯德毕赤酵母菌株而制备的转化体被命名为"巴斯德毕赤酵母 (Komagataella)HMC041"和"巴斯德毕赤酵母（Komagataella)HMC042"，并且分别于 2013 年 1月7日和2013年1月10日分别以登录号KCCM11348P和KCCM11350P保藏于韩国微生物 保藏中心（地址在 361_221，Hongje-ldong，Seodaemungu，Seoul) 〇
[0070] 虽然以示例为目的公开本发明的优选实施方式，但本领域技术人员会理解各种没 有脱离如所附权利要求公开的本发明的范围和精神的改进、增加和取代都是可以的。
[0071]
[0072]
【主权项】
1. 转化体，其通过将表达载体导入毕赤酵母属（Pichia sp.)酵母中而修饰，所述表达 载体包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸。2. 权利要求1所述的转化体，其中所述毕赤酵母属酵母是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)〇3. 权利要求1所述的转化体，其中所述免疫球蛋白是IgG。4. 权利要求3所述的转化体，其中所述IgG是IgGU IgG2、IgG3或IgG4。5. 权利要求1所述的转化体，其中所述免疫球蛋白Fe片段包括由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO: 11表示的氨基酸序列。6. 权利要求1所述的转化体，其中所述多核苷酸包括由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2 表示的核苷酸序列。7. 权利要求1所述的转化体，其中所述表达载体是由图1的切割图表示的 pPIC9K-IgG4Fc、或由图2的切割图表示的pPIC9K-mPSCFc。8. 权利要求1所述的转化体，其是巴斯德毕赤酵母（Komagataella)HMC041 (登录号 KCCM11348P)或巴斯德毕赤酵母（Komagataella)HMC042(登录号 KCCM11350P)。9. 生产免疫球蛋白Fc片段的方法，包括： (a) 培养权利要求1至8中任一项所述的转化体；和 (b) 从培养物回收所述免疫球蛋白Fc片段。10. 由权利要求9所述的方法制备的免疫球蛋白Fc片段，其用作药物载体。11. 权利要求10所述的免疫球蛋白Fc片段，其包括由SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11 表示的氨基酸序列。12. 权利要求9所述的方法，其中所述方法的特征在于不需要额外的蛋白质重折叠过 程。
【专利摘要】本发明涉及通过在毕赤酵母属酵母中导入包括编码人免疫球蛋白Fc片段的多核苷酸的表达载体而制备的转化体；生产免疫球蛋白Fc片段的方法，包括培养转化体，和从培养物回收免疫球蛋白Fc片段；和通过上述方法制备、用作药物载体的免疫球蛋白Fc片段。提出该转化体是大肠杆菌或动物细胞作为生产可用作药物载体的免疫球蛋白Fc片段的宿主的应用的相关问题的解决方案，因此其可在药物的高效和经济生产中得到多种应用。KCCM11348P20130107
【IPC分类】C12N15/13, C12N15/81, C12N1/19
【公开号】CN105073977
【申请号】CN201480006990
【发明人】金镇善, 许容豪, 吴宜林, 金玟永, 郑圣烨, 权世昌
【申请人】韩美药品株式会社
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年2月3日
【公告号】CA2899838A1, EP2951284A1, US20150361437, WO2014119956A1