利用酵母细胞制备登革病毒样颗粒及其在疫苗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及利用酵母细胞制备登革病毒样颗粒及其 在疫苗中的应用，更具体地，涉及酵母细胞、制备登革病毒样颗粒的方法、登革病毒样颗粒 及疫苗。
【背景技术】
[0002] 登革热是由登革病毒（Dengue virus, DEN)引起的急性传染病，以传播迅速，发病 率高为主要特征，临床上表现为登革热（dengue fever，DF)和登革出血热/登革休克综合 症（dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS)，登革出血热 / 登革休 克综合症（DHF/DSS)以高热、严重出血、休克和高病死率为主要临床表现。登革热广泛流行 于全球热带及亚热带，包括亚洲、大洋州、美洲及非洲的100多个国家和地区，以东南亚和 西太平洋地区的流行最为严重。近年来，由于全球气候变暖和国际人口大量流动等原因，目 前，登革热已成为世界上分布最广、发病最多的虫媒病毒病。
[0003] 登革病毒疫苗的研究已有70多年的历史，但迄今尚无有效的疫苗问世。究其原 因，主要是与登革病毒的致病机制有关，特别是与登革出血热/登革休克综合症（DHF/DSS) 的发病机制与抗体介导的免疫增强作用有关，即初次感染后产生的亚中和浓度的抗体或非 中和抗体在二次感染时不仅没有免疫保护作用，反而会增强病毒的感染，引起严重的临床 过程。因此认为，研发针对登革病毒四个血清型的多价疫苗，同时预防不同血清型登革病毒 的感染，可能是研发登革病毒疫苗唯一有效的途径。人们进行着各种尝试，仅重组技术就有 利用大肠杆菌、毕赤酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等各种系统，虽然也有获得病毒样颗粒 的成功记录，例如，1997年新加坡国立大学研究小组曾报道用单细胞的毕赤酵母菌表达登 革病毒样颗粒的研究，他们采用Pichia酵母系统表达登革热2型的病毒样颗粒，但需要甲 醇诱导，无法取得大规模生产大量登革热2型的病毒样颗粒。中国也在做这方面的研究，但 也未见到真正稳定高效的生产出理想的疫苗。
[0004] 因而，制备登革病毒样颗粒的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的 一个目的在于提出一种无需甲醇诱导，可准确表达病毒结构蛋白（prM、E)、可工业化生产的 制备登革病毒样颗粒的手段。
[0006] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0007] 登革病毒的核酸(结构示意图见图1)是单链的RNA，具有单一的可读框架，可翻译 产生核蛋白（C)、膜蛋白前体（prM)、壳蛋白（E)等3种病毒的结构蛋白，和7种病毒的非结 构蛋白（NS1，NS2a，NS2b，NS3, NS4a，NS4b，NS5)。其中登革病毒的颗粒是由C、prM、E所组 成，而构成病毒颗粒的外壳则是由PrM和E所组成。其中，E蛋白是引起病毒中和抗体的抗 原，而中和抗体是阻断病毒感染的体液免疫的主要抗体。因此，E蛋白是登革病毒疫苗的主 要和不可缺少的组分；prM是病毒的膜蛋白前体，它在E蛋白的成熟表达和构象方面发挥至 关重要的作用；而病毒核蛋白C主要分布在病毒颗粒内部，一般认为，C与病毒的免疫以及 与病毒prM、E的构象和功能无直接关系。酵母是真核细胞的表达系统。酵母细胞已经成 功地表达和生产了包括乙肝疫苗在内的大量不同的生物活性物质。在登革病毒疫苗研究领 域，1997年新加坡国立大学曾用单细胞的毕赤酵母表达了登革病毒2型所有的结构蛋白C、 prM和E，并构建了病毒样颗粒。但是，由于毕赤酵母的生长需要甲醇诱导，增大了工业化生 产中无菌操作的难度，使得这个系统在生产上有很多限制。
[0008] 鉴于上述发现，根据登革病毒和酵母细胞的特点，发明人利用面包/啤酒酵母强 有力的启动子、自我装配病毒颗粒的特殊功能和一定的表达后的修饰功能，表达和制备仅 包含prM和E两种病毒结构蛋白的病毒样颗粒疫苗的独特设计。并构建了登革II型病毒 样颗粒的重组质粒，成功地试表达了 II型的登革病毒样颗粒。这是国际上首次使用酵母细 胞表达仅有PrM和E两个病毒结构基因的登革病毒样颗粒。
[0009] 具体而言，在本发明的一个方面，本发明提供了一种酵母细胞。根据本发明的实施 例，所述酵母细胞表达第一蛋白质和第二蛋白，其中，所述第一蛋白质具有如SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列；以及所述第二蛋白质具有如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。发明人 发现，本发明的酵母细胞能够有效表达仅含登革病毒的膜蛋白前体（PrM)和壳蛋白（E)两 个病毒结构蛋白的登革病毒样颗粒，且获得的登革病毒样颗粒只具备免疫原性，不具备感 染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗。
[0010] 根据本发明的实施例，所述酵母细胞中包含第一核酸分子和第二核酸分子，其中， 所述第一核酸分子具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列；以及所述第二核酸分子具有如 SEQID N0:4所示核苷酸序列的核酸分子。由此，本发明的酵母细胞能够准确表达登革病毒 的膜蛋白前体（PrM)和壳蛋白（E)。
[0011] 根据本发明的实施例，所述酵母细胞为C13BYS86细胞。由此，不需要甲醇诱导，有 利于大规模培养，进而，通过培养本发明的酵母细胞，能够大规模制备登革病毒样颗粒。
[0012] 根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子分别独立地以表达 载体形式存在于所述酵母细胞中。
[0013] 根据本发明的实施例，所述表达载体为PTG3828质粒。
[0014] 根据本发明的实施例，所述第一核酸分子和所述第二核酸分子共同存在于 PTG3828质粒上。
[0015] 在本发明的另一方面，本发明提供了一种制备登革病毒样颗粒的方法。根据本发 明的实施例，该方法包括：培养前面所述的酵母细胞，以便获得登革病毒样颗粒。发明人发 现，利用本发明的该方法能够快速有效地制备仅含登革病毒的膜蛋白前体（PrM)和壳蛋白 (E)两个病毒结构蛋白的登革病毒样颗粒，且获得的登革病毒样颗粒只具备免疫原性，不具 备感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗，另外，该方法无需甲醇诱导、可工业化生产、 有利于亚单位疫苗的产业化和纯化。
[0016] 在本发明的再一方面，本发明提供了 一种登革病毒样颗粒。根据本发明的实施例， 所述登革病毒样颗粒是通过前面所述的方法而制备的。由此，本发明的登革病毒样颗粒仅 含登革病毒的膜蛋白前体（PrM)和壳蛋白（E)两个病毒结构蛋白，只具备免疫原性，不具备 感染原性，能够有效用于制备登革病毒疫苗。
[0017] 在本发明的再一方面，本发明提供了一种疫苗。根据本发明的实施例，该疫苗包含 前面所述的登革病毒样颗粒。由此，本发明的疫苗能够有效预防登革热。
[0018] 需要说明的是，本发明的酵母细胞、登革病毒样颗粒及其制备方法、以及疫苗是发 明人成功的将两个独立的大片段病毒基因（D2prM和D2E基因)克隆进入面包/啤酒酵母系 统，并在该酵母工程菌系统实现了病毒粒子自动装配和稳定表达。本发明的优势在于：利用 最低成本的原料、合成最接近真实病毒形态和结构的登革病毒样颗粒、而且不需甲醇诱导 即可大规模生产。而目前还未见利用面包/啤酒酵母成功表达登革病毒样颗粒的报道。
【附图说明】
[0019] 图1显示了根据本发明的一个实施例，登革病毒基因的结构示意图；
[0020] 图2显示了根据本发明的一个实施例，重组克隆载体PVD_D2prME的构建流程图；
[0021] 图3显示了根据本发明的一个实施例，表达载体PTG-D2prME的构建流程图；
[0022] 图4显示了根据本发明的一个实施例，5万倍放大的转染酵母细胞电子显微镜照 片；以及
[0023] 图5显示了根据本发明的一个实施例，8万倍放大的转染酵母细胞电子显微镜照 片。
【具体实施方式】
[0024] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发 明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，例如，可参照"分子克隆实验指南"（第三 版)。所用试剂或仪器未注明生产厂商者