一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用，该酵母重组疫苗以酵母作为宿主细胞，转染包含ApoB100基因片段的真核表达载体；所述的ApoB100基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的真核表达载体为JMB88-HA-OVA-hApoB100。该酵母重组疫苗通过口服的方式饲喂，能够在酵母中被硫酸铜诱导下表达OVA-hApoB融合蛋白，并在体内被裂解释放，经过抗原呈递引起集体的体液和细胞免疫反应，达到缓解和治疗动脉粥样硬化的目的，可应用于动脉粥样硬化的药物的制备。
【专利说明】—种ApoBIOO酵母重组疫苗及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，涉及一种Ap0BlOO酵母重组疫苗及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]在21世纪，心脑血管疾病已经成为人类健康的第一杀手，动脉粥样硬化(atheroma)是一组称为动脉硬化的血管病中常见的最重要的一种，多由脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调引起，是由遗传、环境等多因素导致的老年多发性疾病，常导致血栓形成、供血障碍等，近年来有逐渐年轻化和上升趋势。在众多的发病因素中，脂质代谢紊乱，尤其是闻胆固醇血症与其关系最为密切。
[0003]脂蛋白在人类动脉粥样硬化(As)形成及进展过程中起主要作用，它是由脂质及载脂蛋白(Apo)构成。载脂蛋白在脂蛋白的代谢过程中起关键作用，主要分为A、B、C、D、E五类。载脂蛋白E是血浆脂蛋白的重要成分，它的主要机能是作为乳糜微粒(CM)残粒受体和低密度脂蛋白(LDL)受体的配体，在脂质残粒的代谢中起重要作用，对脂质的运输和代谢发挥主要作用。有研究表明，载脂蛋白E (ApoE)基因缺陷小鼠无论正常或者高脂饮食均可形成严重的高血脂症及AS，其病变的发展同人类极其相似，故常被用于研究AS发病机制以及抗AS病理学研究。载脂蛋白B (ApoB)为人体主要的载脂蛋白，为乳糜微粒(CM)、及低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)的构成成分，在脂类转运和代谢过程中起着极其重要的作用。人体含有两型ApoB分子，ApoBIOO参与VLDL的装配与分泌。在血液中，VLDL可代谢转化为富含胆固醇的LDL。每个LDL颗粒上仅含一分子ApoBIOO，是唯一的蛋白成分，同时也介导80%的LDL与受体结合使之被清除体外。ApoB48为CM合成和分泌所必需，参与外源性脂质的消化、吸收和运输。目前ApoB已被锁定为促使动脉粥样硬化(AS)与冠心病(CAD)的危险因子。
[0004]已研究发现免疫反应与动脉粥样硬化的发病相关，因此使用免疫抑制以及接种疫苗成为治疗动脉粥样硬化的新方法。许多研究证实，大部分免疫抑制药物对心血管的危险因素(包括血脂异常、高血压病、糖尿病)均有负面作用。因此，限制了该类药物在抗动脉粥样硬化上的应用。免疫接种常用的方法就是通过接种疫苗，暴露抗原诱导机体免疫反应，产生抗体。最近，临床上正在尝试使用免疫接种疫苗的方法治疗非感染性疾病，包括风湿性关节炎、I型糖尿病和Alzheimer’ s病等。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的问题在于提供一种ApoBIOO酵母重组疫苗及其制备方法和应用，通过基因工程发酵酵母疫苗递呈抗原ApoBIOO，诱导机体产生特异性抗体，有助于动脉粥样等慢性炎症性疾病的防治。
[0006]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0007]一种ApoBIOO酵母重组疫苗，该酵母重组疫苗以酵母作为宿主细胞，转染包含Ap0BlOO基因片段的真核表达载体。
[0008]所述的ΑροΒΙΟΟ基因片段的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0009]所述的真核表达载体为JMB88-HA-0VA-hApoB100，是将ΑροΒΙΟΟ基因片段克隆到JMB88-HA-0VA-MCS载体中的OVA的下游而得到的；
[0010]所述的酵母为酵母JMY1。
[0011]该酵母重组疫苗能够表达OVA-ApoBlOO融合蛋白，并将表达的ΑροΒΙΟΟ肽递呈给抗原递呈细胞，诱导免疫反应，产生针对ΑροΒΙΟΟ的抗体。
[0012]该酵母重组疫苗能够表达ΑροΒΙΟΟ肽，并将表达的ΑροΒΙΟΟ肽递呈给抗原递呈细胞，诱导免疫反应，产生针对ΑροΒΙΟΟ的抗体。
[0013]一种真核表达载体，该真核表达载体为JMB88-HA-0VA-hApoB100，是将ΑροΒΙΟΟ基因片段克隆到JMB88-HA-0VA-MCS载体中而得到的。
[0014]一种ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗的制备方法，包括以下操作:
[0015]I)以人基因组为模板克隆ΑροΒΙΟΟ基因片段，并将ΑροΒΙΟΟ基因克隆到真核表达载体JMB88-HA-0VA-MCS当中，构建真核表达载体JMB88-0VA_hApoB100 ；
[0016]2)将真核表达载体JMB88-0VA_hApoB100转染到酵母菌株当中，并筛选阳性克隆；
[0017]3)将阳性克隆接种到液体SD培养基中，当细胞最佳密度达到OD6tltl=0.5时加入
0.5mM的硫酸铜溶液进行诱导表达；
`[0018]4)诱导表达后离心收集酵母细胞并进行洗涤，然后将酵母细胞在56°C灭活lh，得到ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗。
[0019]所述的真核表达载体JMB88-0VA_hApoB100的构建包括:
[0020]以人基因组DNA为模板，以上游引物hApoB-F、下游引物hApoB-R为引物对扩增ΑροΒΙΟΟ基因片段，Bgl II /Xho I双酶切得到的ΑροΒΙΟΟ基因片段，并与经同样双酶切后的酵母真核表达载体JMB88-HA-0VA-MCS连接，16°C连接过夜，构建质粒JMB88-HA-0VA-hApoB100o
[0021]所述的真核表达载体JMB88-0VA-hApoB100是通过LiAc/ssDNA的方法转染到酵母菌株JMYl当中，然后将转染后的菌体均匀涂布并在基本SD固体培养基上进行筛选。
[0022]所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗在制备防治冠心病、动脉粥样硬化的药物中的应用。
[0023]所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗在制备降低低密度脂蛋白胆固醇、提高高密度脂蛋白胆固醇药物中的应用。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0025]1、本所述基因工程发酵酵母含有真核基因表达盒(如CUPl-ApoBlOO):真核基因表达盒可以整合在酵母基因组或者作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。应用该基因工程酵母饲喂买7周龄雄性ApoE基因缺陷型(ApoE-/-)小鼠，免疫12周后能够在小鼠血清中检测到特异性抗体的产生。本发明应用基因工程酵母作为表达和运输外援蛋白的载体，靶向调控机体体液和细胞免疫反应，能够应用于治疗自身免疫疾病和新型口服疫苗开发和生产，并且能够终生保护机体对抗特的定病理反应。
[0026]2、本发明构建含有真核启动子的酵母表达载体的JMB88-HA-0VA-hApoB100，并将该载体转化到酿酒酵母中。通过口服的方式饲喂小鼠，由于载体具有真核表达系统，能够在酵母中被硫酸铜诱导下表达OVA-hApoBlOO融合蛋白(其中OVA为鸡卵清蛋白，表达后能提高抗原的免疫原性，用于增加抗原蛋白的刺激机体产生抗体的能力)，并在体内被裂解释放，经过抗原呈递引起集体的体液和细胞免疫反应，达到缓解和治疗动脉粥样硬化的目的，可应用于动脉粥样硬化的药物的制备。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为人ΑροΒΙΟΟ基因片段的PCR扩增电泳图；
[0028]图2为JMB88-HA-0VA-MCS载体的质粒图谱；
[0029]图3为JMB88-0VA_hApoB酵母表达载体的质粒图谱；
[0030]图4为真核表达载体JMB88-HA-0VA-hApoB100的双酶切鉴定图；
[0031]图5 酵母菌株 JMYl 中 HA-0VA-hApoB100、HA-OVA 融合蛋白表达的 Western blot检测结果图；
[0032]图6为Western blot检测各组小鼠血清中的ΑροΒΙΟΟ抗体的结果图；
[0033]图7为Western blot检测hApoBlOO特异性抗体与apoE基因缺陷小鼠、昆白小鼠自身ΑροΒΙΟΟ之间的特异性免疫反应；
[0034]图8为ELISA检测各组小鼠血清ΑροΒΙΟΟ特异性抗体的滴度；
[0035]图9为测定各组小鼠 血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的浓度结果图；
[0036]图10为分离成功的心脏样本示意图；
[0037]图11为小鼠动脉瓣膜冰冻切片油红O染色结果图。
【具体实施方式】
[0038]免疫反应与动脉粥样硬化的发病相关，因此使用免疫抑制以及接种疫苗成为治疗动脉粥样硬化的新方法。然而许多研究证实，大部分免疫抑制药物对心血管的危险因素(包括血脂异常、高血压病、糖尿病)均有负面作用。因此，限制了该类药物在抗动脉粥样硬化上的应用。
[0039]鉴于ApoB已被锁定为促使动脉粥样硬化(AS)与冠心病(CAD)的危险因子，且根据文献报道用ΑροΒΙΟΟ的ρ143和ρ210肽段免疫高脂饲喂的ApoE基因缺陷型小鼠，它们能够抑制降主动脉上动脉粥样硬化病变。故本发明了一种针对ΑροΒ100ρ210肽段的新型重组酵母疫苗，验证重组酵母ΑροΒ100ρ210作为降低主动脉粥样硬化病变的可能性。利用酵母本身具有佐剂的作用和易于表达抗原蛋白并递呈抗原的特性，将表达的外源ΑροΒ100ρ210肽段递呈给机体的抗原递呈细胞(APC)--树突状细胞(DCs)，从而诱导机体有效的保护性免疫反应，产生针对ΑροΒΙΟΟ的抗体。结果表明将本发明所制备的酵母疫苗口服免疫的方法让小鼠产生针对外源蛋白ΑροΒΙΟΟ的特异性抗体，从而调节小鼠本身的ΑροΒΙΟΟ水平，以达到治疗或者预防动脉粥样样硬化的疾病的目的。
[0040]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合人基因组ΑροΒΙΟΟ基因的具体试验例对本发明由口服基因工程发酵酵母表达外源基因的方法(即通过口服基因工程发酵酵母向小鼠体内靶向运送功能基因片段的方法)作进一步的说明。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0041]1、酵母真核表达载体JMB88-HA-0VA-hApoB100的构建[0042]首先利用PCR体外扩增人基因组外显子上的一个859bp的片段，包含CVX_210_H肽段。
[0043]I)引物设计与合成
[0044]以人基因组DNA为模板，利用Clone ManagerV7软件进行引物设计，设计能够特异扩增p210肽段的引物hApoB-F和hApoB-R，并在上游引物hApoB_F中引入Bgl II酶切位点，下游引物hApoB-R中引入Xho I酶切位点。序列设计如下:
[0045]hApoB-F:GGGAGATCTATAGACTTCCTGAATAACTATGCA ；
[0046]hApoB-R:GGGCTCGAGTTGGTATTCAGTGTGATGACACTTG ；
[0047]其中:hApoB-F引物序列中下划线部分为Bgl II酶切位点；hApoB-R引物序列中下划线部分为Xho I酶切位点。
[0048]2、PCR扩增人基因ΑροΒΙΟΟ目的片段
[0049]以人基因组DNA为模板，hApoB-F和hApoB-R为引物，PCR扩增人ΑροΒΙΟΟ基因片段，PCR反应体系为如表2所述，反应条件为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，56°C退火30s, 72°C延伸50s, 30个循环；最后72°C延伸IOmin0
[0050]表2ApoB 100PCR 体系
[0051]
Componentvolume
人基因组dmTTl
hApoB-FIuL
hApoB-RIuL
IOTaq Buffer5 μ L
2.5mmol/L dNTPs4 μ L
Taq:pfu=4:10.5 μ L
Εβ37.5uL
[0052]PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小正确结果如图1所示，其中。泳道I为Trans2K Plus DNA Marker;泳道2，3为人ΑροΒΙΟΟ基因片段的PCR扩增产物。
[0053]3、构建酵母表达载体 JMB88-0VA_hApoB100
[0054]Bgl II /Xho I双酶切胶回收得到的目的片段(酶切体系如表3所示)与经同样双酶切后的酵母真核表达载体JMB88-HA-0VA-MCS连接，酶切体系如表4)，连接体系如表5，16°C连接过夜，构建质粒JMB88-HA-0VA-hApoB100，然后转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，涂LB/Amp平板，挑取单克隆并在LB/Amp液体培养 基中37°C培养8h。
[0055]JMB88-HA-0VA-MCS载体的质粒图谱如图2所示，包括amp、TRP 1、CUP1-P及0VA，其中OVA为鸡卵清蛋白的CDS序列，表达后能提高抗原的免疫原性，用于增加抗原蛋白的刺激机体产生抗体的能力；其核苷酸的序列如SEQ.1D.N0.2所示。[0056]所构建的JMB88-0VA_hApoB酵母表达载体的质粒图谱如图3所示，可以看到该酵母表达载体是CUPl启动子，ΑροΒΙΟΟ插入到OVA的下游，含有真核基因表达盒CUPl-ΑροΒΙΟΟ，能够表达OVA-hApoB融合蛋白，真核基因表达盒可以整合在酵母基因组或者作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。
[0057]所构建的JMB88-0VA_hApoB酵母表达载体能够在酵母中被硫酸铜诱导下表达OVA-hApoB融合蛋白，并在体内被裂解释放，经过抗原呈递引起集体的体液和细胞免疫反应。
[0058]提取质粒JMB88-HA-0VA-hApoB100，并经Bgl II /Xho I双酶切鉴定，结果如图4所示，其中泳道 I 为 DNA Marker;泳道为 2，3，4.JMB88-HA-0VA-hApoB100 经 Bglll/Xho I双酶切的产物。送阳性质粒到Invitrogen公司进行测序分析,其中hApoBlOO的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示，保存测序正确的质粒备用。
[0059]表3hApoB100Bgl II和Xho I双酶切反应体系
[0060]
【权利要求】
1.一种Ap0BlOO酵母重组疫苗，其特征在于，该酵母重组疫苗以酵母作为宿主细胞，转染包含Ap0BlOO基因片段的真核表达载体。
2.如权利要求1所述的Ap0BlOO酵母重组疫苗，其特征在于，所述的Ap0BlOO基因片段的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
3.如权利要求1或2所述的Ap0BlOO酵母重组疫苗，其特征在于，所述的真核表达载体为JMB88-HA-0VA-hApoB100，是将ΑροΒΙΟΟ基因片段克隆到JMB88-HA-0VA-MCS载体中的OVA的下游而得到的； 所述的酵母为酵母JMYl。
4.如权利要求3所述的Ap0BlOO酵母重组疫苗，其特征在于，该酵母重组疫苗能够表达OVA-ApoBlOO融合蛋白，并将表达的Ap0BlOO肽递呈给抗原递呈细胞，诱导免疫反应，产生针对ΑροΒΙΟΟ的抗体。
5.一种真核表达载体，其特征在于，该真核表达载体为JMB88-HA-0VA-hApoB100，是将ΑροΒΙΟΟ基因片段克隆到JMB88-HA-0VA-MCS载体中而得到的。
6.一种ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下操作: O以人基因组为模板克隆ΑροΒΙΟΟ基因片段，并将ΑροΒΙΟΟ基因克隆到真核表达载体JMB88-HA-0VA-MCS 当中，构建真核表达载体 JMB88-0VA_hApoB ； 2)将真核表达载体JMB88-0VA-hApoB100转染到酵母菌株当中，并筛选阳性克隆； 3)将阳性克隆接种到液体SD培养基中，当细胞最佳密度达到0.5时加入0.5mM的硫酸铜溶液进行诱导表达； 4)诱导表达后离心收集酵母细胞并进行洗涤，然后将酵母细胞在56°C灭活lh，得到ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗。
7.如权利要求1所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗的制备方法，其特征在于，所述的真核表达载体JMB88-0VA-hApoB100的构建包括: 以人基因组DNA为模板，以上游引物hApoB-F、下游引物hApoB-R为引物对扩增ΑροΒΙΟΟ基因片段，Bgl II /Xho I双酶切得到的ΑροΒΙΟΟ基因片段，并与经同样双酶切后的酵母真核表达载体JMB88-HA-0VA-MCS连接，16°C连接过夜，构建质粒JMB88-HA-0VA-hApoB100o
8.如权利要求1所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗的制备方法，其特征在于，所述的真核表达载体JMB88-0VA-hApoB100是通过LiAc的方法转染到酵母菌株JMYl当中，然后将转染后的菌体均匀涂布并在基本SD固体培养基上进行筛选。
9.权利要求1所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗在制备防治冠心病、动脉粥样硬化的药物中的应用。
10.权利要求1所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重组疫苗在制备降低低密度脂蛋白胆固醇、提高高密度脂蛋白胆固醇药物中的应用。
【文档编号】A61P3/06GK103520713SQ201310485936
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】张智英, 麻丽霞, 李欣憶, 张婷婷, 张优优, 刘中天 申请人:西北农林科技大学