一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用
【专利说明】一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的 应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用。 【【背景技术】】
[0002] 全世界约有3. 5亿人是HBV携带者，其中50%~70%为慢性乙肝，研宄表明约有 80%的肝癌患者与乙肝有关。中国是乙肝高发区，约有1.2亿HBV携带者，约25%~40% 最终将死于肝硬化或合并肝癌，目前全球尚无根治药物。由于存在携带HIV等病毒及产量 有限等问题，血源性乙肝疫苗已经被世界卫生组织取缔，取而代之的是重组乙肝疫苗。目前 在国内流通的重组乙肝疫苗主要由中华地鼠卵巢细胞（CHO)、酿酒酵母菌及汉逊酵母菌作 为生产宿主细胞。由于酵母菌来源的细胞具有高表达量、低产本等优势，目前在疫苗市场上 已取得主导地位。
[0003] 与酿酒酵母菌相比，甲醇营养型的汉逊酵母表现出更高的表达量，此前有报道其 产量高达200~700mg/L蛋白，没有过度糖基化的现象，并且能够耐受高温，最佳生长温度 为37°C-43°C，生长速率快，能够用廉价的培养基进行高密度发酵，因此适于大规模发酵生 产目的蛋白。尽管已经有多家企业使用了该菌株用于生产重组乙肝疫苗，但在原始菌株选 择上，不同厂家还有较大差异，菌株发酵时生物量偏低；此外配套表达载体的差异，造成宿 主整合的拷贝数不高，不容易筛选到高拷贝菌株，整合进入宿主基因组的基因稳定性差等 问题，最终影响目的蛋白表达量，增加了生产成本。
[0004] 现有的各种酵母来源重组乙肝表面抗原均属于胞内表达，生产厂家的纯化工艺各 有不同，主流纯化工艺中包括超速离心等步骤，但此工艺操作过程繁琐，耗费人力物力较 多，产物回收率低，严重制约生产规模。因此，还有待于开发新的菌株和配套载体，以及更加 有效、低成本的纯化工艺。 【
【发明内容】
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[0005] 本发明涉及一种汉逊酵母突变体及其表达载体在重组蛋白表达方面的应用。
[0006] 本发明所提供的汉逊酵母突变体为乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因（URA3)被阻断 的汉逊酵母营养型突变体。命名为尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-l.ura3-)。经过分子鉴定、 遗传稳定、生物量分析，证明该突变体被阻断的位点明确，机制清楚，遗传稳定且生物量高， 保证了疫苗生产的安全性。
[0007] 本发明所提供的构建上述汉逊酵母菌的方法，包括以下步骤：
[0008] 1)构建用于致突变5'UTR-HPURA3A40-3'UTR的基因片段；
[0009] 2)将步骤1)中的基因片段转化入野生型汉逊酵母中，利用5-FOA筛选尿嘧啶营养 缺陷型菌株〇)L-Lura3_)。
[0010] 其中致突变片段包含部分终止序列，用于阻断乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因 (URA3)的读码框。
[0011] 所述野生型汉逊酵母菌株优选ATCC26012。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种与上述突变体菌株配套的表达载体。
[0013] 本发明所提供的配套表达载体含有如下基因序列原件；所述序列原件依次包括酿 酒酵母URA3表达框、G418表达框、汉逊酵母自主复制序列（ARS)、原核细胞自主复制序列 (ori)、甲醇氧化酶基因启动子、转录终止子等序列。
[0014] 本发明提供的表达载体具有正方向筛选标记，既具有G418表达框，同时具有URA3 表达框，可同时利用两种标记进行筛选，筛选步骤操作简单、减少假阳性克隆产生、容易筛 选出高拷贝数、遗传稳定的生产菌株。
[0015] 本发明的第三个目的是利用上述尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-l.ura3-)及配套表 达载体pM0XUR(S.C)KARS1生产和纯化重组乙肝表面抗原。
[0016] 本发明所提供的生产和纯化重组乙肝表面抗原的方法简单，操作时间周期短、回 收率和纯度高，包括以下步骤：
[0017] 1)构建用于表达重组乙肝表面抗原的载体；
[0018] 2)将步骤1)中的载体转化入尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-l.ura3_)中，筛选出高 拷贝、稳定的生产菌株。
[0019] 3)经常规工艺发酵后，菌体经破菌、澄清、硅胶吸附、离子交换、超滤浓缩和分子筛 层析等步骤后获得高纯度、高回收率的重组乙肝表面抗原。
[0020] 本发明的尿嘧啶营养缺陷型菌株〇)L-l.ura3-)和配套表达载体pMOXUR(S.C) KARS1可应用于生产多种外源蛋白，并不仅限于上述重组乙肝表面抗原的表达。
[0021] 本发明通过基因工程手段，构建了生物量高、遗传稳定的尿嘧啶营养缺陷型菌株 (DL-l.ura3_)及其配套表达载体pMOXUR(S.C)KARSl。配套载体具有正方向筛选标记基因， 与国内外所用的表达载体相比，更容易筛选出高拷贝数、遗传稳定的生产菌株，筛选操作更 简单。利用该菌株和配套载体能够高效生产重组乙肝表面抗原，经简单纯化工艺之后，即可 获得高回收率、高纯度的重组乙肝表面抗原，具有较高的工业应用价值。 【【附图说明】】
[0022] 图1为本发明中致突变基因片段5'UTR-HPURA3A40-3'UTR片段的模式图；
[0023] 图2为本发明中尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-1.ura3_)的分子鉴定；
[0024] 图3为本发明中尿喃啶营养缺陷型菌株（DL-1.ura3_)稳定性验证结果；
[0025] 图4为本发明中尿嘧啶营养缺陷型菌株（DL-1.ura3_)的配套表达载体；
[0026] 图5为本发明中实施例3纯化产品的SDS-PAGE图谱；
[0027] 图6为本发明中实施例3纯化产品的HPLC-SEC图谱；
[0028] 图7为本发明中实施例3纯化产品的透射电镜图谱。 【【具体实施方式】】
[0029] 下述实施例中所有涉及含量的百分数均为质量百分数。
[0030] 下述实施例中所用限制性内切酶及连接酶均购自Takara公司。
[0031] 下述实施例中所用DNA聚合酶均购自Toyobo公司。
[0032] 实施例1、汉逊酵母突变体ATCC26012(ura3_)的构建及其稳定性和生物量的测 定。
[0033] 一、构建致突变基因片段5'UTR-HPURA3A40-3'UTR片段
[0034] 如图1所示，用于电转汉逊酵母的致突变基因片段包括URA3基因上游UTR 1036bp，下游UTRlOOObp，和带有部分缺失的URA3基因片段，其构建过程如下：
[0035] 1、5'UTR-HPURA3-3'UTR野生型基因片段Homo_HPURA3的获得
[0036] 根据已报道的汉逊酵母的URA3的核苷酸序列（GenBank:X69461. 1)设计引物如 下：
[0037]引物 1 :5 '-AGAACGTGGACGATAATGACGCAGA-3'
[0038]引物 2 :5 '-GCCGTCTCGATTTGACTACCTCAC-3'
[0039] 以汉逊酵母（HansenulaPolymorpha)ATCC26012的总基因组DNA为模板，用引物 1和引物2进行PCR反应，具体反应条件为：50y1反应体系，包含1y1的KOD-Plus聚合 酶，5y1 10XBuffer，5y1dNTP，2y1 25mMMgS04,1. 5y1 引物 1，1. 5y1 引物 2,1y1 基 因组模板，33y1ddH20。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94°C2分钟，循环1 次；94°C15秒，55°C1分钟，68°C3分钟，共35个循环；68°C1分钟，循环1次。
[0040] 将PCR产物回收并纯化，目的片段约2. 8kb，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并 转化T0P10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，测序正确的克隆提取质粒以备 后续实验使用。
[0041] 2、致突变上游片段5'UTR-AHPURA3序列的获取
[0042]引物3 :5'-AGAACGTGGACGATAATGACGCAGA-3'
[0043]引物4 :5'-CGTAGTCGAGTCACTTAGTTACATTCGTGATATCGGCCCA-3'
[0044] 以上述5'UTR-HPURA3-3'UTR野生型基因片段Hom〇-HPURA3为模板，用引物3和 引物4进行PCR反应，具体反应条件为：50yl反应体系，包含lyl的KOD-Plus聚合酶， 5yllOXBuffer，5yldNTP，2yl25mMMgS04，1.5yl引物l，1.5yl引物 2，lyl模板， 33y1ddH20。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94°C2分钟，循环1次；94°C15 秒，55°C1分钟，68°C3分钟，共35个循环；68°C1分钟，循环1次。
[0045] 将PCR产物回收并纯化，目的片段约1. 4kb，回收后产物连接pEASY-Blunt载体并 转化T0P10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，测序正确的克隆提取质粒以备 后续实验使用。
[0046] 3、致突变下游片段AHPURA3-3'UTR序列的获取
[0047]引物5:5'-TAACTAAGTGACTCGACTACGACAGGCAGCAGAAGAAAGT-3'
[0048]引物 6 :5 '-GCCGTCTCGATTTGACTACCTCAC-3'
[0049] 以上述5'UTR-HPURA3-3'UTR野生型基因片段Hom〇-HPURA3为模板，用引物5和 引物6进行PCR反应，具体反应条件为：50yl反应体系，包含lyl的KOD-Plus聚合酶， 5yl10XBuffer，5yldNTP，2yl25mMMgS04，1.5yl引物l，1.5yl引物 2，lyl模板， 33y1ddH20。用Bio-Rad的PCR仪进行反应，反应条件为：94°C2分钟，循环1次；94°C15 秒，55°C1分钟，68°C3分钟，共35个循环；68°C1分钟，循环1次。
[0050] 将PCR产物回收并纯化，目的片段约1. 4kb回收后产物连接pEASY-Blunt载体并 转化T0P10感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆并进行测序，测序正确的克隆提取质粒以备 后续实验使用。
[0051] 4.致突变 5'UTR-HPURA3A40-3'UTR片段的获取
[0052]引物 7 :5 '-AGAACGTGGACGATAATGACGCAGA-3'
[0053]引物 8 :5 '-GCCGTCTCGATTTGACTACCTCAC-3'
[0054] 以上述5'UTR-HPURA3-3'UTR野生型基因片段Hom〇-HPURA3为模板，用引物5和 引物6进行PCR反应，具体反应条件为：50yl反应体系，包含lyl的KOD-Plus聚合酶， 5yl10XBuffer，5yldNTP，2yl25mMMgS04，1.5yl引物l，1.5yl引物 2，lyl模板， 33y1ddH20。用Bio-Rad的P