一种热带假丝酵母菌及利用其作为生物催化剂制备异辛酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种热带假丝酵母菌及利用其作为生物催化剂制备异辛酸的方法。
【背景技术】
[0002]异辛酸及其盐类是重要的精细化学品，主要用作涂料、油墨催干剂，各类不饱和聚合物树脂促进剂、催化剂，金属加工和润滑助剂，聚氯乙烯加工助剂，橡胶硫化促进剂，油品添加剂。另外作为中间体可以合成医药、染料、农药和香料等。近年来国内外市场上异辛酸比较紧俏，产品供应日趋紧张，异辛酸未来市场发展前景非常广阔(松文。异辛酸的生产技术与市场，精细化工原料及中间体，2008，10，30-31)。
[0003]异辛酸工业化合成主要有两条路线，一种是以异辛醛或异辛烯醛为原料生成异辛酸(刁香，2-乙基己醛的合成工艺研宄。山东理工大学学报，2008，22 (I):99-102)，但是由于异辛醛多是化工生产过程中的中间体，无商业品供应，因此这种方法比较适合于带有中间产品异辛醛的规模化工生产。另一种是异辛醇氧化法，如高锰酸钾氧化法、硝酸氧化法、高压脱氢氧化法、常压脱氢氧化法、催化脱氢氧化法(刁香，周建平，吕志果，杨琦等，醛氧化法合成异辛酸工艺的研宄进展。精细石油化工进展，2001，2 (4)，37-39)。但这些工艺多存在反应时间长，催化选择性差、反应条件苛刻、三废问题比较严重等问题。
【发明内容】
[0004]为解决上述所存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种新筛选的热带假丝酵母菌 SIT201，CGMCC N0.9389。
[0005]本发明的目的之二在于提供一种上述的热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389的培养方法。
[0006]本发明的目的之三在于提供一种上述的热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389作为生物催化剂催化异辛醇氧化生成异辛酸的方法。本发明所提供的热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389作为生物催化剂可以在温和环保的条件下，低成本、高选择性、高产率地催化异辛醇生成异辛酸。即本发明首次利用热带假丝酵母菌SIT201静息细胞作为生物催化剂催化氧化异辛醇制备异辛酸，所用的生物催化剂易于制备、反应过程的条件温和、无污染，异辛酸的产率能达到98 %，生产成本低，该制备方法具有潜在的工业应用前景。
[0007]本发明的技术方案
一种菌株热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389是一种属于真菌界假丝酵母属的菌株，该菌株从中国南方上海地区的土壤中采集土样，以异辛醇或其类似物为唯一碳源经过多轮富集培养后筛选得到的，于2014年07月08日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC N0.9389，保藏机构地址:北京市朝阳区北辰西路I号院中国科学院微生物研宄所，邮编:100101。
[0008]上述的菌株热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389具有如下的生物学特征: 1、形态特征
本发明所得的热带假丝酵母菌细胞呈球形或卵球，其中大小为4?8 μπιΧ6?11 μπι，可看到大量的假菌丝和芽生孢子。
[0009]2、培养学特征
在麦芽汁琼脂上菌落为白色到奶油色，无光泽或稍有光泽，软而平滑或部分有皱纹。
[0010]3、生理生化特征
(1)、形态试验(假菌丝):阳性
(2)、淀粉形成试验:阴性
(3)、醋酸产生试验:阴性
(4)、尿素水解实验:可变反应
(5)、重氮基蓝B反应:阳性
(6)、氮源利用
阳性:硝酸盐、亚硝酸盐
阴性:乙胺、L-赖氨酸、肌酸、肌酸酐
(7)、发酵实验
阳性:葡萄糖、D-半乳糖、麦芽糖阴性:蜜二糖、乳糖、纤维二塘、淀粉
(8)、碳源同化试验
阳性:麦芽糖、D-半乳糖、蔗糖、α -海藻糖、D-木糖
阴性:D-葡糖胺、D-阿拉伯糖、纤维二塘、D-葡萄糖醛酸、木糖醇
(9)、生长最适宜温度:25?35°C
根据生理生化实验和酵母菌的特征与鉴定手册，该菌为热带假丝酵母菌tropical !s') SIT201，CGMCC N0.9389，结合16srDNA分子生物学鉴定，该菌属于热带假丝酵母菌，但又与现有技术中报道的热带假丝酵母菌有明显的不同，其主要不同之处在于:可以作为生物催化剂，首次实现催化异辛醇氧化生成异辛酸，并取得了较高的产率。
[0011]采用上述热带假丝酵母菌tropicalis) SIT201，CGMCC N0.9389 作为生物催化剂催化异辛醇产生异辛酸的制备方法，其制备过程的反应过程示意图如图1所示，即异辛醇在生物催化剂即热带假丝酵母菌{Candida tropical is) SIT201，CGMCC N0.9389作用下备催化转化为异辛酸，其制备过程具体包括下列步骤:
(I)、热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389的培养
取4°C保存的热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389斜面菌种，挑取一环接种至含有10mL发酵培养基I的500mL摇瓶中，在25?35°C下，160?220rpm摇床培养24?48h,控制转速为8000r/min离心1min收集所得的沉淀I转接到含有10ml以烷烃为唯一碳源的发酵培养基2的摇瓶中，继续在25?35°C下，160?220rpm培养24?72h，然后控制转速为8000rpm离心lOmin，收集所得的沉淀2即为热带假丝酵母菌(Candida tropical is)SIT201，CGMCC N0.9389 静息细胞；
上述所得的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) SIT201，CGMCC N0.9389静息细胞，其含水量为75-85%;
所述的发酵培养基I，按每升计算，由20g蔗糖或1ml烷烃l，4g (NH4) 2S04，7g KH2PO4,2g Na2HPO4.12H20，1.5g MgSO4.7H20，1.5g 酵母膏，0.1g CaCl2.2H20，0.008g FeCl2.4H20，
0.0Olg ZnSO4.7H20和余量的水组成，其中所述的烷烃I为正十二烷；
所述以烷烃为唯一碳源的发酵培养基2，按每升计算，含1ml烷烃2，4g (NH4)2SO4,7g KH2PO4, 2gNa2HP04.12H20，1.5g MgSO4.7H20，1.5g 酵母膏，0.1gCaCl2.2Η20，0.008gFeCl2.4Η20，0.0Olg ZnSO4.7Η20，ρΗ7.0，余量为水，其中所述烷烃2为正十二烷；
(2)、将步骤(I)所得的热带假丝酵母菌{Candidatropica I is) SIT201，CGMCCN0.9389静息细胞置于缓冲溶液中，得到浓度为0.05-0.3g/ml的含有热带假丝酵母{Candida tropical is) SIT201，CGMCC N0.9389 静息细胞的缓冲溶液；
所述的缓冲溶液为浓度均为0.1mmoI/L, pH8.0的磷酸钠缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液；
然后向所得的浓度为0.05-0.3g/ml的含有热带假丝酵母{Candida tropical is)SIT201，CGMCC N0.9389静息细胞的缓冲溶液中加入异辛醇，然后再用上述的缓冲溶液定容，得到异辛醇浓度为10-50mmol/L的混合溶液，然后控制温度为30°C，进行反应12_24h将异辛醇经热带假丝酵母菌生物催化生成异辛酸，得到反应液；
上述异辛醇的加入量，按每升混合溶液中的热带假丝酵母菌{Candida tropical is)SIT201，CGMCC N0.9389静息细胞:异辛醇为25?150g: 10?50mmol的比例计算；
(3)、将步骤(2)所得的反应液加入NaCl，震荡使其全部溶解，然后用2mol/L盐酸调pH值2.0，然后用乙酸乙酯萃取，所得的有机相用无水硫酸钠干燥后减压蒸干即得异辛酸；
其中NaCl的加入量，按反应液:NaCl为Iml:0.2g的比例计算。
[0012]上述的异辛酸制备过程中，步骤(2)中由于反应底物异辛醇在水中的溶解度较低，优选将异辛醇加入到有机助溶剂中，得到含有异辛醇的有机助溶剂，
然后再将含有异辛醇的有机助溶剂加入到含有热带假丝酵母{Candida tropical is)SIT201，CGMCC N0.9389静息细胞的缓冲溶液中，从而增大异辛醇的溶解度，进而提高产物异辛酸的产率；
所述的含有异辛醇的有机助溶剂，即将异辛醇加入到有机助溶剂中混合均匀得到，其中异辛醇和有机助溶剂的用量，按有机助溶剂:异辛醇为0.4-2ml:1mmol的比例计算；
所述有机助溶剂为二甲基亚砜、无水乙醇和甲醇中的一种或两种以上的组成的混合溶剂。
[0013]本发明的有益效果
本发明的一种热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389，首次作为生物催化剂催化异辛醇氧化产生异辛酸。
[0014]进一步，由于本发明的热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389生物催化剂易于制备、反应条件温和、无副产物，催化反应的选择性和产率高，因此生产成本较低，生产过程无污染，最终异辛酸的产率高达98%，具有潜在的工业应用前景。
【附图说明】
[0015]图1、利用热带假丝酵母菌SIT201，CGMCC N0.9389作为催化剂催化异辛醇氧化产生异辛酸的反应示意图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0017]本发发明所用的试剂皆为分析纯或化学纯规格。
[0018]检测方法:GC (气相色谱):进样器温度250°C，柱温100°C，氢火焰离子化检测器温度260 °C。
[0019]实施例1
热带假丝酵母菌{Candida tropicalis) SIT201，CGMCC N0.9389的培养，具体包括如下步骤:
(1)、培养基的配制
①、新鲜斜面培养基
所述的新鲜斜面培养基，按每升计算，由130g麦芽汁，15?20g琼脂和余量的水组成，ρΗ7.0 ；
②、发酵培养基I
所述发酵培养基1，按每升计算，由20g蔗糖或1ml烷烃l，4g (NH4) 2S04，7g KH2PO4, 2gNa2HPO4.12H20，1.5g MgSO4.7H20，1.5g 酵母膏，0.1g CaCl2.2Η20，0.008g FeCl2.4H