一种热带假丝酵母菌y2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种热带假丝酵母菌Y2及其应用。热带假丝酵母(Candida?tropicalis)Y2于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC?No：M2013726。本发明的热带假丝酵母菌(Candida?tropicalis)Y2具有丰富的营养，可应用于生产水产动物功能性饵料添加剂，同时可以海水养殖废物或废水为主要营养物来源，在按照质量体积比添加0～5‰蔗糖作为补充碳源的情况下，快速在海水养殖废物或废水中生长。其养殖废物发酵产物可作为腐食或滤食性水产动物的饲料；其养殖废水发酵产物可作为水产动物的饲料添加剂。
【专利说明】一种热带假丝酵母菌Y2及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于微生物应用【技术领域】，具体涉及一种热带假丝酵母菌Y2及其应用。
【背景技术】:
[0002]酵母营养丰富、大小适中，是很多生物优良的天然饵料，同时酵母也是一类腐生菌，可以分解多种物质，利用养殖水体中的有机物、氨氮、硫化氢等养殖废物，并形成优势种群，有效地抑制其它有害微生物的生长，起到生物防治的作用。近年来随着水产养殖技术的进步以及对水产动物营养需求了解的深入，酵母在水产养殖中的应用越来越广泛。
[0003]然而目前市场上可应用于海水养殖的酵母还非常少，常用的酵母仍然是来自于食品酿造的面包酵母(Saccharomyces cerevisiae),这种来自于陆生环境的酵母并不能适应海水环境，因此不能发挥净化海水水质的作用，其对于海洋水产动物生长的影响也缺乏科学的报道。基于此种情况，迫切需要分离适应于海洋环境的单细胞酵母用于海洋水产养殖。另一方面，酵母的大规模培养中，通常需要一些农副产品作为原料，增加了生产成本，因此需要探索新的替代营养源，以节省成本。
[0004]此外，近三十年来我国海水养殖规模及产量不断增加，目前已居世界首位，然而快速发展的同时也 带来了严重的环境污染问题。随着人们环保意识的提高，政府对于水产养殖的污物排放施行逐渐严格的控制，因此发展环境友好型水产养殖模式，走可持续的水产养殖发展道路成为必然趋势。目前，一些养殖废水处理方法虽然将养殖废物从水体中分离出去，但是不能有效的利用养殖废物。如何进行养殖废水、废物的资源化利用是发展环境友好型水产养殖模式必须要解决的问题。
【发明内容】
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[0005]本发明的第一个目的是提供一种具有高营养价值、高效利用海水养殖废物、废水且能改善发酵废物风味的热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2,该菌于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武汉大学，保藏编号=CCTCCNo:M2013726o
[0006]本发明所述的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2分离于广东深圳金鲳鱼养殖场排污口。酵母菌分离培养基为YPD酵母专用培养基。热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)Y2筛选培养基为对虾养殖废物培养基。本筛选的目的是获得能在对虾养殖废物培养基快速生长的酵母种类，分离的酵母将具有在低糖或无糖条件下利用养殖废物的能力。
[0007]热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的菌落形态特征和细胞形态特征:菌落在YPD培养基平板上培养24小时为白色，72小时后为白色，菌落圆形突起，干燥、表面光滑或部分有皱纹，无光泽，易挑取，有酒香味，细胞球形到椭圆形，单个或多个细胞相连，见出芽(如图1所示)。
[0008]热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2在对奸养殖废物培养基上生长状态与Yro培养基类似。
[0009]以酵母基因组提取试剂盒(购自Takara，China)提取DNA。PCR扩增并测序18SrDNA片段，其18S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示，将18S rDNA序列通过GeneBank中的BLAST软件与GeneBank数据库中的序列进行比对,热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2菌株的18S rDNA序列与多个热带假丝酵母菌株的18S rDNA序列关系最近，相似度达100%，且比对得分也很高。基于热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2菌株的18S rDNA序列及其相似序列构建的种系发生树也显示，热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌株的18SrDNA序列与Candida tropicalis (JQ008834)关系最近，以92%的支持率聚为一枝,确认该酵母菌为热带假丝酵母菌的新菌株，命名为热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2,该菌种已于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武汉大学，保藏编号:CCTCC No:M2013726。
[0010]经实验测定本发明的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2具有丰富的营养，因此，本发明的第二个目的是提供热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2在生产水产养殖动物的功能性饵料添加剂中的应用。
[0011]经发酵养殖废物测试，在养殖废物中添加2.5%。蔗糖的情况下，培养本发明的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y248h后，生物量达到4.05X 108cfu/g废物。但是鹿糖浓度过高时反而造成热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2的生物量下降。这与其它酵母生长要求较高的糖浓度明显不同。在热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2的分离时，发现其可以在不添加任何糖源的对虾养殖废物培养基平板上快速生长，而其它酵母不生长或生长缓慢。这一结果表明，热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2对糖分的要求低,特别适合于糖分相对缺乏的 水产养殖废物和废水的资源化处置。
[0012]因此，本发明的第三个目的是提供热带假丝酵母(Candida tropicalis)Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用。
[0013]所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用，具体方法为:先将热带假丝酵母菌Y2培养于Yro培养基中，形成种子液。每ι公斤养殖废物添加5~10公斤消毒海水，将种子液以2~5% (V/W)的比例添加其中，并按照质量体积比补充O~5%。的蔗糖作为碳源。室温经24~48小时培养，再自然沉降，弃上清，风干即为海水养殖废物发酵产物，从而达到养殖废物高值化利用目的。经发酵处理后，热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2大量繁殖,利用养殖废物积累自身的蛋白质，因此提高了养殖废物的再次作为营养物利用的价值；同时，海水养殖废物发酵产物呈现出明显的发酵香味，可以起到改善养殖废物再利用作饵料时的风味，提高动物摄食欲望，海水养殖废物发酵产物可直接作为海参、贝类等腐食及滤食经济动物的饵料。
[0014]本发明的第四个目的是提供热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用。
[0015]所述的热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用，具体方法为:先将热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2培养于YTO培养基中，形成种子液。将种子液以2~5% (V/V)的比例添加到经消毒处理的海水养殖废水中。按照质量体积比添加O~5%。的蔗糖作为碳源，充分搅动混匀，室温经24~48小时培养，发酵结束后，搅动池水，以水泵分别抽出池水分别通过箍有10目、20目、40目筛絹的网笼，过滤后的水体经自然沉降4小时，得到粘稠的白色膏体即为海水养殖废水发酵产物，得到的海水养殖废水发酵产物可以直接用于投喂水产养殖动物，也可以进一步干燥后包装成商品销售，从而达到养殖废水高值化利用目的。
[0016]本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis) Y2于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武汉大学，保藏编号:CCTCC No:M2013726。
【专利附图】
【附图说明】:
[0017]图1是热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2培养及细胞形态图。其中a:热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2在YPD平板上的菌落形态；b:热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2细胞形态,细胞球形或椭球形，出芽生殖，标尺=10 μ m ；c:热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌液呈白色；d:热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2菌株在对虾养殖废物平板上的菌落形态。
【具体实施方式】:
[0018]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用的方法及技术如无特别说明均为常规的方法及技术。
[0019]实施例1:
[0020]一、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2的分离、筛选及鉴定 [0021](I)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2的分离、筛选
[0022]取广东深圳金鲳鱼养殖场排水口污泥lg，加入灭菌海水10ml，混匀后取200 μ L涂布酵母菌分离培养基(YPD)平板，Yro为酵母专用培养基，制备方法为:葡萄糖(单独灭菌)20g,蛋白胨20g,酵母提取物1g,海水1L,灭菌后冷却加入lml50mg/ml的氯霉素。30°C培养48小时后，挑取生长菌落，纯化并保存，得到分离菌。
[0023]将上述分离菌培养于液体YPD中，分别取IyL点种于酵母菌筛选培养基，此筛选培养基为对虾养殖废物培养基平板，其制备方法为:虾粪干粉20g，琼脂粉20g，海水1L，灭菌后稍冷，加入lml50mg/ml的氯霉素。本筛选的目的是获得能在对虾养殖废物培养基快速生长的酵母种类，分离的酵母将具有在低糖或无糖条件下快速利用养殖废物的能力。30°C培养24小时后,记录生长菌落,挑出其中一株生长快、菌落大菌株记录为Y2。
[0024]热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2的菌落形态特征和细胞形态特征:菌落在YPD培养基平板上培养24小时为白色，72小时后为白色，菌落圆形突起，干燥、表面光滑或部分有皱纹，无光泽，易挑取，有酒香味，细胞球形到椭圆形，单个或多个细胞相连，见出芽(如图1所示)。
[0025](2)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2分子鉴定
[0026]采用锚定于真菌18S rDNA基因片段的引物，进行PCR扩增，并将PCR产物测序。引物序列为:EF3:5’ -TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3’ ；EF4:5’ -GGAAGGGRTGTAITTATTAG-3’。
[0027]菌株Y2 18S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。经blast比对及种系发生分析表明:Y2菌株的18S rDNA序列与多个热带假丝酵母菌株的18S rDNA序列关系最近，相似度达100%，且比对得分也很高。基于Y2菌株的18S rDNA序列及其相似序列构建的种系发生树也显示，Y2菌株的18S rDNA序列与Candida tropicalis (JQ008834)关系最近，以92%的支持率聚为一枝，确认该酵母菌为热带假丝酵母菌的新菌株，命名为热带假丝酵母(Candidatropicalis) Y2，该菌种已于2013年12月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉市武汉大学，保藏编号:CCTCC No:M2013726。
[0028]二、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2营养成分分析
[0029]采用凯氏定氮法(GB/T6432-94)对热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2的蛋白质含量进行测定，在培养2d时粗蛋白含量即达到56.1%，说明热带假丝酵母Y2的主要成分为蛋白质。该菌株的蛋白含量几乎为通常用于单细胞蛋白生产的面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)中蛋白质的含量(29%)的 2 倍。
[0030]以液相色谱法(GB/T18246-2000)测定热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2菌株氨基酸组成。其氨基酸组成见表1，结果表明:总水解氨基酸占细胞干重的45.5%%，其中必须氨基酸占总氨基酸的49.5%。水产动物饲料中赖氨酸是常见的限制性氨基酸，但是热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2的赖氨酸在必须氨基酸中含量是最高的。热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2与花刺参(Stichopus herrmanni)、凡纳滨对虫下(Litopenaeus vannamei)的氨基酸组成模式相似。热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)Y2对花刺参的氨基酸组成计算生物价为84.1，对凡纳滨对虾氨基酸成计算生物价为82.4。这一结果表明热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) Y2作为水产馆料具有良好的应用潜力。
[0031]表1热带假丝酵母Y2菌株氨基酸组成及与水产生物比较
[0032]
【权利要求】
1.热带假丝酵母菌(Candidatropicalis) Y2，其保藏编号:CCTCC No:Μ2013726。
2.权利要求1所述的热带假丝酵母菌(Candidatropicalis) Y2在生产水产养殖动物的功能性饵料添加剂中的应用。
3.权利要求1所述的热带假丝酵母菌(Candidatropicalis) Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用。
4.根据权利要求2所述的热带假丝酵母菌(Candidatropicalis) Y2在海水养殖废物资源化处置中的应用，且特征在于，具体方法为:先将热带假丝酵母菌Y2培养于YPD培养基中，形成种子液，每I公斤养殖废物添加5~10公斤消毒海水，将种子液以2~5% (V/W)的比例添加其中，并按照质量体积比补充O~5%。的蔗糖作为碳源，室温经24~48小时培养，再自然沉降，弃上清，风干即为海水养殖废物发酵产物。
5.权利要求1所述的热带假丝酵母菌(Candidatropicalis) Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用。
6.根据权利要求4所述的热带假丝酵母菌(Candidatropicalis) Y2在海水养殖废水资源化处置中的应用，且特征在于，具体方法为:先将热带假丝酵母菌(Candidatropicalis) Y2培养于YI3D培养基中，形成种子液，将种子液以2~5% (V/V)的比例添加到经消毒处理的海水养殖废水中，按照质量体积比添加O~5%。的蔗糖作为碳源，充分搅动混匀，室温经24~48小时培养，发酵结束后，搅动池水，以水泵分别抽出池水分别通过箍有10目、20目、40目筛絹的网笼，过滤后的水体经自然沉降4小时，得到粘稠的白色膏体即为海水养殖废水发酵产 物。
【文档编号】C12R1/74GK104031851SQ201410072606
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】罗鹏, 王艳红, 杨世平, 胡超群 申请人:中国科学院南海海洋研究所