专利名称：一种用于发酵生产核糖核酸的热带假丝酵母菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及ー种高产核糖核酸的酵母菌及其应用。
背景技术：
核糖核酸(Ribonucleic acid,简称RNA)是一类十分重要的生物大分子物质。RNA不仅在基因表达和蛋白质生物合成中起着关键作用，并且能促进细胞诸多生理功能。随着研究深入，核糖核酸在医药、保健、农业、食品加工等行业的应用前景越来越广。在医药上RNA作为重要的医药中间体，其降解后得到的核苷酸、核苷及碱基都是用途广泛的药物，它们的衍生物在抗肿瘤和抗病毒方面的应用则更为显著。科学研究证明人体的衰老与体内合成核酸能力的高低密切相关，随着年龄的增加，合成核酸的能力会逐渐减弱，造成体内核酸及组成成分的不足，产生人体各种衰老现象；在保护环境方面，核糖核酸作为绿色农药，具有很重要的意义。核糖核酸及其降解物的衍生物作为抗菌素，可用于防治植物病菌的农药，这类农药对人体无毒害，对环境无污染。盛建国等(食品エ业科技，2007，28 (I) : 140-142)分别以原糖液、糖化液和废糖蜜作为碳源培养热带假丝酵母K-79株，发现以原糖液为碳源时RNA含量最高为8. 6%。周震等(エ业微生物，2002，32 (3) 28-32)利用2%的葡萄糖培养热带假丝酵母QZN0209株，RNA含量达到13. 9%0离子注入技术作为ー种生物品种改良的新技术已在诱变育种、植物转基因、生命起源和进化以及环境辐射与人类健康等方面取得了ー些重要研究成果。其中，在微生物诱变育种的研究中，离子注入已广泛用于对微生物菌种的诱变育种，并取得了良好效果。离子注入与传统诱变源相比，除了具有能量沉积效应外，还有动量传递、质量沉积及电荷中和与交換效应，是ー种将物理诱变和化学诱变特性集于一身的综合诱变方法，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，強烈地影响生物细胞的生理、生化性能，造成遗传物质的基本単位-碱基的改变，诱发染色体结构变异。离子注入在很短的时间内同时发生能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷交換4个过程。离子束的溅射好比一把手木刀，对微生物体进行细微加工，使生物体表面层层剥离，后来的离子就可穿行较长的距离，落在预定的位置上(余增亮。生物技术引论[M]。安黴安徽科技出版社，1998)。中国科学院上海生物工程研究中心的陈祖华(微生物学报，2000，27 (3) :174-177)用N+离子注入诱变处理热带假丝酵母，经筛选，获得了 I株能够利用正十二烷烃发酵产生长链ニ元酸的高产菌，在底物浓度为15% (体积比)下产酸量由43.5% g/L上升到73.2% g/L。王纪(微生物学杂志，1998，18(4) 25-28)等通过离子注入诱变筛选得到一株遗传性能稳定的高产菌，得率较出发菌提高55% 60 %。虞龙(激光生物学报，1998，8，(3) :218 220)和姚建铭(生物工程学报，2000，4 (16) 47-48)分别用低能离子注入选育的VC高产菌株和花生四烯酸(AA)产生菌，其发酵水平双双创国内外新高
发明内容
、
本发明所要解决的技术问题是提供一株高产核糖核酸的菌株及利用该菌株进行发酵的适宜条件。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下—种用于发酵生产核糖核酸的热带假丝酵母菌，该热带假丝酵母菌的保藏编号为CGMCC No. 4204。这种作为生产菌株的高产核糖核酸的热带假丝酵母菌的分类命名为热带假丝酵母(Candida tropicalis)RJ-36,目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 4204，保藏日期为2010年09月30日。该菌株是通过对土壤筛选到的酵母菌进行低能离子束注入，然后将诱变后的菌株转接于平板培养基中培养，挑选单菌落转接于麦芽汁斜面培养，后经含碳源、氮源、无机盐和水的液体种子培养基和发酵培养基培养从而筛选出的核糖核酸高产菌。CGMCC No. 4204菌株具有下述性质I、菌落形态学特征在葡萄糖一酵母汁一蛋白胨液体培养基中培养，30°C，3天，细胞呈球形或卵球形，其中大小约I 5μηιΧ5 30μηι。在麦芽汁琼脂上菌落为白色到奶油色,无光泽或稍有光泽。软而平滑或部分有皱纹。培养时间长时，菌落变硬。在加盖玻片的玉米粉琼脂培养基上培养，可看到大量的假菌丝和芽生孢子。2、生理与生化特性菌株典型的兼性厌氧型单细胞真菌。在有氧的情况下，它进行有氧呼吸，排出ニ氧化碳；而在缺氧的条件下，其进行无氧呼吸，分解有机物(主要是葡萄糖)，产生酒精和水；该菌的最佳生长温度为32°C，最适pH值为4. O。3、营养特征该菌能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜或甘油。
、
本发明提供了一种高产RNA的热带假丝酵母菌株。本发明又提供了一种生产核糖核酸的发酵方法，该方法包括采用上述酵母菌在液体发酵培养基中发酵。本发明还提供了上述酵母菌在提高发酵生产核糖核酸的产量中的应用。在上述发酵方法中，液体种子培养基包括溶剂水，碳源I 300g/L，氮源I 100g/L，除此之外还含有无机盐O. 01 100g/L ;优选地液体种子培养基包括溶剂水，碳源10 30g/L，氮源10 30g/L，除此之外还含有无机盐0. I 10g/L ;进一步优选地，所述无机盐的含量为O. 6 I. 6g/L。在本发明的另ー个方面，液体发酵培养基包括溶剂水，碳源I 500g/L，氮源I 10g/L，磷酸0. I 5ml/L，除此之外还含有无机盐0. 01 10g/L ;优选地，所述发酵的液体发酵培养基包括溶剂水，碳源10 60g/L，氮源2 5g/L，磷酸0. 66 2ml/L，除此之外还含有无机盐0. 55 2. 4g/L ;进一步优选地，所述发酵的液体发酵培养基包括溶剂水，碳源30 47g/L,氮源3 4g/L,磷酸I. 3 2. 2ml/L,除此之外还含有无机盐I I. 5g/し其中，碳源可以选自葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜和甘油中的ー种或多种；氮源可以选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆和硫酸铵中的ー种或多种；无机盐可以选自钾盐、钠盐、镁盐、铁盐、盐酸盐中的ー种或多种。液体发酵培养基将其pH调节到2. 5 9. 5 ;优选地，调节到为4 6 ;进一步优选地，调节到为4 5。该pH调节可采用氨水进行。在上述发酵方法中，发酵温度可以为29 37°C，优选为30 33°C;发酵时间可以为12 20小时，优选为16 18小时。其中，发酵前按照体积比为I 30 100，优选为8 12 : 100的接种量接种。本发明的有益效果包括I.与传统的辐射法及化学诱变剂相比，离子束诱变具有损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定、易于获得理想新品种等特点。2.本发明的核糖核酸高产菌热带假丝酵母菌RJ-36 (CGMCC No. 4204)，具有高产性状稳定的特点，该菌株经过20代的传代，生产核糖核酸的性能保持稳定。3.本发明的核糖核酸高产菌热带假丝酵母菌RJ-36 (CGMCC No. 4204)能够利用多种碳源和氮源发酵生产核糖核酸，操作方便简单。牛物材料的保藏热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) RJ-36已经于2010年09月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 4204。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，实施例所描述的具体物料配比、エ艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所涵盖的本发明的范围。实施例I以从实验室分离得到的产核糖核酸的菌株为出发菌株，将经N+离子束诱变(低能、离子注入机靶室内真空度为2X10_4，注入能量为50kev，剂量为5X1013ions ·αιΓ2 -s^1)后的孢子悬浮液经无菌水稀释100倍后，取O. Iml涂布于麦芽汁平板培养基上30°C下培养3天，从中挑选单菌落在麦芽汁斜面培养3天。转接ー环于装有30mL液体种子培养基糖蜜(可购自上海实验试剂有限公司奥佳化工有限公司，以下同)30g/L，硫酸铵10g/L，酵母膏(北京奥博星生物技术有限责任公司，以下同)20g/L，氯化钾I. 5g/L，NaCl O. lg/L，pH 4. O)的500mL摇瓶中，于32°C下IlOrpm摇床培养24小时。再转接IOmL于装有IOOmL液体发酵培养基(糖蜜 47. 21g/L，(NH4)2SO4 2g/L,H3PO4 O. 66ml/L,MgSO4 O. 5g/L,FeSO4 0.05g/L，用氨水将培养基PH调节为4. O)的500mL摇瓶中，于32°C下240rpm摇床发酵培养16小时。经过初筛，得到90株比出发菌株产量高的突变株。用同样的条件下进行复筛，最終得到产量最高的菌株RJ-36，菌体RNA含量可达到菌体干重的17%，比原始菌株的9%提高了 8%。实施例2将菌株RJ-36从麦芽汁斜面转接ー环于装有30mL液体种子培养基(糖蜜10g/L，硫酸铵 5g/L，酵母膏 10g/L，氯化钾 O. lg/L，NaCl O. 5g/L，pH4. O)的 500mL 摇瓶中，于 33°C下IIOrpm摇床培养24小时。转接8mL于装有IOOmL液体发酵培养基(糖蜜60g/L，(NH4)2SO4I. Og/L，H3PO4 0. 66ml/L，MgSO4 0. 2g/L，FeSO4 2. 0g/L，用氨水将培养基 pH 调节为 5. 5)的500mL摇瓶中，于30°C下240rpm摇床发酵培养16小时。菌体RNA含量可达到菌体干重的15%。实施例3将菌株RJ-36从麦芽汁斜面转接ー环于装有30mL液体种子培养基(葡萄糖25g/L，硫酸铵15g/L，玉米浆(可购自华北制药集团有限责任公司，以下同)30g/L，氯化钾6g/L7NaCl 8g/L，pH 6. O)的500mL摇瓶中，于31°C下IlOrpm摇床培养24小时。转接IOmL于装有 IOOmL 液体发酵培养基(麦芽糖 47g/L，(NH4)2SO4 3g/L，H3PO4 lml/L，MgSO4 O. 8g/L,FeSO4 I. 6g/L，用氨水将培养基pH调节为5. O)的500mL摇瓶中，于32°C下240rpm摇床发酵培养17小吋。菌体RNA含量可达到菌体干重的16%。实施例4将菌株RJ-36从麦芽汁斜面转接ー环于装有30mL液体种子培养基(甘油40g/L，硫酸铵 30g/L，尿素 20g/L，氯化钾 10g/L，NaCl 5g/L，pH 4. O)的 500mL 摇瓶中，于 30°C下IlOrpm摇床培养24小吋。转接12mL于装有IOOmL液体发酵培养基(蔗糖30g/L，(NH4)2SO44g/L, H3PO4 I.、 5ml/L，MgSO4 I. 5g/L，FeSO4 0. 8g/L，用氨水将培养基 pH 调节为 4. O)的500mL摇瓶中，于32°C下240rpm摇床发酵培养18小时。菌体RNA含量可达到菌体干重的16%。实施例5将菌株RJ-36从麦芽汁斜面转接ー环于装有30mL液体种子培养基(麦芽糖40g/し硫酸铵30g/L，蛋白胨30g/L，氯化钾10g/L，NaCl 5g/L，pH 6. O)的500mL摇瓶中，于33°C下IlOrpm摇床培养24小吋。转接12mL于装有IOOmL液体发酵培养基(葡萄糖10g/L，(NH4)2SO4 5g/L，H3PO4 2ml/L，MgSO4 2g/L，FeSO4 0. 2g/L，用氨水将培养基 pH 调节为 5. 0)的500mL摇瓶中，于33°C下240rpm摇床发酵培养18小时。菌体RNA含量可达到菌体干重的 15%。实施例6将菌株RJ-36连续传10代，在实施例3的培养条件下进行发酵培养，生产核糖核酸。结果表明(见表I和2)，连续10代遗传培养，菌株RJ-36与未经离子束诱变的出发菌株No. 121相比，生产核糖核酸的性能稳定。表I连续传I 5代的菌株No. 121的生产核糖核酸性能
_遗传代数—I _ 2 _3_4_5_
RNA (%) 97496表2连续传6 10代的菌株No. 121的生产核糖核酸性能
遗传代数 6 7 8 9 10-RNA (%) 5 _ 8 _4_6_4.5_表3连续传I 5代的菌株RJ-36的生产核糖核酸性能
权利要求
1.一种用于发酵生产核糖核酸的热带假丝酵母菌(Candida tropicalis),其特征在于，所述热带假丝酵母菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4204，保藏日期为2010年09月30日。
2.一种发酵生产核糖核酸的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求I所述的热带假丝酵母菌进行发酵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的液体种子培养基包括溶剂水，碳源I 300g/L，氮源I 100g/L，除此之外还含有无机盐O. 01 100g/L ;优选地，所述发酵的液体种子培养基包括溶剂水，碳源10 30g/L，氮源10 30g/L，除此之外还含有无机盐0. I 10g/L ;进一步优选地，所述无机盐的含量为0. 6 I. 6g/L。
4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵的液体发酵培养基包括溶剂水，碳源I 500g/L,氮源I 10g/L,磷酸0. I 5ml/L,除此之外还含有无机盐0. 01 10g/L ;优选地，所述发酵的液体发酵培养基包括溶剂水，碳源10 60g/L，氮源2 5g/L，磷酸0. 66 2ml/L，除此之外还含有无机盐0. 55 2. 4g/L ;进一步优选地，所述发酵的液体发酵培养基包括溶剂水，碳源30 47g/L，氮源3 4g/L，磷酸I. 3 2. 2ml/L，除此之外还含有无机盐I I. 5g/L。
5.根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其特征在于，所述碳源选自糖蜜、葡萄糖、甘油、麦芽糖、蔗糖中的ー种或多种。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述氮源选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、尿素和硫酸铵中的ー种或多种。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自钾盐、钠盐、镁盐、铁盐、盐酸盐、硫酸盐中的ー种或多种。
8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的初始pH为2. 5 9. 5 ;优选地，所述液体发酵培养基的初始pH为4 6 ;进一步优选地，为4 5。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其特征在干，所述发酵的温度为29 37°C，发酵的时间为12 20小时；优选地，所述发酵的温度为30 33°C，发酵的时间为16 18小时。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵前按照体积比为I 30 : 100的接种量接种；优选地，所述发酵前按照体积比为8 12 : 100的接种量接种。
11.权利要求I所述的热带假丝酵母菌在发酵生产核糖核酸中的应用。
全文摘要
本发明提供一种用于发酵生产核糖核酸的热带假丝酵母菌及其应用，该热带假丝酵母菌的保藏编号为CGMCC No.4204。保藏编号为CGMCC No.4204的本发明的热带假丝酵母菌RJ-36菌株菌体RNA含量可达到菌体干重的17％，比出发菌株的RNA产量提高了8％。该菌株经过10代以上传代，生产RNA的性能保持稳定。
文档编号C12P19/34GK102676406SQ201110063488
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者任华景, 吴菁岚, 应汉杰, 曹家明, 柏建新, 熊健, 谢婧婧, 陈勇, 陈晓春 申请人:南京同凯兆业生物技术有限责任公司, 南京工业大学