专利名称：：一种假丝酵母菌株及生产d-阿拉伯醇的方法
技术领域：
：本发明涉及一种假丝酵母菌株，以及利用该假丝酵母将葡萄糖代谢成为D-阿拉伯醇的方法。
背景技术：
：D-阿拉伯醇(D-arabitol)是一种五糖醇，广泛存在于自然界，是耐高渗微生物的重要产物之一，主要应用在食品、化工、医药等行业。目前，D-阿拉伯醇最具市场潜力的用途在于作为原料合成木糖醇。对于积累D-阿拉伯醇菌株的研究，国外始于20世纪中期，而国内起步比较晚且至目前为止鲜有报道。据报道，绝大多数耐高渗菌株都能够合成D-阿拉伯醇，可能的原因是D-阿拉伯醇能够保护高渗条件下的细胞，其中主要包括曲霉菌属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、小丛梗孢属(Moniliella)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kodamae)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、毕赤酵母属(Pichia)、青霉菌属(Penicillium)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)，但大部分菌株对D-阿拉伯醇的产率较低只有10X左右。目前有见报道的D-阿拉伯醇高产菌株见表1，其中主要是真菌，且大部分菌株的0-阿拉伯醇对葡萄糖的转化率在30%40%左右、发酵周期在72小时300小时、存在甘油、其他糖醇等副产物，这些因素直接限制了生物法的工业化应用。D-阿拉伯醇的转化底物可以分为碳氢化合物(C^，C14，C15，C16)、碳水化合物、酒精等，虽然碳氢化合物和酒精的成本比较低但转化率只有20%左右，而碳水化合物(主要是葡萄糖)的转化率能达到30%40%，因此葡萄糖是最主要的转化底物。伴随着木糖醇市场需求的激增和直接转化D-阿拉伯醇为木糖醇菌株的发现，D-阿拉伯醇日益显现作为木糖醇合成前体的重要性，获得一株发酵周期短、产率高、副产物少、符合工业化要求的菌株就显得至关重要。表1部分D-阿拉伯醇高产菌株的发酵水平<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
发明内容本发明的目的是提供一种新的生产D-阿拉伯醇的假丝酵母菌株。本发明的发明人经过长期的研究，从花粉中首次筛选分离得到一株高产D-阿拉伯醇的菌株，经鉴定为假丝酵母(Candidasp.)。该菌株命名为假丝酵母H2(Candidasp.H2)，它不同于已报道的高产D-阿拉伯醇的假丝酵母菌株。本发明涉及的微生物假丝酵母菌株H2已于2009年8月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.3255。目前鉴定菌种的方法有很多，如经典的分类鉴定法、化学分类法、遗传学分类法等。本发明鉴定菌株是通过近年新发展起来的真菌26SrDNADl/D2区域序列分析法，具体鉴定路线包括(l)基因组抽提；(2)引物设计合成；(3)PCR扩增；(4)PCR产物纯化；(5)测序;(6)在线BLAST分析。本发明提供的假丝酵母菌株的26SrDNADl/D2区域序列与SEQIDNO:1序列一致。本发明的另一个目的是提供一种使用上述假丝酵母菌株生产D-阿拉伯醇的方法。为实现本发明目的，本发明使用假丝酵母菌株生产D-阿拉伯醇的方法是先在含有葡萄糖和酵母抽提物的种子液体培养基中培养所述假丝酵母菌株得到假丝酵母的种子菌，然后将所述假丝酵母的种子菌接于含有葡萄糖和酵母抽提物的发酵液体培养基中发酵产生D-阿拉伯醇。进一步地，本发明所述发酵液体培养基中的葡萄糖相对于该发酵液体培养基的浓度为150g/l350g/l。进一步地，本发明所述发酵液体培养基中的葡萄糖相对于该发酵液体培养基的浓度为200g/l300g/l。进一步地，本发明所述发酵液体培养基中的酵母抽提物相对于该发酵液体培养基的浓度为5g/l15g/l。进一步地，本发明所述发酵液体培养基中的酵母抽提物相对于该发酵液体培养基的浓度为8g/112g/l。进一步地，本发明进行所述发酵的条件为发酵液体培养基的pH为4.010.0、发酵温度为25t:4(rC、假丝酵母的种子菌的接种量相对于所述发酵液体培养基的体积为0.5ml/100ml-10ml/100ml、发酵时间为24小时240小时。进一步地，本发明进行所述发酵的条件为发酵液体培养基的pH为5.08.0、发酵温度为30°C37°C、假丝酵母的种子菌的接种量相对于所述发酵液体培养基的体积为0.5ml/100ml-2.5ml/100ml、发酵时间为72120小时。与现有技术相比，本发明提供了一种新的可用于生产的D-阿拉伯醇的假丝酵母菌株；使用本发明假丝酵母H2(Candidasp.H2)生产的D-阿拉伯醇可达到较高产量，其积累量可达到86.55g的高水平。生物材料样品的保藏信息保藏的生物材料样品假丝酵母H2(Candidasp.H2);保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC);保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编:100101);保藏日期2009年8月28日；保藏登记号CGMCCNo.3255。具体实施例方式下面进一步说明本发明。下面的实施仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的保护范围。实施例1:取少许样品如新鲜水果、腐烂水果、花粉、土壤、蜂巢和新鲜蜂蜜等于筛选固体培养基中培养3天；后利用涂布法铺于保藏固体培养基上培养2-3天；挑选不同菌落形态的菌株于保藏固体培养基，置于4t:冰箱保存待用。本实施例共筛得420株耐高渗菌株。接耐高渗菌株于发酵液体培养基中培养6天；后取发酵液离心留上清；利用薄层层析法定性检测D-阿拉伯醇。本发明涉及的薄层层析法的展开体系为丁酮丙酮水=10:1:1(ml/ml/ml)，显色方法为高碘酸钠-联苯胺法(lg/L高碘酸钠；1.4g联苯胺溶于80ml95X乙醇，70ml蒸馏水，30ml丙酮，1.5ml盐酸静置12h备用)，通过薄层层析法定性获得105株产D-阿拉伯醇菌株。利用HPLC对105株产D-阿拉伯醇菌株进行定量检测，获得10株产量超过40gD-阿拉伯醇/L发酵液的菌株，其中一株菌株的产量最高达到50gD-阿拉伯醇/200g葡萄糖，并将该菌株命名为菌株H2。以菌株H2为出发菌株作进一步研究。本发明涉及的HPLC法为Agilent1200HPLC，色谱柱为ZORBAXCarbohydrateAnalysisColumn(4.6X250mm，5iim);流动相为水乙腈=20:80(ml/ml);流速为lml/min;柱温为30°C;检测器为示差检测器。此外，通过真菌26SrDNADl/D2区域序列分析法对所获菌株H2进行鉴定，方法如下1、模版DNA的提取在培养基中挑取菌体于101灭菌水中变性后离心去上清作为模板。反应条件为:99°C，lOmin。2、PCR扩增使用TaKaRaFungiIdentificationPCRKit(CodeNo.D317)，进行PCR扩增目的片段。PCR反应体系包括上述1的变性反应液liU，PCRPremix25iU，Dl/D2Forwardprimer0.5u1，Dl/D2Reverseprimer0.5u1，dH2023u1，总体积50u1。反应条件为94°C5minl个循环94。C0.5rninT72°C5minl个循环3、PCR产物鉴定和回收取5ii1PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳鉴定，后使用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.2(CodeNo.DV805A)切胶回收目的片段进行DNA测序。4、测序以SEQIDNO:2为引物进行DNA测序。SeqForward:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'(SEQIDNO:2)5、鉴定将26SrDNADl/D2区域序列的测序结果与NCBI数据库中的序列信息进行BLAST比对，确定菌株H2为假丝酵母(Candidasp.)，并将该菌株H2命名为假丝酵母H2(Candidasp.H2)。本发明假丝酵母H2(Candidasp.H2)的26SrDNADl/D2区序列BLAST结果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例2:将培养23天的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，琼脂粉15g/1，115t:灭菌20分钟)接于装有20ml种子液体培养基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，121。C灭菌20分钟)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养24小时，吸取lml的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)的种子菌液体接于装有100ml发酵液体培养基(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，pH7.0，115t:灭菌20分钟)的500ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养144小时，结果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例3实施例8:实施例3实施例8的培养方法中，葡萄糖相对于发酵液体培养基的浓度如表1所示，其余培养条件与实施例2相同，结果如表3所示。实施例9将培养23天的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，琼脂粉15g/1，115t:灭菌20分钟)接于装有20ml种子液体培养基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC灭菌加分钟)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养24小时，吸取lml的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)种子菌液体接于装有100ml发酵液体培养基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物lg/1，pH7.0，115t:灭菌20分钟)的500ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养144小时，结果如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例10实施例14:实施例10实施例14的培养方法中，酵母抽提物相对于发酵液体培养基的浓度如表2所示，其余培养条件与实施例9相同，结果如表4所示。实施例15将培养23天的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，琼脂粉15g/1，115t:灭菌20分钟)接于装有20ml种子液体培养基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC灭菌加分钟)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养24小时，吸取lml的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)种子菌液体接于装有100ml发酵液体培养基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物10g/1，pH7.0，115t:灭菌20分钟)的500ml三角瓶中，25°C、200rpm振荡培养144小时，结果如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例16实施例18:实施例16实施例18的培养方法中的发酵温度如表5所示，其余培养条件与实施例15相同，结果如表5所示。实施例19:将培养23天的上述假丝酵母ffi(Candidasp.ffi)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，琼脂粉15g/1，115t:灭菌20分钟)接于装有20ml种子液体培养基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC灭菌加分钟)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养24小时，吸取lml的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)种子菌液体接于装有100ml发酵液体培养基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物10g/1，pH4，115t:灭菌20分钟)的500ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养144小时，结果如表6所示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例20实施例25:实施例20实施例25的培养方法中的pH如表6所示，其余培养条件与实施例19相同，结果如表6所示。实施例26将培养23天的上述假丝酵母ffi(Candidasp.ffi)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，琼脂粉15g/1，115t:灭菌20分钟)接于装有20ml种子液体培养基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC灭菌加分钟)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养24小时，吸取0.5ml的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)种子菌液体接于装有100ml发酵液体培养基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物10g/1，pH6，115t:灭菌20分钟)的500ml三角瓶中，37°C、200rpm振荡培养144小时，结果如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例27实施例30:实施例27实施例30的培养方法中，假丝酵母的种子菌的的接种量如表5所示，其余培养条件与实施例26相同，结果如表7所示。实施例31将培养23天的上述假丝酵母ffi(Candidasp.ffi)的斜面(葡萄糖100g/l，酵母抽提物10g/1，琼脂粉15g/1，115t:灭菌20分钟)接于装有20ml种子液体培养基(葡萄糖20g/l，酵母抽提物10g/1，^rC灭菌加分钟)的100ml三角瓶中，30°C、200rpm振荡培养24小时，吸取lml的上述假丝酵母H2(Candidasp.H2)种子菌液体接于装有100ml发酵液体培养基(葡萄糖250g/1，酵母抽提物10g/1，pH6，115t:灭菌20分钟)的500ml三角瓶中，37°C、200rpm振荡培养24小时，结果如表8所示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><400>1ggcagtatcgacaaagactataacacactaccgaggcagtgccacatttctttgcaattg60tcctaccgcccaaactgatgctggcccggtaaactgtagaggccacccccgagagagtaa120catacaaaataccaagtctgatctcaagcccttccctttcaacaatttcacgtacttttt180cactctcttttcaaagttcttttcatctttccatcactgtacttgttcgctatcggtctc240tcgccaatatttagctttagatggaatttaccacccacttagagctgcattcccaaacaa300ctcgactcttcgaaggaactttacataggtctgggacatctcatcgcacgggattctcac360cctctgtgacgttctgttccaagaaacatagacaagagccagacccaaagataccttctt420caaattacaactcggacactgaaagtgccagatttcaaatttgagcttttgccgcttcac480tcgccgctactaaggcaatccctgttggttt51权利要求一种假丝酵母菌株，其特征在于它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.3255；该菌株的26SrDNAD1/D2区域序列如SEQIDNO1所示。2.—种使用权利要求l的假丝酵母菌株生产D-阿拉伯醇的方法，其特征在于先在含有葡萄糖和酵母抽提物的种子液体培养基中培养所述假丝酵母菌株得到假丝酵母的种子菌，然后将所述假丝酵母的种子菌接于含有葡萄糖和酵母抽提物的发酵液体培养基中发酵产生D-阿拉伯醇。3.根据权利要求2所述的生产D-阿拉伯醇的方法，其特征在于所述发酵液体培养基中的葡萄糖相对于该发酵液体培养基的浓度为150g/l350g/l。4.根据权利要求3所述的生产D-阿拉伯醇的方法，其特征在于所述发酵液体培养基中的葡萄糖相对于该发酵液体培养基的浓度为200g/l300g/l。5.根据权利要求2所述的生产D-阿拉伯醇的方法，其特征在于所述发酵液体培养基中的酵母抽提物相对于该发酵液体培养基的浓度为5g/l15g/l。6.根据权利要求5所述的生产D-阿拉伯醇的方法，其特征在于所述发酵液体培养基中的酵母抽提物相对于该发酵液体培养基的浓度为8g/l12g/l。7.根据权利要求2所述的生产D-阿拉伯醇的方法，其特征在于进行所述发酵的条件为发酵液体培养基的pH为4.010.0、发酵温度为25t:4(rC、假丝酵母的种子菌的接种量相对于所述发酵液体培养基的体积为0.5ml/100ml-10ml/100ml、发酵时间为24小时240小时。8.根据权利要求7所述的生产D-阿拉伯醇的方法，其特征在于进行所述发酵的条件为发酵液体培养基的pH为5.08.0、发酵温度为3(TC37t:、假丝酵母的种子菌的接种量相对于所述发酵液体培养基的体积为0.5ml/100ml-2.5ml/100ml、发酵时间为72120小时。全文摘要本发明公开了一种假丝酵母菌株及生产D-阿拉伯醇的方法，该假丝酵母菌株Candidasp.H2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.3255；该菌株的26SrDNAD1/D2区域序列如SEQIDNO1所示。本发明使用上述假丝酵母菌株生产D-阿拉伯醇的方法是先在含有葡萄糖和酵母抽提物的种子液体培养基中培养所述假丝酵母菌株得到假丝酵母的种子菌，然后将所述假丝酵母的种子菌接于含有葡萄糖和酵母抽提物的发酵液体培养基中发酵产生D-阿拉伯醇。与现有技术相比，本发明提供了一种新的可用于生产的D-阿拉伯醇的假丝酵母菌株；使用本发明假丝酵母H2(Candidasp.H2)生产的D-阿拉伯醇可达到较高产量，其积累量可达到86.55g的高水平。文档编号C12R1/72GK101691543SQ20091015317公开日2010年4月7日申请日期2009年9月24日优先权日2009年9月24日发明者宋卫斌,张建国,谢志鹏申请人:杭州宝晶生物化工有限公司