一种假丝酵母菌及一种微生物代谢制备d-缬氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物代谢制备D-缬氨酸的方法，利用从土壤中筛选出的一株假丝酵母制备高纯度医药级D-缬氨酸的方法，主要步骤包括：将该菌株在30℃、300-400rpm的条件下培养24-28h，离心取菌体。将菌体加入含有DL-缬氨酸的溶液中，利用菌体代谢掉其中的L-缬氨酸，代谢过程中2-4小时调节pH，使其pH维持在6.0-6.2之间，反应144-168小时pH不再上升时结束。离心除去菌体，于上清液中加入活性炭90-100℃脱色30-40min，过滤、浓缩、结晶、烘干得到高纯度医药级的D-缬氨酸。该方法成本较低，过程简单，可用于大规模生产。
【专利说明】一种假丝酵母菌及一种微生物代谢制备D-缬氨酸的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及D-缬氨酸的制备，更具体地说，涉及一种基于微生物代谢制备D-缬氨酸的方法。
【背景技术】
[0002]目前市场上的D-缬氨酸主要是由化学法生产、酶拆分法生产，通过手性柱分离或者是采用氨基酰化酶拆分N-乙酰DL-缬氨酸的工艺，经浓缩、醇析、除盐、水解、精制、烘干得到D-缬氨酸。采用化学法生产的D-缬氨酸成分中其阈值不高，只能达到95%左右，同时生产过程中会采用大量的化学试剂,不仅成本高,收率低，同时生产过程中会产生大量的有机物、无机盐、固废和有机废水，对环境不友好。微生物不对称降解的原理生产D-缬氨酸不仅阈值高，收率高、生产成本低，而且采用的生物技术是国家鼓励类的生产工艺。
【发明内容】
[0003]针对上述问题，本发明提供了一种以DL-缬氨酸为原料及反应底物生产D-缬氨酸的生物方法，利用假丝酵母代谢DL-缬氨酸中的L-缬氨酸制备得到纯度为99.5-99.9%D-缬氨酸，具有生产过程简单、条件温和、生产过程无污染、产品纯度高的特点。
[0004]为了达到上述目的，本发明提供一种微生物有氧发酵生产D-缬氨酸。首先本发明提供了一种假丝酵母菌(Candida sp.) DLPU_D_Val，，保藏编号为CGMCC N0.7786。
[0005]本发明还提供了利用假丝酵母菌DLPU-D-Val制备D-缬氨酸的应用。
[0006]具体说，本发明一种微生物代谢制备D-缬氨酸的方法，向含有DL-缬氨酸的发酵培养基中加入假丝酵母菌体DLPU-D-Val进行有氧发酵，制得到D-缬氨酸；所述假丝酵母菌体 DLPU-D-Val 保藏编号为 CGMCC N0.7786。
[0007]优选方式下，以体积质量百分比计所述发酵培养基成分:6-8%DL_缬氨酸，0.1~1.0%的葡萄糖或蔗糖或麦芽糖，0.2~2.0%的蛋白胨，酵母膏0.2~1.5%, 0.2~0.5%磷酸氢二钾，0.3~1.0%磷酸二氢钾，0.05~0.15%硫酸镁，0.005~1.0%氯化钙，5.0~10
毫克每升三氯化铁，4.0~8.0毫克每升硫酸锌。
[0008]发酵过程:将菌体加入发酵培养基中，30~32°C、300~400rpm下进行有氧发酵，过程中每隔2-4小时调节pH,使其pH维持在6.0-6.2之间，144-168小时pH不再上升时结束；发酵结束后，发酵液80-90°C杀菌30-40分钟。用离心机离心发酵液，去除菌体，发酵清液用0.5-1.0%活性炭在90-10(TC脱色30-40分钟，脱色液减压浓缩，真空度大于-0.085MPa，待浓缩液中出现大量晶体时，停止浓缩，冷却到室温，抽滤，湿晶体用甲醇漂洗,90-10CTC烘干得D-纟颜氨酸成品。
[0009]上述发酵过 程中调节pH选用10%硫酸。
[0010]此外本发明还提供了假丝酵母菌体的活化获取方法，包括如下步骤:
[0011]1、配制斜面培养基，以体积质量百分比计包括:0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%琼脂粉;121。C灭菌30min ；[0012]2、将假丝酵母菌种接入所述斜面培养基中30°C、300~400rpm的条件下培养24~28h，离心取菌体。
[0013]本发明是利用从土壤中筛选出的一株假丝酵母制备高纯度医药级D-缬氨酸的方法，属发酵工程领域。。该菌株具有不对称降解能力，利用微生物不对称降解的原理，通过微生物降解DL-缬氨酸中的L-缬氨酸而不降解D-缬氨酸，再在发酵液中提纯制备D-缬氨酸。本发明方法成本较低，过程简单，可用于大规模生产。本发明摒弃传统的化学方法，不使用有机溶剂，无废水、盐和固废产生，是一种绿色生产工艺。
[0014]保藏说明
[0015]本发明涉及的生物材料样品的保藏信息:参据的微生物(株)为DLPU-D-Val，分类命名为假丝酵母(Candida sp.)，于2013年6月13日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC N0.7786。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
【具体实施方式】
[0016]本发明提供了一种过程简单，成本较低，利用DL-缬氨酸生产高纯度D-缬氨酸的生产方法。具体通过以下技术方案实现:
[0017]从土壤中筛选出可以代谢L-缬氨酸而不利用D-缬氨酸的假丝酵母(Candidasp.) DLPU-D-Val，保藏号为 CGMCC N0.7786 (以下简称 7786)。
[0018]配制斜面培养基(培养基中的成分以体积质量百分比计):0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%琼脂粉，121。。灭菌30min。
[0019]将菌种接入上述斜面培养基中30°C、300~400rpm的条件下培养24~28h，离心取菌体。·
[0020]配制发酵培养基(培养基中的成分以体积质量百分比计):6-8%DL-缬氨酸，葡萄糖或蔗糖或麦芽糖中的一种0.1~1.0%，蛋白胨0.2~2.0%，酵母膏0.2~1.5%，0.2~0.5%磷酸氢二钾，0.3~1.0%磷酸二氢钾，0.05~0.15%硫酸镁，0.005~1.0%氯化钙，5.0~
10毫克每升三氯化铁，4.0~8.0毫克每升硫酸锌。
[0021]将菌体加入发酵培养基中，加入量为:每100ml发酵培养基中加入2-4克湿菌体。而后在30~32°C、300~400rpm下进行发酵反应，反应过程中每隔2~4小时滴加10%的硫酸调节PH，使其维持在6.0~6.2之间，144~168小时pH不再上升时结束。
[0022]离心除去菌体，上清液中加入活性炭90~100°C脱色30~40min，过滤、浓缩、结晶、烘干得到高纯度(99.5~99.9%)医药级标准D-缬氨酸。
[0023]实施例1:
[0024]先将本发明提供的菌种在斜面培养基上培养，30°C培养24小时。
[0025]配制发酵培养基配方，称取DL-缬氨酸7克、葡萄糖0.5克、蛋白胨1.0克、酵母膏1.0克，磷酸二氢钾0.25克，磷酸氢二钾0.5克，硫酸镁0.1克，氯化钙0.01克，三氯化铁
0.56毫克，硫酸锌0.5毫克，自然pH，用自来水定容到100毫升装在1000毫升的三角烧瓶中，121°C灭菌20分钟，备用。
[0026]将7786培养的菌接种于装有消毒后的100ml发酵培养基中，加入量为--每100ml发酵培养基中加入4克湿菌体。而后在30°C培养，摇床转速为315rpm，发酵24小时后开始流加10%硫酸，每隔2-4小时流加一次，pH维持在6.0-6.2之间，发酵150小时后发酵液的PH值不再变化，发酵结束。
[0027]发酵液80°C杀菌30分钟，用离心机离心除菌后，上清液100毫升加入0.6克的活性炭95°C脱色30min，趁热抽滤，除去活性炭，取脱色清液减压浓缩(真空为_0.090MPa)到有晶体出现后停止，冷却至室温，抽滤。晶体用甲醇50毫升漂洗，离心得到晶体，95°C烘干3小时。得到D-缬氨酸3.1克。收率为44.29%。经过高效液相色谱法测定D-缬氨酸的阈值为 99.58%ο
[0028]实施例2:
[0029]先将菌种7786在斜面培养基上培养，30°C培养24小时。
[0030]配制发酵培养基配方，称取DL-缬氨酸15克、葡萄糖1.0克、蛋白胨2.0克、酵母膏2.0克，磷酸二氢钾0.5克，磷酸氢二钾1.0克，硫酸镁0.2克，氯化钙0.02克，三氯化铁
1.12毫克，硫酸锌1.0毫克，自然pH，用自来水定容到200毫升装在3000毫升的三角烧瓶中，121°C灭菌20分钟，备用。
[0031]将7786活化的菌接种于装有消毒后发酵的200ml发酵培养基中，加入量为:每100ml发酵培养基中加入4克湿菌体。而后在31°C培养，摇床转速为350rpm，发酵24小时后开始流加10%硫酸，每隔2-4小时流加一次，pH维持在6.0-6.2之间，发酵148小时后发酵液的PH值不再变化，发酵结束。
[0032]发酵液85°C杀菌35分钟，用离心机离心除菌后，上清液200毫升加入1.4克的活性炭90°C脱色35min，趁热 抽滤，除去活性炭，取脱色清液减压浓缩(真空度为_0.090MPa)到有晶体出现后停止，冷却至室温，抽滤。晶体用甲醇100毫升漂洗，离心得到晶体，93°C烘干4小时。得到D-缬氨酸6.1克。收率为40.67%。经过高效液相色谱法测定D-缬氨酸的阈值为99.88%ο
[0033]实施例3:
[0034]先将菌种7786在斜面培养基上培养，30°C培养24小时。
[0035]配制发酵培养基配方，称取DL-缬氨酸30克、葡萄糖2.0克、蛋白胨4克、酵母膏
4.0克，磷酸二氢钾I克，磷酸氢二钾2克，硫酸镁0.4克，氯化钙0.04克，三氯化铁2.24毫克，硫酸锌2毫克，自然pH，用自来水定容到400毫升装在3000毫升的三角烧瓶中，121°C灭菌20分钟，备用。
[0036]将7786活化的菌接种于装有消毒后的400ml发酵培养基中，加入量为:每100ml发酵培养基中加入2-4克湿菌体。而后在32°C培养，摇床转速为332rpm，发酵24小时后开始流加10%硫酸，每隔2-4小时流加一次，pH维持在6.0-6.2之间，发酵160小时后发酵液的PH值不再变化，发酵结束。发酵液90°C杀菌30分钟，用离心机离心除菌后，上清液400毫升加入3.2克的活性炭98°C脱色35min，趁热抽滤，除去活性炭，取脱色清液减压浓缩(真空度为-0.090MPa)到有晶体出现后停止,冷却至室温,抽滤。晶体用甲醇100毫升漂洗,离心得到晶体，92°C烘干3.5。得到D-缬氨酸13.0克。收率为43.33%。经过高效液相色谱法测定D-缬氨酸的阈值为99.98%。
[0037]本发明针对含有DL-缬氨酸的发酵培养基，仅降解L-缬氨酸而不降解D-缬氨酸，最后制得高纯度的D-缬氨酸。以DL-缬氨酸计算D-缬氨酸的收率在40-45%，用高效液相色谱柱测定D-缬氨酸纯度为99.5-99.9%。[0038]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同 替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.假丝酵母菌(Candidasp.) DLPU_D_Val，其特征在于，保藏编号为CGMCC N0.7786。
2.权利要求1所述假丝酵母菌DLPU-D-Val在制备D-缬氨酸的应用。
3.—种微生物代谢制备D-缬氨酸的方法，其特征在于，向含有DL-缬氨酸的发酵培养基中加入假丝酵母菌体DLPU-D-Val进行有氧发酵，制得到D-缬氨酸； 所述假丝酵母菌体DLPU-D-Val保藏编号为CGMCC N0.7786。
4.根据权利要求3所述微生物代谢制备D-缬氨酸的方法，其特征在于，以体积质量百分比计所述发酵培养基成分:6-8%DL-缬氨酸，0.1~1.0%的葡萄糖或蔗糖或麦芽糖，.0.2~2.0%的蛋白胨，酵母膏0.2~1.5%, 0.2~0.5%磷酸氢二钾，0.3~1.0%磷酸二氢钾，0.05~0.15%硫酸镁，0.005~1.0%氯化钙，5.0~10毫克每升三氯化铁，4.0~8.0 毫克每升硫酸锌； 发酵过程:将菌体加入发酵培养基中，30~32°C、300~400rpm下进行有氧发酵，过程中每隔2-4小时调节pH，使其pH维持在6.0-6.2之间，pH不再上升时结束； 发酵结束后，发酵液80-90°C杀菌30-40分钟。用离心机离心发酵液，去除菌体，发酵清液用0.5-1.0%活性炭在90-100°C脱色30-40分钟，脱色液减压浓缩，真空度大于-0.085MPa,待浓缩液中出现大量晶体时，停止浓缩，冷却到室温，抽滤，湿晶体用甲醇漂洗,90-10CTC烘干得D-纟颜氨酸成品。
5.根据权利要求4所述微生物代谢制备D-缬氨酸的方法，其特征在于，发酵过程中调节pH选用10%硫酸。
6.根据权利要求3-5任一所述微生物代谢制备D-缬氨酸的方法，其特征在于，所述假丝酵母菌体的活化获取: S1、配制斜面培养基，以体积质量百分比计包括:0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%琼脂粉;121。。灭菌30min ； S2、将假丝酵母菌种接入所述斜面培养基中30°C、300~400rpm的条件下培养24~.28h，离心取菌体。
【文档编号】C12R1/72GK103667088SQ201310689801
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】张春枝, 毕妍, 浦军平, 陈莉, 陈明, 祖国仁 申请人:大连工业大学