利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法
【专利摘要】利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法，属于生物【技术领域】，将纯化的对虾白斑综合征病毒与中草药相互作用，使中草药直接作用于对虾白斑综合征病毒，所述中草药作用后的对虾白斑综合征病毒接种体外培养的对虾原代细胞，观察细胞的病理变化，从而筛选出具有抗对虾白斑综合征病毒作用的中草药种类。本发明以体外培养的对虾原代细胞为载体，不仅最大限度的模拟了动物体内的生理过程和环境，增加了筛选结果的真实性和准确性，使结果更接近临床效果。并且可以建立较大规模的中草药筛选模型，具有快速和高通量筛选的特点。
【专利说明】利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及到一种利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法。
【背景技术】
[0002]经过近30年的快速发展，对虾养殖业已成为我国农村经济的重要组成部分，在提高沿海地区农渔民就业和经济收入方面发挥了重要作用。但是，随着养殖规模的不断扩大和环境的恶化，对虾病害问题也日趋严重，病原种类繁多，而其中危害最严重的是对虾白斑综合征病毒(WSSV)。该病毒自1992年爆发以来，已在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成巨大经济损失。仅1993至1994年，使我国的对虾养殖业大幅度减产，每年损失数十亿元。对虾白斑综合征的蔓延不仅使我国养虾业严重受伤，而且已在日本、泰国、越南、马来西亚、印度等国家和地区造成严重危害，使之成为世界性问题。1995年该病毒被国际兽疫局、联合国粮农组织以及亚太地区水产养殖发展网络中心列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。该病毒发病快、死亡率高、传播迅速，逐渐成为制约对虾养殖业发展的主要因素。目前，由于没有有效的药物来防治WSSV，因此控制对虾白斑综合征的方法主要在于选取优良品种、供给优质饵料、加强水质管理等措施。
[0003]中草药具有良好的抗病毒作用，可以直接抑制或灭活病毒，但对动物机体副作用小，且可以调节免疫功能，增强动物的抗病能力，具有良好的临床应用前景。并且，中草药在鱼虾等水生动物一些病毒性和细菌性疾病上取得了良好的防治效果。
[0004]然而，在养殖生产实践中中草药存在盲目使用的问题，未经过认真、科学的筛选，乱用药物的情况普遍存在。水产上用到的中草药`配方多源自人类医学或通过活体生物试验法总结而得。迄今为止，水生动物中还没有通过细胞进行抗病毒药物筛选的报道。本技术方法，应用体外培养的对虾原代细胞进行抗WSSV中草药的筛选，具有快速和高通量筛选的特点。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种利用对虾原代细胞筛选抗WSSV中草药的方法，筛选出具有抗病毒作用的单方或者复方中草药，解决目前在防治对虾白斑综合征病毒方面尚无全面有效治疗药物的现实问题，控制对虾WSSV蔓延的局面，为实现对虾健康养殖提供技术保障。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
[0007]一种利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法，将纯化的对虾白斑综合征病毒与中草药相互作用，使中草药直接作用于对虾白斑综合征病毒，所述中草药作用后的对虾白斑综合征病毒接种体外培养的对虾原代细胞，，观察细胞的病理变化(CPE)，从而筛选出具有抗对虾白斑综合征病毒作用的中草药种类。
[0008]进一步，所述的体外培养的对虾原代细胞是对虾类淋巴组织迁出的单层细胞，且淋巴组织是WSSV的易感组织。
[0009]进一步，在所述的中草药与WSSV相互作用之前，将纯化的对虾白斑综合征病毒粒子通过10倍梯度稀释，确定使细胞出现CPE的最低病毒浓度；设置不同浓度梯度的中草药药液，确定其作用于细胞的最大安全浓度。
[0010]进一步，所述的中草药直接作用于WSSV24-36h后，再把所述的中草药与WSSV的混合液接种体外培养的对虾原代细胞。
[0011]淋巴细胞感染WSSV24h后开始出现CPE，主要表现为细胞停止延伸，出现亮圆颗粒，贴壁细胞逐渐漂浮，细胞之间的网状结构消失，最后细胞破碎、溶解；有抗病毒作用的中草药能抑制WSSV对淋巴细胞的杀伤作用，细胞生长状态良好，细胞结构完整。根据以上原理，判断中草药是否具有抗WSSV的作用。 [0012]本发明与现有技术相比的有益效果:
[0013]1、本发明以体外培养的对虾原代细胞为载体，不仅最大限度的模拟了动物体内的生理过程和环境，增加了筛选结果的真实性和准确性，使结果更接近临床效果。并且可以建立较大规模的中草药筛选模型，具有快速和高通量筛选的特点。
[0014]2、本发明与动物实验法相比，避免了对虾养殖的季节性，也不必浪费大量的实验对虾，操作方便，节约成本，大大提高了筛选的效率。换言之，本技术方法仅需要WSSV敏感的对虾组织，而不需要大量、昂贵的活体对虾进行实验。
[0015]3、本发明将中草药与病毒粒子混合后作用于对虾原代细胞，使中草药直接抑制或灭活病毒，避免了中草药直接作用于细胞产生的假阳性结果。
[0016]4、本发明可以直接通过倒置显微镜观察中草药对WSSV的药物作用和灭活病毒效果O
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1.刀额新对虾淋巴组织原代细胞的光镜图片
[0018]A, B, C，D分别表示对虾淋巴组织原代细胞生长12h，24h，48h，72h
[0019]图2.纯化的WSSV经负染后的电镜图片
[0020]A.病毒核衣壳B.完整的病毒粒子
[0021]图3.刀额新对虾淋巴细胞接种WSSV后细胞病变的光镜图片
[0022]1-1，1-2，1-3，1-4分别表示基础培养基吸附0h，24h, 48h, 96h后的细胞
[0023]2-1，2-2，2-3，2-4 分别表示 WSSV 吸附 0h，24h, 48h, 96h 后的细胞
[0024]图4.刀额新对虾淋巴细胞接种不同浓度药液后细胞病变的光镜图片
[0025]C-l, C-2分别表示接种PBS0h、24h的细胞状态
[0026]Y1-1, Y2-1, Y3-1, Y4-1分别表示接种药液Oh的细胞状态
[0027]Yl-2, Y2-2, Y3-2，Y4-2分别表示接种药液24h的细胞状态
[0028]图5.经Hoechst33342染色的淋巴细胞的荧光显微镜照片
[0029]A表示Hoechst33342处理后空白对照组细胞的光镜图片
[0030]B表示Hoechst33342处理后WSSV组细胞的光镜图片
[0031]C表示Hoechst33342处理后药液组细胞的光镜图片
[0032]D表示Hoechst33342处理后WSSV和药液混合组细胞的光镜图片【具体实施方式】
[0033]实施例1:
[0034]对虾淋巴组织原代细胞的培养
[0035]无菌条件下取刀额新对奸(Metapenaeus ensis)的类淋巴器官，在加有双抗(1200IU ?mL—1青霉素钠和1200 μ g ?mL—1硫酸链霉素)的1.5XL-15培养基中剪碎组织(组织块约1_3)，将组织块均匀干贴于6孔培养板中，3h后从培养皿的一侧加入2ml的完全培养基(159^^5、10%51\^、10(^8/1111双抗、20叩/1111 EGFUOng/ml bFGF 的 1.5 X L-15 培养基)。将培养板置于体积含量为3%C02, 26 V培养箱中密闭培养，倒置显微镜下观察培养物。发现对虾淋巴组织干贴3h后，即可观察到亮圆细胞从组织块中迁出，培养12h，24h，48h，72h时的状态见图1的A、B、C、D ;由图1可见培养24h后细胞迁出汇合率达70%，36h后达80%以上(如图1，B、C)，3d时淋巴细胞生长状态良好，光镜下可观察到大量的成纤维细胞贴壁生长，逐渐形成网状结构(如图1，D)，16d时淋巴细胞开始出现亮圆颗粒，少量细胞变圆漂浮，20d后大量细胞破裂、漂浮。
[0036]实施例2:
[0037]WSSV病毒粒子的纯化
[0038]检测为阳性的对虾，取其头胸部去除头胸甲和肝胰腺，称重，加入25%的蔗糖(W/V),冰浴研磨匀衆3-5min,匀衆液3000rpm/min离心,4°C, 15min。上清液5000rpm/min离心，4 °C，15min,取上清 8000rpm/min 离心，4 °C, IOmin,取上清，25000rpm/min 离心，4 °C,
1.5h，沉淀用25%的蔗糖溶液重悬，将病毒粗提液铺于不同蔗糖密度梯度上，蔗糖密度依次为 30%、40%、50%、60%，25000rpm/min 离心，4°C，2h，取 40%_50% 之间的条带，25000rpm/min 离心，4°C，Ih 去蔗糖，PBS 缓冲液(NaC18.0g/L，KC10.2g/L, KH2PO40.2g/L，Na2HPO4.12Η203.0g/L，pH7.2)重悬沉淀，即可得到病毒悬液，_80°C保存待用。
[0039]纯化的WSSV负染后，在透射电子显微镜下观察发现，完整的病毒粒子外观呈椭圆形，病毒的囊膜从外端向外延伸形成尾状结构(如图2，B)。病毒的核衣壳呈杆状结构，一端钝圆，一端稍平(如图2，A)。
[0040]实施例3:
[0041]WSSV使细胞出现CPE最低病毒浓度的确定
[0042]通过荧光定量PCR计算病毒浓度为3.9X107个/ μ?，并10倍梯度稀释至3.9 X IO6个/μ 1、3.9Χ105个/μ 1、3.9Χ104个/μ 1、3.9Χ103个/μ I。待对虾淋巴组织迁出的细胞形成单层后(培养24h-36h),弃去培养基,每孔加入500ul不同浓度的病毒悬液,使病毒与淋巴细胞吸附30min后，补加培养基至2ml，于体积含量为3%C02，26°C培养箱中密闭培养，倒置显微镜和荧光显微镜观察培养物，确定3.9X IO5个/μ I为病毒导致细胞出现病理变化的最低病毒浓度。
[0043]取浓度为3.9 X IO5个/ μ I的病毒悬液接种对虾原代细胞，倒置显微镜下观察，发现与对照组(如图3，1-2、1-3、1-4)相比，感染WSSV24h后的淋巴细胞开始出现病理变化，细胞停止延伸，开始出现亮圆颗粒(如图3，2-2);感染48h后贴壁的细胞逐渐漂浮，亮圆颗粒的数量增多，细胞之间的网状结构消失(如图3，2-3);最后细胞破碎、溶解(如图3，2-4)。
[0044]实施例4:[0045]中草药的煎制
[0046]称取中草药(以大黄为例)5g,于150ml的蒸馏水中浸泡lh，煮沸，持续沸腾10-20min,使药液浓缩至50ml,四层纱布过滤,滤液9000rpm/min离心20min,收集上清,控制药液的终浓度在100mg/ml，4°C保存。将药液2倍梯度稀释至50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml,6.25mg/ml，接种于单层淋巴细胞上(如图4，Y1_1、Y1-2、Y1-3、Y1_4)，观察细胞的病理变化，发现与对照组(如图4，C-2)相比，高浓度大黄组对细胞有不同程度的损伤，主要表现为纤维状细胞停止延伸，大量细胞变圆漂浮，最后溶解于培养基中(如图4，Yl-2、Υ2-2)，低浓度组细胞生长良好(如图4，Υ3-2、Υ4-2)，从而确定大黄药液的最大安全浓度为12.5mg/ml。[0047]实施例5:
[0048]病毒粒子与药液混合后接种细胞
[0049]取500 μ I的WSSV悬液与2ml的中草药药液混合，两者作用36h后用于接种细胞。弃去培养对虾原代细胞的培养基，每孔加入500ul混合液，使混合液与淋巴细胞吸附30min后，补加培养基至2ml,培养板置于3%C02, 26°C培养箱中密闭培养,通过倒置显微镜和突光显微镜观察CPE现象，判断、筛选出具有抗病毒作用的中草药。
[0050]实施例6:
[0051]大黄的抗WSSV效果
[0052]将大黄与WSSV的混合液接种于对虾淋巴组织体外培养迁出的单层细胞。经过Hoechst33342染色，荧光显微镜下观察，发现阳性对照组(接种WSSV)与空白对照组(如图5，A)相比细胞核深染，且细胞核的大小和形态发生变化，多呈半圆形、月牙形、杆状(如图5，B)，而阴性对照组(接种大黄药液)和实验组(接种大黄与WSSV混合液)细胞核荧光染色正常，与空白对照组差异不大(如图5，C、D)。从而确实大黄具有抗WSSV的作用效果。
【权利要求】
1.一种利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法，将纯化的对虾白斑综合征病毒与中草药相互作用，使中草药直接作用于对虾白斑综合征病毒，所述中草药作用后的对虾白斑综合征病毒接种体外培养的对虾原代细胞，观察细胞的病理变化，从而筛选出具有抗对虾白斑综合征病毒作用的中草药种类。
2.根据权利要求1所述的一种利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法，其特征在于所述的体外培养的对虾原代细胞是对虾类淋巴组织迁出的单层细胞，且淋巴组织是对虾白斑综合征病毒的易感组织。
3.根据权利要求1所述的一种利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法，其特征在于所述的中草药与对虾白斑综合征病毒相互作用之前，将纯化的对虾白斑综合征病毒粒子通过10倍梯度稀释，确定使细胞出现病理变化的最低病毒浓度；设置不同浓度梯度的中草药药液，确定其作用于细胞的最大安全浓度。
4.根据权利要求1所述的一种利用对虾原代细胞筛选抗白斑综合征病毒中草药的方法，其特征在于所述的中草药直接作用于对虾白斑综合征病毒24-36h后，再把所述的中草药与对虾白斑 综合征病毒的混合液接种体外培养的对虾原代细胞。
【文档编号】C12Q1/70GK103695563SQ201310689811
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】王印庚, 国子娟 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所