专利名称：抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体 及应用。
背景技术：
ItMMi^IiE (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 是目前重要的猪传染病之一，本病以母猪发热、厌食、不孕、流产、产死胎、木乃伊胎、产弱仔 及仔猪呼吸道症状和高死亡率为特征，俗称“蓝耳病”。该病1987年首先在美国爆发，造成 严重经济损失，引起了国际上的广泛关注。我国于1996由郭宝清等从发病猪群分离病毒并 确认为猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)。目前本病毒已造成我国很多省市猪群地方性流行。 2006年，田克恭等确诊我国猪群发生的“猪无名高热征”主要是由变异的PRRSV感染引起， 并分离出病毒，命名为PRRSV JXA1，该病表现出的特征高热、高发病率、高死亡率，和较低 的低治愈率。猪繁殖与呼吸综合征超强变异株(Nsp21594-1680变异株)NVDC-JXA1，在专利 ZL200710086549. 7 中公开，保藏号为CGMCC No. 1964。PRRSV属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，有囊膜的单股正链RNA病 毒，直径50-65nm，基因组全长为约15kb。根据其病毒基因组和血清型特性，主要分为美洲 型(ATCC VR-2332型)和欧洲型(LV型)，我国流行的主要为美洲型毒株。目前对猪繁殖与呼吸综合征的检测技术包括病毒分离、免疫过氧化物酶单层细 胞试验(IPMA)、间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR等方法，但检测所需时间长，成本昂贵。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及应用。本发明提供了一种保藏号为CGMCC No. 4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆 抗体杂交瘤细胞株3C3。本发明还提供了一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，由保藏号为 CGMCCNo. 4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3产生。所述的单克隆抗体在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒检测病毒抗原中的应用也是 本发明保护的范围。所述检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原方法包括间接免疫荧光检测法、抗原捕获 酶联免疫检测法、免疫组织化学检测法或试纸条检测法。所述试纸条检测法包括胶体金检测法或酶标检测法。所述免疫组织化学检测法中，酶标抗体为羊抗鼠辣根过氧化物酶，显色用AEC酶 底物显色试剂盒，样本为疑似PRRSV猪病料组织如肺、扁桃体、淋巴结等。所述的单克隆抗体在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用；或所述 的单克隆抗体在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的胶体金快速检测试纸条中的应用，上 述应用均是本发明保护的范围。
含有所述的单克隆抗体的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒也是本发明保 护的范围；或含有所述的单克隆抗体的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的胶体金快速检测试 纸条也是本发明保护的范围。经筛选得到能稳定分泌的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 3C3，该杂交瘤细胞株3C3的分类命名为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细 胞，已于2010年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 4109。本发明的实验证明，用纯化的PRRSV JXAl株免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术， 筛选出1株能稳定分泌抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对其进行生物学特性鉴定，为 进一步建立特异、敏感、快速的PRRSV检测方法奠定了基础。
图1为单抗腹水IPMA阳性照片图2为单抗腹水IPMA细胞对照照片图3为3C3单克隆抗体蛋白免疫印迹结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、单克隆抗体的制备和生物学特性的测定一、单克隆抗体的制备1、毒种和细胞猪繁殖与呼吸综合征超强变异株(Nsp21594-1680变异株) NVDC-JXAlCGMCCNo. 1964，以下简称 PRRSV JXAl 株。PRRSV JXAl株、Marc-145细胞、SP2/0细胞由中国动物疫病预防控制中心保存。2、病毒增殖和纯化PRRSV JXAl株接种已长成单层的Marc_145细胞，37°C吸附lh，加入维持液，待 75%以上细胞出现细胞病变(CPE)时收获病毒，将收获的病毒液反复冻融三次，以6000rpm 离心30min，收集上清液，在上清液加入PEG 6000 (终浓度8% ) 4°C过夜搅拌，IOOOOrpm离 心60min。沉淀用1 %原体积的PBS溶解，再经不连续蔗糖密度梯度40000rpm超速离心 3h，收集提纯的病毒条带作为免疫原和ELISA检测用纯化PRRSV JXAl株病毒蛋白，以同方 法处理、纯化不接毒正常培养Marc-145细胞作为对照蛋白，紫外分光光度计测其蛋白含 量，-30°C保存备用。3、BALB/c 小鼠免疫选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠。用纯化的PRRSV JXAl株与等体积弗氏完全佐剂 (Sigma公司，目录号为F5881)乳化均勻后，腹腔及背部皮下多点注射BALB/c小鼠，100 μ g/ 只；首免后第2周和第4周分别用用纯化的病毒与等体积弗氏不完全佐剂(Sigma公司，目 录号为F5506)乳化后进行二免和三免；最后一次免疫2周后采血用间接ELISA测血清抗体效价。待ELISA效价达1 IO5以上时进行细胞融合。融合前3天，尾静脉或腹腔注射 100 μ g不加佐剂的抗原液进行加强免疫。4.骨髓瘤细胞(SP2/0)的培养融合前36_48h将SP2/0细胞分瓶扩大培养于75cm2细胞瓶内。融合当天，选择形 态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心管内，IOOOrpm 离心5min，然后用DMEM营养液(GIBC0公司，目录号为12800-017)重新悬浮，取少量台盼蓝 染色计数，保证细胞成活率大于90%以上，用于细胞融合。5、免疫脾细胞的制备在加强免疫后第三天取免疫小鼠，摘除眼球放血并分离血清作为抗体检测时阳性 对照；将颈椎脱臼处死的小鼠置75%酒精中浸泡5min，置超净工作台蜡盘内；无菌取出小 鼠脾脏，放入盛有IOmL DMEM营养液的平皿中，轻轻漂洗，除去附着的结缔组织与脂肪；用 剪刀剪碎脾脏，置于200目铜网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用DMEM营养液冲洗使脾细 胞全部通过网孔进入溶液中；将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM营养液至30mL，混 勻，IOOOrpm离心5min，弃上清液；同法离心、洗涤细胞一次，然后将细胞悬于IOmL DMEM营 养液中混勻；取上述细胞混悬液进行台盼蓝染色计数备用。6、饲养细胞的制备细胞融合的当日或前一日，将未经免疫的BALB/c小鼠(8_12周龄)眼球采血，颈 椎脱臼处死，浸泡于75%酒精5min，置超净工作台蜡盘内，腹部向上固定；将BALB/c小鼠皮 肤用消毒镊子提起，小心剪开腹部皮肤，分离皮肤与腹膜，充分暴露腹膜；用无菌注射器吸 取适量DMEM营养液注入腹腔，按摩腹部，待腹腔细胞与注入的营养液充分混合后，轻轻吸 回营养液加入无菌离心管内，重复冲洗2-3次；所得液体IOOOrpm离心5min，弃上清液。向 沉淀中加入IOmL DMEM营养液，重新吹散细胞，取上述细胞混悬液进行台盼蓝染色计数；用 含HAT (Sigma公司，目录号H0262)的培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为1_2 X IO5个/mL，加 入96孔细胞培养板中(100 μ L/孔)，置于37°C、5% CO2的培养箱中培养备用。7、细胞融合按常规方法将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按5-10 1比例混合于离心管内， IOOOrpm离心8min，弃上清液，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均勻成糊状；用ImL移液管吸 取预热至37°C的50% PEG(WT 1450Sigma公司，目录号P5402) (PH8. 0)溶液lmL，沿转动的 管壁缓缓滴入，控制在60s加完，然后将细胞悬液吸入移液管(时间控制在30s左右)，静 置30s，再将其吹入离心管内(时间也控制在30s左右)；在5min内向离心管内加入25mL DMEM营养液终止融合作用；将融合后的细胞液IOOOrpm离心5min，弃上清液，用37°C水浴 预热的含HAT培养液重悬；加入有饲养细胞的96孔培养板中，100 μ L/孔，置37°C、5% CO2 的培养箱中培养。每天记录细胞生长情况，融合后第四天，用HAT选择培养液半量换液， 约7-10天，改用HT (Sigma公司，目录号H0137)选择培养液半量换液继续培养。8、阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆化每天观察细胞的生长情况，融合后3-5天，可见有克隆细胞生长，待细胞集落生长 至孔底的1/3-1/2时，对其上清液用间接ELISA和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)方法进 行检测，对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，以有限稀释法克隆三次，使阳性率达100%，注 意及时冻存细胞，然后扩大培养以制备腹水，并将一部分细胞连续传代、冻存、复苏，观察细胞分泌单克隆抗体的稳定性。经间接ELISA筛选并用进口 LSI-PRRS商品化抗体检测试剂盒(法国LSI公司) 和IPMA进行鉴定，3次亚克隆化获得了 1株稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗 体的杂交瘤细胞株，命名为3C3。该细胞株具有双亲代的生物学性质，腹腔接种给BALB/c小 鼠后可以形成肿瘤，并稳定地产生特异性抗体，经稳定传代3个月后冻存于液氮中，3个月、 6个月后复苏细胞生长良好，抗体分泌水平未见降低。经筛选得到能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 3C3，该杂交瘤细胞株3C3的分类命名为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细 胞，已于2010年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 4109。9、单克隆抗体的制备将筛选得到能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 3C3CGMCC No. 4109采用扩大培养或同系小鼠体内诱生腹水法进行单克隆抗体的制备。1)细胞扩大培养法进行单克隆抗体的制备采用生物反应器发酵培养法进行分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的 杂交瘤细胞株3C3CGMCC No. 4109的大量培养，当细胞浓度达2 X IO6个细胞/mL以上时，采 用边自动添加新鲜培养基边自动收集的方式收集培养的杂交瘤细胞3C3CGMCC No. 4109上 清液，3000rpm离心lOmin，将收集的细胞上清液进行超滤浓缩，得到浓缩的单克隆抗体(细 胞上清液)。上述发酵培养中的培养基为GIBCO公司DMEM培养基，目录号为12800-017，培 养时间7天-21天，培养条件温度37°C，溶氧60% -80%, PH 7.2。2)同系小鼠单克隆抗体腹水的制备选择20g以上BALB/c小鼠，每只腹腔内注射灭菌液体石蜡0. 5mL ； 14d后，小鼠腹 腔接种杂交瘤细胞3C3CGMCC No. 4109 (3-5 X IO5个细胞/只)；植入细胞后第7天起，每天 观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用9#针头穿刺腹腔，采集腹水，一般可连续采集3-6 次，将腹水以3000rpm离心lOmin，去除油脂和沉淀，收集上清液，测定抗体效价后，_30°C保 存备用，得到单克隆抗体(腹水)。10、单克隆抗体的纯化将步骤9得到单克隆抗体(腹水)先进行预处理加入鹿角胶(Sigma公司) 和CaCl2除去油脂类杂质和部分杂蛋白，12000rpm离心30min，再将上清液用0. 22 μ m微 孔滤膜(MILLIPORE公司)过滤，加入等体积0. OlM PH 7. 4的PBS缓冲液，用ProteinG Sepharose 4B层析柱(Amersham Biosciences公司)分离纯化，收集蛋白洗脱峰，以0. OlM PH 7. 4的PBS透析过夜，用截留分子量为30kD的滤膜(MILLIPORE公司超滤浓缩，得到纯化 的单克隆抗体(腹水)，紫外分光光度计测其蛋白含量，_30°C保存备用。将步骤9得到的浓缩的单克隆抗体(细胞上清液)按照上述方法直接进行纯化， 得到纯化的单克隆抗体(细胞上清液)。二、单克隆抗体的生物学特性的测定1、抗体类及亚类的鉴定按照SBA Clonotyping System/AP kit单抗亚型鉴定试剂盒(SouthernBiotechnology Associates, Inc.)说明书对上述步骤一得到的单克隆抗体进行 类及亚类的鉴定。结果为杂交瘤细胞株3C3CGMCC No. 4109分泌的单克隆抗体的重链为IgG2a,轻链 为 kappa |j|02、ELISA效价的测定用上述一得到纯化的PRRSV JXAl株病毒蛋白和Marc_145细胞对照蛋白(将蛋白 用PH 9. 6的碳酸盐缓冲液稀释成2 μ g/mL)包被酶标板100 μ L/孔，4°C过夜。用含3% BSA 的 PBST(0. OlM PH 7. 4 含 0.05% (体积百分比)Tween20 的 PBS) 37°C封闭 2h ；用 PBST 溶 液洗涤3次，分别加入10倍系列稀释(稀释液为0. OlM PH 7. 4的PBS)由步骤一得到的单 克隆抗体(细胞上清液)和单克隆抗体(腹水)，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；用PBST溶液洗 涤5次后加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗(JacksonlmmunoResearch，Inc. 1 5000稀 释)100 μ L/孔37°C孵育Ih ；用PBST溶液洗涤5次后加入TMB (四甲基联苯胺)和过氧化氢 的混合物(1 1体积比混合)100yL/孔，37°C孵育显色15min。每孔加入50 μ L 0. 2M的 H2SO4终止反应，轻轻振荡混勻，用酶标仪测定每孔吸光度值(0D450值)，以实验组的OD45tlnm/ 对照组的OD45tlnm > 2. 1的孔判为阳性(即Ρ/Ν > 2. 1时的最高稀释倍数为效价判定终点)。采用步骤一中的方法制备SP2/0细胞培养上清液和SP2/0细胞腹水，作为阴性对 照。结果见表1和表2所示，由杂交瘤细胞株3C3CGMCC No. 4109得到的单克隆抗体细 胞上清液和腹水与PRRSV JXAl株病毒蛋白的ELISA抗体滴度在1 IO4和1 107。表1腹水间接ELISA检测OD值
权利要求
保藏号为CGMCC No.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3。
2.由保藏号为CGMCCNo. 4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞 株3C3产生的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的胶体金快速 检测试纸条中的应用。
5.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒。
6.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的胶体金快速 检测试纸条。
全文摘要
本发明公开了一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及应用。本发明提供了一种保藏号为CGMCC No.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3。本发明还提供了一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3产生。本发明的实验证明，用纯化的PRRSV JXA1株免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术，筛选出1株能稳定分泌抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对其进行生物学特性鉴定，为进一步建立特异、敏感、快速的PRRSV检测方法奠定了基础。
文档编号G01N33/577GK101979512SQ201010536550
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年9月13日
发明者张倩, 曲萍, 曹振, 王传彬, 田克恭, 翟新验, 遇秀玲, 邓小雨 申请人:中国动物疫病预防控制中心