专利名称：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及 一种抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体及其制备，属于生物技术领域。
背景技术：
用杂交瘤细胞生产单克隆抗体(Monoclonal Antibody, McAb)是近些年来在免疫学和分子生物学领域中显著成就之一。单克隆抗体纯度高、专一性强，较常规的免疫学方法优越，为标准化提供了机会。单克隆抗体以其严格的识别特异性已渗透到科学研究的各个方面，在病原体的抗原分析、结构蛋白功能及其作用机理、疾病诊断的研究等方面得到了广泛的应用。高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome,PRRS)是由PRRS病毒变异株引起的，该病以来势凶猛、发病突然、传播迅速、死亡率高、治愈率低为主要特点，尤其以保育猪、育肥猪的发病率较高，母猪发生流产，给养猪业带来极大的危害和重大的经济损失。目前对猪繁殖与呼吸综合征的检测技术主要有病毒分离、免疫过氧化物单层细胞试验(IPMA)、间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR等方法，但检测所需时间长，成本昂贵。建立一种敏感、特异、快速、经济的检测手段势在必行，而获得特异性单克隆抗体为其提供了物质保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以生物技术手段纯化谷胱甘肽转移酶-GP5 (GST-GP5) 融合蛋白，制备抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的杂交瘤细胞株及其单克隆抗体，本发明的单克隆抗体敏感、特异性强，只对GP5蛋白有抗性，而对GST蛋白无抗性，为进一步建立特异、敏感、快速的PRRS病毒检测方法奠定了基础。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一株抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No. 4651。本发明还提供了由保藏号为CGMCC No. 4651的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体， 抗体亚型为IgA型。本发明的单克隆抗体对GST-GP5融合蛋白有反应性，对GST没有反应性，对PRRS 病毒GP5蛋白具有特异性反应。本发明还提供了该单克隆抗体的制备方法，其制备过程如下根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中第32-65个氨基酸和第 127-200个氨基酸设计两对引物，并在引物中引入12个氨基酸，S卩SGGRGGSGGRGG作为连接桥段，采用PCR的方法分别扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中第32-65个氨基酸基因序列及第127-200个氨基酸基因序列，这两段序列利用上述12个氨基酸作为连接桥段，连接成一个大片段；将上述连接片段产物酶切处理，克隆于携带GST的原核表达载体pGEX-6p-l中；测序鉴定，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对其进行诱导表达，得GST-GP5 融合蛋白；用纯化的GST-GP5融合蛋白免疫Balb/c雌性小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合，用间接ELISA方法进行筛选，用含GST标签的其它抗原筛选GST抗原，筛选出能够分泌对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白有反应性而对GST没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。其中，所述的两对引物序列为，第32-65个氨基酸的上游引物 TTCGAATTCAGCAACAACAACAGCTCTCAT,下游引物GCCGCCGCGGCCGCCGCTGCCGCCGCGGCCGCCGCTC TCCACTGCCCAGTCAAA ；第 127-200 个氨基酸上游引物AGCGGCGGCCGCGGCGGCAGCGGCGGCCGCGG CGGCCTTGCGAAGAACTGC，下游引物TCGCTCGAG GAGACGACCCCATTG。本发明的单克隆抗体可用于制备猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒。本发明的单克隆抗体可用于快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。本发明的单克隆抗体也可用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白。本发明的抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株为申请人筛选得到，细胞株稳定，分类命名为抗PRRSV GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2011年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏编号为CGMCC No. 4651。本发明筛选得到的抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株稳定，体外连续培养3个月以上或液氮冻存6个月后，该细胞株仍能稳定分泌抗PRRSV GP5的单克隆抗体；制备的单克隆抗体敏感、特异性强，只对GP5蛋白有抗性，而对 GST蛋白无抗性。以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒为抗原对杂交瘤细胞培养上清及腹水进行Western-Blot及间接免疫荧光分析，结果均为阳性，这为建立诊断PRRS病毒抗原的检测方法奠定了良好的物质基础。
图1纯化后的融合蛋白纯度。图2利用Western-Blot方法分析单克隆抗体的抗原位点识别情况。图3利用间接免疫荧光方法检测杂交瘤细胞培养上清液与PRRS病毒GP5蛋白的特异性反应。
具体实施例方式实施例1杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体的制备一、pGEX-GP5原核表达载体的构建根据PRRS病毒GP5蛋白中第32_65个氨基酸和第127-200个氨基酸设计两对引物。第32-65个氨基酸上游引物TTCGAATTCAGCAACAACAACAGCTCTCAT下游引物GCCGCCGCGGCCGCCGCTGCCGCCGCGGCCGCCGCTCTCCACTGCCCAGTCAAA
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第127-200个氨基酸上游弓丨物AGCGGCGGCCGCGGCGGCAGCGGCGGCCGCGGCGGCCTTGCGAAGAACTGC下游引物TCGCTCGAGGAGACGACCCCATTG分别扩增PRRS病毒GP5蛋白中第32_65个氨基酸基因序列及第127-200个氨基酸基因序列，这两段序列利用12个氨基酸(SGGRGGSGGRGG)作为连接桥段，采用PCR的方法连接成一个大片段(具体片段序列如下:AGCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGTTGATTTATAACTTA ACGCTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGCTGGCACAAAAATTTGACTGGGCAGTGGAGAGCGGCGGCCGCGGCGG CAGCGGCGGCCGCGGCGGCCTTGCGAAGAACTGCATGTCCTGGCGCTACTCTTGTACCAGATATACCAACTTCCTTC TGGACACTAAGGGCAGACTCTATCGTTGGCGGTCGCCCGTCATTGTGGAGAAAGGGGGTAAGGTTGAGGTCGAAGGT CACCTGATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATG GGGTCGTCTC)，并在其5'端和3'端分别引入EcoRI和Xho I酶切位点。将PCR连接片段产物经酶切处理后，克隆于经过同样酶切处理的携带GST的原核表达载体pGEX-6p-l中，命名为PGEX-GP5。经测序鉴定正确的表达载体，用IPTG对其进行诱导表达。二、GST-GP5融合蛋白的表达及纯化1.重组蛋白的诱导(1)将构建好的重组质粒转化至表达菌E. coli BL-21中；(2)在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上挑取含重组质粒的单个菌落，接种于含相应抗生素的3mL LB液体培养基中，37°C培养过夜活化；(3)按1 100的体积比将活化菌接种于含氨苄青霉素的5mL LB培养基中，37°C 培养约2h至对数生长期(OD600值达0. 5 0. 6)，加入终浓度为0. lmmol/L的IPTG诱导剂， 37 °C诱导表达4h ；(4)用12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳观察。2.融合蛋白的大量表达及纯化(1)接种已表达融合蛋白的大肠杆菌DH5 α菌株于IOmL LB/氨苄青霉素液体培养基，于37°C摇荡培养过夜；(2)转接IOmL过夜培养物于500mL LB/氨苄青霉素液体培养基，于37°C摇荡培养至OD6tltl值达0. 5左右，取出ImL样品供电泳分析；(3)加入 0. 5mL lmol/L IPTG 至终浓度为 0. 6mmol/L,于 37°C摇荡培养至 OD6tltl 值达1.0，终止培养，取出ImL样品供电泳分析；(4)大量诱导表达的蛋白处理方法分别参照GST融合表达系统操作手册，纯化后的蛋白电泳图见图1。三、单克隆抗体的制备1.免疫脾细胞的制备(1)取8-10周龄Balb/c雌性小鼠4只，编号为:1,2,3,4 ；(2)取适量纯化的GST-GP5蛋白与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化后， 经腹腔接种6-8周龄BALB/c小鼠(60 μ g蛋白/只)；(3)两周后将适量的抗原与等体积的弗氏不完全佐剂(Sigma公司)乳化，进行第一次加强免疫，免疫量为30yg蛋白/只。以后每隔两周进行第二次、第三次加强免疫。第三次加强免疫后10天眼眶取血，用ELISA方法测多抗血清效价；
(4) 10天后，不加佐剂从尾静脉注射1号鼠，免疫量为50 μ g蛋白，三天后取小鼠脾脏，制备脾细胞。2.细胞融合(1)按常规方法融合，取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，37°C培养M小时；(2)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞以1 5_1 10的比例混勻，1500rpm离心 5min ；(3)将离心好的细胞上清尽量倒掉，拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入 37°C温水中，在1分钟内缓慢加入ImL的PEG(Sigma公司)，加完后，在温水中静置Imin ；(4)然后aiiin内缓慢加入2mL的无血清DMEM培养基(GIBC0公司)，接着^iin内缓慢加入8mL无血清的DMEM培养基，IOOOrpm离心5min ；(5)倒掉上清，加入IOmL的血清，小心地将细胞吹勻，倒入前面准备好的饲养细胞，用HAT (Sigma公司)培养基悬浮；(6)将含有细胞的培养液滴入96孔培养板中，每孔100μ L，置于37°C CO2培养箱中培养，第七天换成HT (Sigma公司)培养液培养。3.杂交瘤细胞筛选用含GST的其他抗原筛选GST抗原。细胞融合10天后进行首次ELISA双筛，筛选GST-GP5阳性、GST-X(含GST的其他抗原)阴性的阳性细胞进行亚克隆。7_10天后，再次进行ELISA双筛和亚克隆。如此筛选3-5次，直到细胞板上所有克隆均为GST-GP5阳性、 GST-X (含GST的其他抗原)阴性，即杂交瘤细胞分泌的抗体只对GP5蛋白有抗性，而对GST 蛋白无抗性。ELISA多次筛选后得到的杂交瘤细胞株，体外连续培养3个月后冻存于液氮中，3 个月、6个月后复苏细胞，结果该细胞株生长良好，仍能稳定分泌抗GP5的单克隆抗体，并且抗体水平未见降低。4、ELISA检测抗体效价(1)用包被液稀释免疫蛋白原，终浓度为2 μ g/mL, 100 μ L/孔，4°C，过夜，洗液洗涤2次；(2) 1 % BSA封闭液封闭，200 μ L/孔，37 °C孵箱，2h，用洗液洗涤1次；(3)加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)JH 性对照(阳性血清PBS 200倍稀释)，均为IOOyL/孔，37°C孵箱，lh，用洗液洗涤3次；(4)加入PBS稀释20000倍的二抗(山羊抗小鼠IgG/HRP中杉金桥)，100 μ L/孔， 37°C孵箱，lh，取出后用洗液洗涤3次；(5)加入显色液(1% A 液+10% B 液(A 液1% TMB in DMSO ;B 液0. 1 % H202 in 柠檬酸缓冲液))100 μ L/孔，显色时间为5min左右；(6)每孔加入50 μ L终止液(2Μ硫酸)终止；(7)双波长(450，60 测吸光值，记录保存数据。5.腹水的制备取雌性Balb/c小鼠，每只腹腔注射0. 5mL液体石蜡，7天后每只小鼠腹腔注射 2. 5 X IO6个杂交瘤细胞，观察小鼠状态。7-10天后小鼠腹部显著膨隆，收集腹水，12000rpm离心30秒，去除沉淀和上层油脂，收集中段液体，间接ELISA测其效价，-70°C保存备用。6.腹水的纯化参照免疫学实验技术，采用rProtein G亲和层析纯化步骤5得到的单克隆抗体 (腹水)，经紫外分光度计测定其浓度，-70°C保存备用。实施例2单克隆抗体的生物学鉴定一 .抗体亚类的鉴定利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(PERSEN公司)对最终筛选出来的单独针对免疫原蛋白的阳性细胞株进行亚类鉴定，结果显示，实施例制备的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为IgA型。二 .ELISA效价的测定采用实施例1中提到的检测抗体的ELISA方法，将本发明制备的CGMCCNo. 4651得到的单克隆抗体培养上清和腹水进行ELISA抗体滴度的检测，同时采用SP2/0细胞培养液和SP2/0细胞腹水作为阴性对照。结果杂交瘤细胞培养上清与腹水效价分别为IO3和106。三.单克隆抗体分泌稳定性的测定将得到的抗PRRSV GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株CGMCC No. 4651连续传代 3个月以上及液氮冻存6个月后复苏，取细胞上清，按照实施例1中所述的ELISA方法，检测其抗体效价，以SP2/0细胞培养液为阴性对照。结果抗体效价与实施例2步骤二的结果无显著差异，说明该单克隆抗体分泌稳定性高。四.杂交瘤细胞染色体数目检测将传代培养2-3天处于对数生长期的杂交瘤细胞株CGMCC No. 4651和SP2/0细胞分别制片、染色后选择染色体分散良好的细胞于显微镜下进行观察，记录其染色体数目。结果杂交瘤细胞株CGMCC No. 4651染色体平均记数49对，该数值大于SP2/0细胞染色体数(平均记数44对)，小于脾细胞(平均记数40对)与SP2/0细胞的染色体数目之和，表明抗PRRSV GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株CGMCC No. 4651确为脾细胞与SP2/0 细胞融合而成。五.单克隆抗体的抗原位点识别分析将PRRSV裂解处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后取下胶，裁剪合适大小的硝酸纤维膜(Nitrocellulose Membrane, NC)和滤纸，按常规方法进行蛋白免疫印迹 (Western-blot)分析。抗体为杂交瘤细胞株CGMCC No. 4651细胞培养上清，SP2/0细胞培养液为阴性对照，小鼠抗GP5阳性血清作为阳性对照。结果见图2所示，杂交瘤细胞培养上清与病毒呈特异性染色，而阴性对照SP2/0细胞培养液则无相应染色。采用同样的方法检测单克隆抗体(腹水)，结果无显著差异。六.单克隆抗体的特异性检测用PRRSV株感染Marc-145细胞，36h后收获感染细胞，制备细胞涂片，分别用已知的PRRS阳性猪血清、阴性猪血清、SP2/0细胞培养上清液和本发明制备的杂交瘤细胞培养上清作为一抗，按常规IFA试验方法进行间接免疫荧光检测(二抗中加入0. 01%伊文思
蓝 ) 。结果如图3，其中阳性细胞呈绿色或黄绿色，阴性细胞呈红色。
采用同样的方法检测单克隆抗体(腹水)，结果无显著差异。实施例3单克隆抗体的应用临床样品的间接免疫荧光检测1.制作病理涂片采取临床上疑似PRRS猪的组织如肺脏、扁桃体、淋巴结等，按常规方法制成涂片， 并进行固定。2.间接免疫荧光检测按常规方法进行检测，一抗为本发明得到的单克隆抗体(腹水)或杂交瘤细胞株 CGMCC No. 4651的细胞培养上清(分别经PBS稀释10000倍和10倍后使用)。二抗为FITC 标记的羊抗小鼠IgG(中杉金桥生物技术有限公司)。3.判定标准如果二抗中加入0. 01%伊文思蓝，则阳性细胞呈绿色或黄绿色，阴性细胞呈红色。 如果二抗中未加入伊文思蓝，则阳性细胞呈绿色或黄绿色，阴性细胞无特异性着色。
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权利要求
1.一株抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为 CGMCC No. 4651。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体，抗体亚型为IgA型。
3.权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，其制备过程如下根据猪高致病性繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中第32-65个氨基酸和第127-200个氨基酸设计两对引物，并在引物中引入12个氨基酸，即SGGRGGSGGRGG，作为连接桥段，采用PCR的方法分别扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中第32-65个氨基酸基因序列及第127-200个氨基酸基因序列，这两段序列利用上述12个氨基酸作为连接桥段， 连接成一个大片段；将上述连接片段产物酶切处理，克隆于携带谷胱甘肽转移酶的原核表达载体pGEX-6p-l中；测序鉴定，用异丙基硫代半乳糖苷对其进行诱导表达，得谷胱甘肽转移酶-GP5融合蛋白；用谷胱甘肽转移酶-GP5融合蛋白免疫Balb/c雌性小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白有反应性而对谷胱甘肽转移酶没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。
4.权利要求3所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的两对引物序列为， 第 32-65 个氨基酸的上游引物TTCGAAT TCAGCAACAACAACAGCTCTCAT,下游引物GCCGC CGCGGCCGCCGCTGCCGCCGCGGCCGCCGCTCTCCACTGCCCAGTCAAA ；第 127-200 个氨基酸上游引物AGCGGCGGCCGCGGCGGCAGCGGCGGCCGCGGCGGCCTTGCGAAGAACTGC，下游弓丨物TCGCTCGAG GAGACGACCCCATTG。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备，属于生物技术领域。本发明的杂交瘤细胞株稳定，体外连续培养3个月以上或液氮冻存6个月后，该细胞株仍能稳定分泌抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病GP5蛋白的单克隆抗体；单克隆抗体敏感、特异性强，只对GP5蛋白有抗性，而对GST蛋白无抗性，为进一步建立特异、敏感、快速的PRRS病毒检测方法奠定了基础。
文档编号C12N15/40GK102181402SQ201110072320
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者严景华, 侯艳红, 王美君, 赵亚荣, 高福 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司