一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种识别肠道病毒71型及柯萨奇病毒A16型VP4蛋白的单克隆抗体 及其制备方法与应用，特别涉及一种将EV71VP4蛋白嵌合到HBcAg病毒样颗粒中制备而成 的融合蛋白，将其作为抗原免疫Balb/c小鼠。利用噬菌体展示抗体文库技术筛选获得能特 异性中和EV71VP4蛋白的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002] 手足口病（Handfootmouthdisease，HFMD)是由不同的肠道病毒所引起的婴 幼儿常见的传染病，以发热和手、足、口等部位出现疱瘆为特征，少数患儿出现中枢神经系 统损伤、肺水肿、肺出血、循环衰竭及心脏损害，个别因严重并发症致死。近几十年来，手足 口病已在全世界多个地区爆发和流行，累及地区之广，发病人数之多，引起人们高度重视。 2008年1月1日至2011年10月31日止，全国感染手足口病近476万例，造成1821名患 儿死亡。在2008年我国将手足口病列入法定报告管理的丙类传染病，要求在24h之内上 报卫生部。引起手足口病的肠道病毒分为肠道病毒71(Enter〇virUS 71，EV71)、埃可病毒 (ECHO)、柯萨奇病毒（Coxsackievirus)A型与B型等，其中以EV71及CVA16型最为常见。通 常情况下，EV71与CVA16引起的手足口病在临床症状等方面难以区别，但EV71易致无菌性 脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种神经系统相关性疾病，可危及生命。
[0003]肠道病毒 71 型（enterovirus71，EV71)属于小RNA病毒科（Picornaradae)肠道 病毒属（Enterovirus)，分子量约为2. 6XIO6D,约由7389?7408个核苷酸组成的。柯萨 奇病毒A16型（CoxsackievirusA16，CVA16)亦属于小RNA病毒科，病毒基因组为约7410b 的单链RNA。EV71与/或CVA16毒粒为二十面体形，立体对称，呈球形状，是裸露的核衣壳， 直径约为23-30nm，无包膜。
[0004] EV71与/或CVA16病毒的衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4组成，四种结构蛋白中， VPl、VP2和VP3裸露于病毒颗粒的表面，而VP4则位于病毒颗粒衣壳的内表面与RNA核心紧 密相连。根据病毒衣壳蛋白VPl核苷酸序列的不同，可将EV71分为A、B、C三个基因型，其 中B型分为B1-B5亚型，C型分为C1-C4亚型，不同亚型感染后临床症状不完全相同。传统意 义上认为病毒的抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上（CardosaMJ,PereraD,BrownBA，et al.Molecularepidemiologyofhumanenterovirus71strainsandrecentoutbreaksin theAsia-Pacificregion:comparativeanalysisoftheVPlandVP4genes[J].Emerg InfectDis，2003, 9 (4) :461-468.)。有研究发现EV71VP4序列N-末端的前20个氨基酸是 高度保守的，该段基因融合HBcAg形成的嵌合病毒样颗粒（命名为HBcAg-VP4)有中和活性 的产生，并且能够引起针对不同EV71基因型以及CVA16的交叉中和抗体反应。
[0005] 单克隆抗体技术（简称单抗），又被称为肿瘤"生物导弹"，是能直接导向肿瘤的 药物。鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要却显示诱发人抗鼠抗体（Human anti-mouseantibody,HAMA)反应，另外，鼠源单抗不能有效激活人体免疫反应，大大限 制 了其临床应用（DharR,KamakarS,SriamanR,etal.Efficacayofarecombinant chimericanti-hCGantibodytopreventhumancytotrophoblastfusionandblock progesteronesynthesis[J].AmJReprodImmunol, 2004, 51:358-363.)。降低或避免 HAM反应以提高单抗疗效的主要手段是利用抗体技术进行鼠源单抗人源化改造，至今单 克隆抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终制备全人源单克隆 抗体的转基因小鼠与噬菌体展示文库几个阶段。迄今，噬菌体展示技术是发展最成熟，应 用最广泛的制备单克隆抗体的技术。菌体抗体库（Phageantibodylibrary)技术是 由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术，以噬菌体展示技术为基础。噬菌 体抗体库技术具备改良抗体的能力。能够在未知目标性能肽段的一级结构的情况下，通 过"突变-建库-筛选"获得具备该性能或性能得到改善的未知序列（MondonP，Dubreuil 0,BouayadiK,etal.Humanantibodylibrariesaracetoengineerandexplorea largerdiversity[J] ?FrontBio-SCI, 2008, 13:1117-1129)，可以通过引入突变或筛选高 亲和力克隆，体外模拟体内的抗体亲和力成熟过程，提高其亲和力。另外还能够提高抗体的 表达量。
[0006] 目前，国内EV71病毒灭活疫苗已完成了III期临床研宄，但仍无相应疫苗与药物 获准上市，另外，针对引起手足口病的另一主要抗原CVA16病毒尚未研发出有效疫苗与药 物，因此研制出既能中和EV71病毒又能中和CVA16病毒的药物对于目前对抗手足口病具有 十分重要的意义。本发明即提供一种具有广谱中和活性的预防与治疗手足口病的单克隆抗 体潜在药物的制备方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种具有广谱中和活性的预防与治疗手足口病的单克 隆抗体的制备方法。
[0008] 一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体或其片段，其特征在于：所述的单克隆抗 体或其片段的轻链可变区具有SEQIDNO:1所示的基因序列。
[0009] 一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体或其片段，其特征在于：所述的单克隆抗 体或其片段的重链可变区具有SEQIDNO:2所示的基因序列。
[0010] 进一步，所述的单克隆抗体或其片段包括可变区和恒定区，所述恒定区的人 IgGlkappa轻链恒定区具有SEQIDNO:3所示的基因序列；所述恒定区的人IgGl重链恒定 区具有SEQIDNO:4所示的基因序列。
[0011] 进一步，所述的单克隆抗体或其片段包括ScFv或Fab形式。
[0012] 制备所述的单克隆抗体或其片段的方法，其特征在于步骤如下：
[0013] 1)针对EV71VP4蛋白N-末端的前20个氨基酸序列融合HBc蛋白形成嵌合病毒样 颗粒，命名为HBcAg-VP4蛋白；利用已经获得的HBcAg-VP4蛋白免疫6-8周龄的Balb/c小 鼠，取小鼠脾脏组织，研磨得到细胞，分离淋巴细胞，Trizol法提取mRNA ;
[0014] 2)将步骤1)提取的mRNA反转录成cDNA，PCR反应扩增抗体可变区的轻链基因 片段八与重链基因片段VH，并利用重叠PCR拼接成\-Linker-VH形式的ScFv单链抗体基 因片段，经SfiI和NotI双酶切后插入到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接获得重组质粒 pCANTAB5E-ScFv，转化TGl感受态细菌；
[0015] 3)将步骤2)中已转入重组质粒pCANTAB5E-ScFv的TGl细菌继续扩大培养，加入 M13K07辅助噬菌体，组装并释放能够在噬菌体表面融合表达ScFv单链抗体片段的噬菌体， 即噬菌体展示文库；利用ELISA法，得到与EV71-C4型病毒抗原蛋白结合的噬菌体展示文 库，即阳性噬菌体展示文库，其表面展示了具有中和EV71病毒活性的阳性抗体蛋白；
[0016] 4)克隆已筛选的阳性抗体的可变区轻链基因片段'与重链基因片段Vh，克隆人 类抗体IgG轻链恒定区基因片段与重链基因片段HCh，利用重叠PCR将阳性抗体的'与 拼接并插入到pcDNA3.l/zeo(+)表达载体中，得到重组质粒pcDNA3. 1/zeo-L;将V#HCh拼接并插入到pcDNA3. 1 (+)表达载体中，得到重组质粒pcDNA3.I-H;分别转化TOPlO感 受态细菌，筛选阳性菌并扩大培养，提取重组质粒，鉴定阳性克隆；利用用于表达完整单克 隆抗体A-M的重组质粒pcDNA3. 1/zeo-L与pcDNA3.I-H共转染哺乳动物细胞，纯化得到单 克隆抗体A-M;
[0017] 5)将步骤4)中纯化后的抗体进行体外中和试验，检测抗体中和EV71-C4型病毒 的能力，计算获得步骤4)中获得的鼠源单克隆抗体A-M的中和效价，筛选得到能够中和 EV71-C4型病毒的鼠源单克隆抗体A-M001。
[0018] -种重组质粒，包括有SEQIDNO:1与SEQIDNO:2的基因序列。
[0019] -种表达载体，所述载体包含如权利要求1-6任一项所述单克隆抗体的序列，所 述载体为pcDNA3. 1/zeo-L与pcDNA3.l_H〇
[0020] 一种宿主细胞，转染权利要求7所述的载体，所述的宿主细胞为CHO细胞或293细 胞。
[0021] 一种药物，所述药物含有如权利要求1-6任一项所述单克隆抗体。
[0022] 更具体的：具有广谱中和活性的预防与治疗手足口病的单克隆抗体的制备方法包 括如下步骤：
[0023] 1)针对EV71VP4蛋白N-末端的前20个氨基酸序列融合HBc蛋白形成嵌合病毒样 颗粒，命名为HBcAg-VP4蛋白。利用已经获得的HBcAg-VP4蛋白免疫6-8周龄的Balb/c小 鼠，取小鼠脾脏组织，研磨得到细胞，分离淋巴细胞，Trizol法提取mRNA ;
[0024] 2)将步骤1)提取的mRNA反转录成cDNA，PCR反应扩增抗体可变区的轻链基因 片段八与重链基因片段VH，并利用重叠PCR拼接成\-Linker-VH形式的ScFv单链抗体基 因片段，经SfiI和NotI双酶切后插入到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接获得重组质粒 pCANTAB5E-ScFv，转化TGl感受态细菌；
[0025] 3)将步骤2)中已转入重组质粒pCANTAB5E-ScFv的TGl细菌继续扩大培养，加入 M13K07辅助噬菌体，组装并释放能够在噬菌体表面融合表达ScFv单链抗体片段的噬菌体， 即噬菌体展示文库。利用ELISA法，以高温灭活崩解的EV71-C4型病毒包被培养板，加入噬 菌体展示文库，经过3轮淘洗富集筛选得到与EV71-C4型病毒抗原蛋白结合的噬菌体展示 文库，即阳性噬菌体展示文库，其表面展示了具有中和EV71病毒活性的阳性抗体蛋白；
[0026] 4)克隆已筛选的阳性抗体的可变区轻链基因片段'与重链基因片段Vh，克隆人类 抗体IgG轻链恒定区基因片段与重链基因片段HCH，利用重叠PCR将阳性抗体的'与 拼接并插入到pcDNA3.l/zeo(+)表达载体中，得到重组质粒pcDNA3. 1/zeo-L;将V#HCh拼接并插入到pcDNA3. 1(+)表达载体中，得到重组质粒pcDNA