专利名称：鸡贫血症病毒的中和构象表位的制作方法
发明简述本发明提供了CAV蛋白VP1的中和构象表位的形成和鉴定，其是在免疫动物中引发保护性免疫应答所需的。
具体地，本发明描述了抗CAV中和抗体的产生，在一基于这些所产生的中和抗体的诊断试验中检测了CAV(颗粒)。
公开了各种抗CAV疫苗载体，所有这些疫苗均比CAV的致病性要低，所有这些疫苗载体均显示能产生所需的CAV的中和构象表位。
一种载体提供了基于在同一细胞中同时表达VP1和VP2的重组杆状病毒的亚单位疫苗。第二种疫苗是活表达载体，其包括稳定携带VP1和VP2编码序列的Marek氏症载体。第三种CAV疫苗包括遗传学减毒的CAV毒株，其具有降低的致细胞病变效应。
背景技术：
鸡贫血症病毒(CAV)是一种独特的小病毒，其颗粒直径为23-25nm，基因组由环状单链(负链)DNA组成(Gelder blom et al.，1989，Northern et al.，1991 and Todd et al.，1990)。这一DNA在感染细胞中通过一种环状双链复制中间体进行扩增，其最近已被克隆并全部测序。CAV基因组长度为2319个核苷酸(Noteborn and De Boer，1990)，对从不同大陆分离的CAV毒株的DNA分析表明在不同分离物之间仅有微小差异(Meehan et al.，1992；保藏号M81223，Claessens et al.，1991；D10068，Kato et al.，1995；D3 1965和Pallister etal.，1994，Soine et al.，1993和1994；L14767)。最近，基于其基因组结构已将CAV归类于环状病毒科的新病毒家族。然而，CAV与这一病毒家族的其它成员之间不相关，这一家族由动物单链环状DNA病毒组成，如猪环状病毒和鹦鹉嘴羽病(beak-and-feather-disease)病毒(Noteborn and Koch，1995)。
CAV基因组含有一明显的启动子/增强子区(Noteborn et al.1994)，其调节CAV转录，CAV基因组的主要转录物是约2100个核苷酸的未剪接多顺反子mRNA，其编码分子量为51.6kDa(VP1)、24.0kDa(VP2)和13.3kDa(VP3或细胞编程死亡蛋白(apoptin))的三种蛋白质(Noteborn and Koch，1995，Noteborn et al.1992，Phenix et al，1994)。所有三种预期的CAV蛋白在CAV感染的细胞中均有合成(Noteborn and Koch，1995)。用在相同细胞中同时合成的(重组)VPl和VP2免疫接种能引发保护性应答，并可用作抗鸡感染性贫血的亚单位疫苗(Koch et al.，1995和Noteborn and Koch，1994c)。
CAV在鸡中能导致临床和非临床疾病，并已知是世界范围的重要禽类病原体(McIlroy et al.，1992和McNulty et al.，1991)。几日龄的小鸡特别易受CAV感染。在这些动物嗜睡症中，观察到在用CAV接种10天后出现厌食和贫血，感染后死亡率最大可增加至50％。随着年龄的增加，抗性也增加(Jeurissen et al.，1992)。在1-3日龄时被CAV感染的鸡的血细胞比容值下降。1-21日龄的鸡感染CAV会导致特别是胸腺皮质耗竭。然而年龄稍大的鸡可以无临床症状地繁殖，年龄稍大的鸡中的CAV感染可以通过血清转变的发生来确定。
皮质胸腺细胞的耗竭被认为能导致免疫缺陷，因而增加了同时感染并导致免疫失败(Noteborn and Koch，1995)。胸腺细胞以及可能还有成红细胞样细胞的耗竭通过CAV诱导的细胞编程性死亡而发生(Jeurissen et al.，1992a)。CAV编码的细胞编程死亡蛋白是这一现象的主要诱导物(Noteborn et al，1994)。
已发现母体抗体能给予抗CAV感染的重要保护，Vielitz等人(1991)报道接触过CAV的母鸡会产生大量抗体，并传给每个卵孵出的小鸡，这些抗体保护鸡不受感染性贫血相关疾病的侵害。在用如下细胞的裂解物接种的母鸡下的蛋的蛋黄中检测到CAV中和抗体，所述的细胞已用CAV重组杆状病毒共感染并产生所有三种CAV蛋白，或者主要产生VP1和VP2。在用CAV攻击的由这些蛋孵出的子代中未显出特异的临床症状(Koch et al.，1995)。
Vielitz和Landgrf(1988)已开发了一种抗感染性贫血的疫苗，其基于在鸡胚中繁殖的CAV，目前这是唯一商品化的疫苗。免疫接种的种禽的子代得到保护，不受感染性贫血侵害。免疫接种是可能的，因为当母源性免疫消失时，禽类易受病毒感染而不发病。显然使用基于未减毒病毒的活疫苗具有危险性。对3周龄鸡进行实验性感染会导致免疫系统功能的明显下降(McConnell et al.，1993，and 1993a)，但不发病。根据这一发现，McIlroy(1992)提供了证据表明，在不发病情况下CAV也能导致可观的经济损失，即无临床症状的疾病会负面影响饲料转化和平均体重及增加的药疗，两者均导致可观的财政负担。目前，非致病的CAV尚未分离得到。
通过杆状病毒表达系统合成的重组CAV蛋白可以用作亚单位疫苗，已证明重组CAV蛋白VP1和VP2可通过母源性免疫保护小鸡(Koch et al.，1995)。由于杆状病毒载体是昆虫特异性病毒并已知对脊椎动物无致病性，所以其可以培养并供给鸡而不会有预计不到的危险(Vlak and Keus，1990)。
通常，活病毒疫苗比亚单位疫苗诱导更好的免疫应答并且相对便宜，因此，可以使用各种CAV蛋白的免疫原性知识构建减毒CAV载体或其它重组病毒载体，如禽疱疹病毒(Nakamura et al.，1992，Morgan et al.，1993)或禽痘病毒(Nazerian et al.，1992，Boyle andHeine，1993)。这些重组病毒除了表达其自身蛋白外还应表达CAV蛋白VP1和VP2，并可用于下蛋种鸡和肉鸡种鸡的疫苗以保护其后代抵抗感染性贫血。另外，这类载体还可用作保护母源性免疫种鸡抵抗无临床症状的疾病。
发明的详细描述本发明涉及鸡贫血症病毒(CAV)的中和构象表位结构的产生和分析。
另外，还公开了针对CAV的中和单克隆抗体的产生，这些中和抗体显示出是针对CAV蛋白VP1的一个构象表位。
还描述了基于这些中和抗体的用于检测CAV的诊断试剂盒，本发明提供了中和抗体中和CAV颗粒的机制的证据。
为形成VP1的中和构象表位，需在同一细胞中合成VP2。在昆虫细胞中仅表达VP1的重组杆状病毒不与针对CAV的中和抗体反应，但是当VP1和VP2在一个细胞中合成时，这些中和抗体将反应。
但是在纯化的CAV衣壳中仅存在VP1。本发明揭示出当VP1合成时，并且最可能的是当其形成复合体产生CAV衣壳过程中，VP2暂时与VP1结合。将CAV衣壳变性会破坏中和表位，提示中和表位是一构象表位。
另外，本发明涉及预防或治疗家禽感染病毒特别是感染CAV的疫苗和组合物。
具体地，本发明涉及比CAV本身的致病性低但仍能产生中和构象表位的疫苗，用这些类型的疫苗接种鸡会导致产生中和抗体，因此保护动物及其后代抵抗CAV感染。
本发明涉及含有独立于其基因组的编码VP1或VP2的序列的杆状病毒载体，这一重组杆状病毒能在同一细胞中合成VP1和VP2，从而形成CAV的中和构象表位。
本发明还涉及构建含有编码VP1、VP2蛋白的CAV序列的Marek氏症病毒(MDV)载体，特别是这一重组MDV载体以这样一种方式合成重组CAV蛋白，即使之能合适地制备VP1的中和构象表位。
另外，本发明描述了各种减毒CAV毒株的形成，这些毒株与野生型衍生的CAV毒株相比使在鸡T细胞中产生的致细胞病变效应降低。减毒CAV毒株是通过在克隆的CAV DNA基因组中引入点突变制备的，特别是位于启动子/增强子区的序列被突变。减毒的CAV突变毒株可以产生中和构象表位。
预防或控制特别是鸡中的CAV感染的方法以及制备包括CAV的序列的重组部分的方法和制备疫苗的方法也是本发明的主题。
因此，本发明提供了与鸡贫血症病毒(CAV)的病毒蛋白1(VP1)的构象表位反应的中和抗体或抗体片段或其衍生物，所述的构象表位被命名为132-1，132-2或132-3的单克隆抗体识别，所述的单克隆抗体由在法国巴斯德研究所保藏，保藏号为xxxxxx，yyyyyy，zzzzzz的杂交瘤产生。确定一种抗体是否是本发明的抗体的实验是观察其是否与来自保藏的杂交瘤的抗体交叉反应(或竞争)。抗体的片段和衍生物是本领域公知的，不需对本领域熟练技术人员作进一步的解释。
本发明还提供了由上述抗体识别的鸡贫血症病毒的病毒蛋白1的构象中和表位，该表位可以是一个较大分子的一部分，例如它可以与一种载体结合，或者该表位可以在一多肽链中(以一定的间隔)重复。优选的表位是VP1的较大部分，因为这种分子将更容易地具有正确构象。
如上所述，如果构象表位优选在一个细胞中从一个载体与VP2一起产生则其仅存在于VP1上。因此，本发明提供了生产包括如上所述构象表位的病毒蛋白1的方法，该方法包括将所述的病毒蛋白1与所述CAV的病毒蛋白2在一个细胞中一起表达，其中编码VP1的遗传信息与编码VP2的遗传信息独立地存在于一个重组载体上。
本发明还包括用于上述方法中的载体，所述的载体包括作为两个独立的编码序列的编码VP1的遗传信息和编码VP2的遗传信息。优选地，这种载体基于Marek氏症病毒载体，从而可以产生能给出抗两种病原体的保护作用的疫苗。
一种用于本发明的病毒蛋白的非常简单并有效的表达系统是基于杆状病毒载体的载体，如前所述，杆状病毒通常被认为可在脊椎动物中安全使用，因为它不感染脊椎动物。
本发明还提供了产生具有非常重要的中和构象表位但是致病性降低的疫苗或疫苗成分(例如减毒病毒)的途径。
这一点可通过提供如下方法达到，所述的方法用于提供包括本发明的中和构象表位的病毒蛋白1，所述的方法包括从编码VP1和VP2的基因表达至少VP1和VP2的功能部分，其中至少一个基因处于衍生于转录起始位点上游的CAV序列的调控区的控制之下，所述的调控区经修饰以降低其作用。以这种方式，可以产生复制不是很快并因此致病性降低(即减毒)的重组病毒。
这种病毒颗粒也是本发明的一部分，如上所述，修饰优选地位于启动子/增强子区，并且最优选的是修饰位于启动子/增强子区的12bp插入片段中。
由本发明的任何方法得到的重组病毒颗粒也是本发明的一部分，用于本发明的方法的核酸也是本发明的一部分，如包括编码至少VP1的功能部分的基因和编码VP2的功能部分的基因的载体，其中至少一个基因处于调控序列的控制之下，所述的调控序列经修饰以降低其作用。
本发明的抗体和表位还可用于针对试剂盒中用于检测或确定样品中是否存在CAV或CAV抗体。
本发明还提供了用于治疗和预防CAV相关疾病的疫苗，所述疫苗包括本发明的抗体或表位及合适给药的佐剂和/或合适给药的赋型剂；本发明还提供了用于治疗和预防CAV相关疾病的疫苗，所述疫苗包括本发明的重组病毒颗粒及合适给药的佐剂和/或合适给药的赋型剂。
本发明将基于如下实验部分更详细地说明，这仅是为举例描述的目的，不应看作是对保护范围的限制。
实验纯化CAV颗粒以诱导抗CAV的中和单克隆抗体为产生抗CAV的中和单克隆抗体，用纯化的CAV颗粒注射小鼠。
用MILLITAN 300-kDa滤膜(Millipore，USA)将1升CAV感染的MDCC-MSB1细胞培养物上清浓缩40倍，将上清对10mMTris(pH8.7)-1mM EDTA(TE)缓冲液透析。然后向该CAV衣壳悬液中加入十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为0.5％，在37℃保温30分钟。最后在30％蔗糖垫层上沉淀CAV衣壳，将含CAV衣壳的沉淀物重悬于1ml TE缓冲液中。用100μl CAV衣壳悬液注射小鼠两次。
体外中和试验将候选单克隆抗体的上清以1∶2稀释并制成2倍稀释系列，将稀释的上清与104-105 TCID50 CAV-Cux-1保温1小时(VonBulow et al.，1983，Von Bulow，1985)。约10万个用Marek氏症病毒转化的T细胞系MDCC-MSB1的细胞被稀释的上清和病毒的这一混合物感染(Yuasa，1983，Yuasa et al，1983)。
免疫荧光分析和免疫过氧化物酶分析用80％丙酮固定细胞并如Noteborn等人(1990)描述，将细胞与CAV特异性单克隆抗体和荧光素缀合的山羊抗小鼠IgG进行免疫荧光分析。
如Jeurissen等人(1988)所述，用CAV特异性单克隆抗体进行重组VP1/VP2-MDV感染的CEF的免疫过氧化物酶染色。
酶联免疫吸附分析(ELISA)用在50mM碳酸氢钠pH9.6中以1∶10,000稀释的CAV特异性中和单克隆抗体132.1包被微滴孔(Greiner，FRG)，用含0.05％Tween80的自来水洗孔三次。用含4％马血清、51g/l NaCl和0.05％Tween80的磷酸缓冲盐水(饱和缓冲液)100μl在37℃饱和孔30分钟，用含0.05％Tween80的自来水洗孔三次。然后，混合50μl未稀释的鸡血清和50μl浓缩30倍的含CAV颗粒的上清或50μl含重组VP1和VP2蛋白的昆虫细胞的裂解物，并将其加到每孔中，在37℃保温1小时，用含0.05％Tween80的自来水洗孔三次。向每孔中加入100μl在饱和缓冲液中的1∶2000倍稀释的过氧化物酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白G缀合物，在37℃保温1小时，再次用含0.05％Tween 80的自来水洗孔三次。向孔中加入100μl四甲基联苯胺、乙酸钠和过氧化氢酶的标准溶液，在室温保温10分钟。用10％硫酸阻断反应。如标准方法在450nm检测各个孔。
杆状病毒和昆虫细胞重组杆状病毒AcRP23-lacZ(Bishop，1992)得自英国牛津NERC病毒学研究所的R.Possee博士，如Summers and Smith(1987)所述方法纯化基因组DNA。草地夜蛾(Sf9)细胞得自美国组织培养物保藏中心(CRL 1711)。如Summers and Smith(1987)所述，杆状病毒原液在铺满的单层细胞上培养，并在含10％胎牛血清的TC-100培养基(GIBCO/BRL)中培养悬液。
CAV DNA的克降所有CAV DNA序列最初均来自质粒DNA pIc-20H/CAV-EcoRI(Noteborn and De Boer，1990)，用质粒DNA进行的所有克隆步骤原则上根据Maniatis等人(1982)所述的方法进行。
在大肠杆菌HB101菌株中进行DNA转化。所有质粒均在搅拌的大体积培养物中扩增，通过CsCl梯度然后通过在Sephacryl-S500柱上过滤或在QIAGEN层析柱上过滤而纯化。
重组VP1/VP2杆状病毒的构建和筛选用带有线性化重组杆状病毒AcRP23-lacZ DNA的重组转移载体pAcVP1/VP2 DNA转染Sf9细胞，在同源重组后获得重组杆状病毒，其在多角体单元中掺入了分别在p10或多角体基因的启动子调控下的两个CAV蛋白VP1和VP2来取代lacZ。首先，通过检测在杆状病毒感染的昆虫细胞的噬斑中缺少β-半乳糖苷酶活性来鉴定重组CAV病毒，然后通过在杂交实验中用CAV特异性DNA探针确定CAV DNA序列整合进杆状病毒基因组。
免疫沉淀分析感染后二天，将细胞与Promix标记物(ICN，USA)保温，4小时后在E1A缓冲液(50mM Tris(pH7.5)，0.1％Triton-X-100，250mMNaCl，50mM NaF和5mM EDTA)中裂解细胞，并与针对VP2的单克隆抗体111.1在4℃保温2小时，用E1A缓冲液洗并在PAA-SDS凝胶上分离。
MDV DNA转染进CEF为了构建重组VP1/VP2 MDV，根据Graham and Van der Eb(1973)所述的方法进行纯化的重组VP1/VP2 MDV转移载体和DNA的共转染，所述的DNA分离自用MDV Rispens分离物感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)。
用突变的CAV基因组转染鸡T细胞用EcoRI消化各种突变的CAV克隆，重新环化含有CAV(突变)序列的EcoRI片段，并通过Noteborn等人(1991)所述的DEAE-葡聚糖方法用该片段转染MDCC-MSB1细胞。作为对照，用pCAV-EcoRI克隆平行进行整个程序。
结果和讨论抗CAV的中和单克隆抗体的产生
Noteborn和Koch(1994)描述了两种CAV特异性单克隆抗体，一种是针对VP2，而另一种针对VP3，这些单克隆抗体均未显出CAV特异性中和活性，更重要的是这些单克隆抗体没有一个是针对VP1。我们认为可以有针对VP1的中和单克隆抗体，因为衣壳主要含有VP1(Todd et al.，1990)。下面我们将描述抗CAV中和抗体的产生。
为了产生抗CAV的中和单克隆抗体，用纯化的CAV颗粒注射小鼠。
为进行抗CAV的(中和)单克隆抗体的第一次筛选，用同时合成VP1和VP2的重组VP1/VP2杆状病毒感染的昆虫细胞(见下述)包被微滴孔。1∶1000稀释度的具有高中和效价的CAV特异性抗血清特异地与重组VP1和/或VP2产物反应(见下述)。获得了特异地与重组VP1/VP2产物反应的几个不同的杂交瘤细胞系。
CAV特异性血清中和试验表明所获得的这些单克隆抗体中有三种具有抗CAV的中和活性，这三种CAV特异性中和单克隆抗体分别命名为132.1、132.2和132.3(在法国巴斯德研究所保藏，保藏号为xxxx、yyyy和zzzz)。
抗CAV的中和单克隆抗体的显微镜检测免疫荧光分析表明三种中和单克隆抗体132.1、132.2和132.3识别CAV感染的MDCC-MSB1细胞中的特殊结构，这些单克隆抗体均不与未感染的MDCC-MSB1细胞反应。
用电子显微镜观察与抗CAV的中和抗体(132.1)或单克隆抗体111.1(抗VP2)或111.3(抗VP3)保温的纯化CAV颗粒。Todd等人(1990)已报道纯化的CAV衣壳仅含有很可能是VP1的50kDa蛋白质。通过免疫金标记检测各种单克隆抗体，仅发现中和单克隆抗体132.1与CAV颗粒结合，单克隆抗体132.1与CAV颗粒的结合导致病毒裂解。另外显示与中和单克隆抗体132.1保温而裂解的CAV衣壳不与抗VP2或VP3的单克隆抗体结合。
这些结果揭示了中和单克隆抗体的作用机制它们引起病毒衣壳的裂解，由此导致产生非感染性颗粒。另外，这些数据表明纯化的CAV颗粒(几乎)仅含有VP1。
中和单克隆抗体是针对VP1上的一个构象表位肽扫描分析(Geysen等，1984)揭示3种中和单克隆抗体中没有一种与从VP1或VP2或VP3衍生的12聚体有明显反应。为简明起见仅有用单克隆抗体132.1获得的数据示于
图1(针对VP1)或图2(针对VP2)。这些结果表明中和单克隆抗体是针对一构象表位。
这些数据通过下述实验证实。于天然条件下印迹到尼龙滤膜上的纯化的CAV颗粒仍能与中和单克隆抗体132.1反应，然而当在SDS存在下煮沸后，CAV衣壳蛋白不再与单克隆抗体132.1结合。
如Noteborn等(1994b)所述用部分纯化的CAV颗粒和单克隆抗体132.1、132.2或132.3在天然条件下进行免疫沉淀实验，结果表明这些单克隆抗体能沉淀一种约50kDa的蛋白质。
从所有得出的结果可以总结出中和单克隆抗体是针对VP1的一个构象表位。
基于抗CAV的中和抗体的酶联免疫吸附分析(ELISA)我们开发了一种复合体捕获阻断(CTB)-ELISA，可以使用从CAV感染的MDCC-MSB-1细胞得到的富集CAV颗粒或通过上述杆状病毒系统合成的重组VP1/VP2蛋白。
来自CAV感染的鸡的血清中含有阻断CAV衣壳或重组VP1/VP2上的所有表位的抗体，这意味着CAV衣壳或重组VP1/VP2将不与包被的单克隆抗体132.1结合，然而阴性血清将允许CAV衣壳或重组VP1/VP2与包被的132.1结合。小于用阴性对照血清检测的信号的0.5倍的信号将定为是阳性信号。
我们的CTB-ELISA的检测水平是在血清中和试验中测定的24-25的效价值，这是非常灵敏的。分析了400多个血清，与血清中和试验比较后表明96.5％的在血清中和试验中确定为阳性血清的血清在CTB-ELISA中呈阳性，98.3％的在血清中和试验中确定为阴性血清的血清在CTB-ELISA中呈阴性。
重组VP1/VP2转移载体的构建将CAV蛋白VP1和.VP2的编码序列克隆到杆状病毒转移载体pAcUW51(货号21205P)中，该载体可从PharMingen，San Diego，USA购得。这一载体如图3所示，其含有多角体蛋白侧翼区，在该区中间是杆状病毒多角体蛋白启动子和p10启动子以及为两个转录单位所需的含聚腺苷化信号的3’非编码转录序列。该转移载体含有在细菌中复制所需的原核序列。
质粒pET-16b-VP2(Noteborn等，日期未公开)含有380-1512位的CAV DNA序列，这一CAV DNA片段含有VP2编码序列，两侧为484bp3’非编码CAV DNA序列，在VP2的起始密码子下游106bp处，发现了位于另一读框中的VP3起始密码子。用限制性内切酶NdeI和NheI处理质粒pET-1 6b-VP2，用Klenow聚合酶补平粘端。分离到0.8kb CAV DNA片段。用BamHI线性化质粒pAcUW51，用Klenow聚合酶补平粘端并用碱性磷酸酶(CIP)处理。将0.8kb CAV DNA片段与线性化的pAcUW51 DNA连接，通过限制性内切酶分析确定pAcUW51中的VP2方向。这一构建物命名为pUW-VP2。
质粒pET-16b-VP1(Noteborn等，日期未公开)含有853-2319位的CAV DNA序列，这一CAV DNA插入片段含有VP1蛋白的完整编码序列，两侧为117bp 3’非编码CAV DNA序列。用限制性内切酶NdeI和EcoRI处理质粒pET-16b-VP1，用Klenow聚合酶补平粘端。分离到1.45kb CAV DNA片段。用EcoRI线性化质粒pUW-VP2，用Klenow聚合酶补平粘端并用碱性磷酸酶(CIP)处理。将1.45kbCAV DNA片段与线性化的pUW-VP2连接，通过限制性内切酶分析确定与p10启动子单位反方向的VP1方向，这一最终构建物pAcVP1/VP2示于图3。
重组VP1/VP2杆状病毒的构建将编码VP1和VP2的开放读框独自地克隆进一个单一杆状病毒转移载体pAcUW51，编码VP1的CAV序列在杆状病毒p10启动子的调控之下，而VP2在杆状病毒多角体蛋白启动子的调控之下。用“裸露”杆状病毒DNA和转移载体DNA转染Sf9昆虫细胞，同源重组后得到已掺入VP1/VP2表达单位的杆状病毒，该VP1/VP2表达单位已整合进重组杆状病毒的多角体蛋白区取代了lacZ单位。鉴定重组杆状病毒丧失了β-半乳糖苷酶活性并整合了CAV DNA序列。
CAV蛋白VP1和VP2在Sf9细胞中的表达通过考马斯亮蓝染色和用Promix(ICN，USA)或3H-亮氨酸(Amersham，UK)标记蛋白以及PAA-SDS凝胶电泳分析在用重组VP1/VP2杆状病毒感染的Sf9细胞中CAV蛋白VP1和VP2的同时表达。
在PCT/NL94/00168中表明用重组VP1杆状病毒感染的昆虫细胞的裂解物中含有52kD的CAV特异性蛋白，并且在感染的昆虫细胞中由重组VP2杆状病毒表达VP2产生30kDa的主要特异性产物。用重组VP1/VP2杆状病毒感染昆虫细胞导致合成52kD和30kD的两种CAV特异性蛋白。CAV特异性产物可以作为放射性标记的蛋白带或考马斯亮蓝染色的蛋白带而检测到。后一结果表明在重组VP1/VP2杆状病毒感染的昆虫细胞中两种产物均以相对较高的水平产生。用重组lacZ杆状病毒感染的Sf9细胞不含这些CAV特异性蛋白。
因此我们获得如下证据，即用重组VP1/VP2杆状病毒感染的Sf9细胞的粗裂解物接种母鸡能诱导抗CAV的中和抗体。
VP2在形成VP1的构象中和表位中的作用如PCT/NL94/00168中和Koch等人(1995)所报道的，获得中和及保护性免疫应答需要重组CAV蛋白VP1和VP2的同时合成而非简单的混合，这些资料提示VP2是一非结构蛋白，其在感染的某一阶段是病毒装配和/或VP1的正确构象所需的，由此导致中和表位的形成。需要VP2的一个解释可能是它是一种支架蛋白，在病毒颗粒的装配中需要它但是在最终产物中不存在(Leibowitz and Horwitz，1975)。支架蛋白的例子有腺病毒的IVa2和39kDa蛋白(D’Halluinet al.，1978；Persson et al.，1979)。这些蛋白作为形成所谓的轻衣壳的支架，但是在下一步骤中去除。VP2可能在形成CAV病毒颗粒过程中起类似的作用，但是在这一阶段我们不能完全排除如下可能性，即在纯化的CAV制剂(Todd et al.，1990)的电印迹中，或在上述和免疫金标记的VP2特异性单克隆抗体保温的裂解的CAV颗粒的电子显微镜照片中有检测不到的(非常)少量的VP2与VP1结合形成构象中和表位。最近，报道了在梯度纯化的CAV中存在VP2的说服力不强的证据(Buchholz，1994)。
在下列实验中，提供了当VP2同时合成时仅(优势)存在VP1的中和表位的证据。用表达VP1、VP2的重组CAV杆状病毒(见PCT/NL94/00168)或者VP1加VP2感染昆虫细胞，在感染后3或4天收集感染的Sf9细胞，并用CAV特异性中和单克隆抗体132.1对其进行免疫荧光测试。仅含CAV特异性蛋白VP2的细胞根本不与单克隆抗体132.1反应，仅含VP1的细胞在与单克隆抗体132.1保温后仅显示出非常微弱的免疫荧光信号，然而用同时表达VP1和VP2的重组VP1/VP2杆状病毒感染的昆虫细胞与中和单克隆抗体132.1的结合非常强。表达VP1、VP2或VP1加VP2的昆虫细胞的放射性标记裂解物的平行PAA-SDS凝胶电泳显示当VP1单独表达或与VP2一起表达时，其表达水平是相同的。
VP1和VP2的相互作用是暂时的VP1的中和表位仅当VP2存在时才能形成，所以其是构象区分的表位，这提示VP1和VP2在一短时间内互相结合。通过在非常温和条件下的免疫沉淀，我们检测了是否VP1能与VP2结合，用合成VP1、VP2或VP1加VP2的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞。
结果清楚表明当VP2单独合成或在VP1存在下，单克隆抗体111.1能沉淀VP2。在除了VP2还表达VP1的情况下，VP1很少与VP2共沉淀。当在VP2不存在下合成VP1时，单克隆抗体111.1不能沉淀VP1。这些数据表明VP1和VP2(仅以相对较少的量)互相结合，在这一结合期间，VP1可能获得能产生中和表位的构象。
开发抗CAV感染的疫苗的基础上述提供的结果显示为诱导抗CAV的中和抗体，需要VP1有一特殊构象。在杆状病毒表达系统中，这一正确VP1构象仅当同时合成VP1+VP2或者VP1+VP2+VP3时才是可能的。用例如十二烷基硫酸钠变性VP1也能破坏VP1的中和表位，提示VP1中和表位是一种构象表位。
用于接种下蛋母鸡的重组CAV产物VP1+VP2或者VP1+VP2+VP3可以通过杆状病毒系统合成，这些CAV蛋白还可通过其它表达系统合成，例如酵母细胞，通过(反转录)病毒感染或在哺乳动物细胞系统中的基因扩增(CHO-dhfr系统)。
理论上说，VP1片段(与VP2或VP2和VP3联合)的表达足以诱导保护性免疫应答。VP1的12聚体不能与抗CAV的中和抗体反应这一事实提示需要较大的VP1片段才能得到正确的VP1构象以形成中和表位。然而应理解的是微小的氨基酸突变或几个氨基酸的缺失不会影响VP1中和表位的形成。
由CAV开放读框编码的2或3个蛋白能诱导保护性免疫应答这一事实也可用于开发活病毒载体。VP1+VP2或者VP1+VP2+VP3的编码序列可以克隆到活病毒载体中。
在活病毒载体中，CAV蛋白中的一种，VP1、VP2或VP3单独也可能适于诱导抗CAV的保护性免疫应答，通过活病毒载体表达上述CAV蛋白之一的片段也可能足以诱导保护性免疫应答。
VP3导致鸡单核细胞的编程性细胞死亡这一事实(PCT/NL94/00168；Noteborn等，1994a)有利于构建不表达VP3的活病毒载体。Marek氏症病毒的复制可能被VP3诱导的编程性细胞死亡负面影响。
或者，可以产生引发抗CAV感染的中和保护性免疫应答所需的具有所需构象的表达VP1的减毒CAV。
重组MDV-VP1/VP2转移载体的构建将编码CAV蛋白VP1和VP2的序列克隆到Marek氏症病毒(MDV)转移载体pMD-US10-SV(Koch，未出版资料)中，该转移载体含有两侧有MDV US10区的SV40早期启动子，和用于在细菌中扩增的原核序列。该转移载体的示意图见图4。
将368-2319位核苷酸的CAV编码序列插入到pMD-US10-SV转移载体中，使之在SV40早期启动子的调控下。这一重组转移载体用限制性内切酶消化检测，并命名为pMD-US10-SV-VP1/VP2。
通过在549位引入一点突变(T变为A)而在编码VP3的基因中引入另一个终止密码子(Noteborn，未出版资料)，因此插入的CAV序列仅表达VP1和VP2。用载体pMD-US10-SV-VP1/VP2转染的鸡胚成纤维细胞(CEF)的间接免疫荧光分析证实确实有VP1和VP2的表达，而不表达VP3。
重组VP1/VP2 MDV的构建使用磷酸钙转染法将重组转移载体pMD-US10-SV-VP1/VP2DNA和MDV(Rispens分离物)转染CEF细胞。同源重组后，获得重组MDV，其在US10区掺入了CAV编码序列(Nakamura et al.，1992)。验证该重组VP1/VP2 MDV表达VP2。通过平行噬斑纯化和使用针对VP2的单克隆抗体的免疫过氧化物酶分析，得到了几个100％纯化的重组VP1/VP2 MDV独立毒株。
重组VP1/VP2 MDV的鉴定通过PCR和限制性内切酶分析确定CAV-DNA序列正确整合进MDV基因组。通过各种纯化的重组VP1/VP2 MDV的后续传代，表明它们是稳定的。没有得到(部分)丧失了VP1/VP2表达单位的重组子。
通过间接免疫荧光证实了用重组VP1/VP2 MDV感染的CEF细胞中CAV蛋白VP1和VP2的同时表达，使用了抗VP2的单克隆抗体CVI-CAV-111.1(111.1)和抗VP1的单克隆抗体CVI-CAV-132.1(132.1)。
单克隆抗体132.1是针对VP1的一个中和表位，中和抗体132.1能识别与VP2同时合成的重组MDV表达的VP1这一事实提示所需的中和表位存在于MDV表达的VP1上。因此，用重组VP1/VP2 MDV免疫接种鸡将导致诱导中和/保护性抗体应答。除了合成CAV VP1和VP2蛋白之外，重组VP1/VP2 MDV将合成诱导抗MDV感染的保护性免疫应答所需的MDV蛋白。
基于克隆的CAV基因组pCAV/EcoRI产生减毒CAV用CAV-EcoRI克隆产生活的感染性CAV颗粒，为此，将完整的CAV插入片段即2319bp EcoRI片段从细菌序列中分离并用DNA聚合酶处理重新环化。然后用重新环化的EcoRI片段转染例如MDCC-MSB1细胞，几天后将产生野生型CAV。
可以在CAV-EcoRI克隆的CAV序列中导入突变，然后分离、重新环化并转染进MDCC-MSB1细胞，理论上可以得到突变的CAV而不是野生型CAV，并且如果突变体致病性降低，则得到了减毒CAV。产生减毒CAV的完整策略见图5所示。
含有突变的启动子/增强子区的CAV基因组的构建CAV的启动子/增强子区的一个显著特征是由12bp插入序列间隔的4或5个近乎完全的21bp重复序列组成的序列(Noteborn et al.，1991)，这一区域参与CAV转录的调控(Noteborn et al.，1994b)。
为产生减毒CAV，我们在CAV-EcoRI克隆的12bp插入序列/直接重复区中导入了突变(Noteborn et al.，1991)，野生型CAV和各种CAV突变体的突变的启动子/增强子区示于图6。Nae突变体完全不含12bp/直接重复区，取而代之的是引入了一个NaeI位点(5’-GCCGGC-3’)，其在图6中示为“N”。
CAV-EcoRI含有5个直接重复序列，所有其它突变体含有4个原始的直接重复序列。称为“6bp”、“12bp”、“24bp”的各种CAV突变体含有变化的12bp插入序列。突变体“wt in Nae”以及称为“野生型”的原始CAV-EcoRI克隆含有原始12bp插入序列5’-AAGAGGCGTTCC-3’。
CAV突变体“6bp”、“12bp”、“18bp”、“24bp”和“wtin Nae”均含有位于12bp插入序列/直接重复区两侧的额外序列，在这一区域的5’位点引入了接头5’-GCCCATGT-3’，在3’位点引入了接头5’-GATCCGCC-3’。
突变的CAV基因组导致产生减毒的感染性CAV为确定突变的CAV基因组是否能产生活CAV颗粒，首先检测VP3的合成。在转染后的各个时间点上，用丙酮固定各种转染的MDCC-MSB1细胞培养物的一部分，并用抗VP3的单克隆抗体经间接免疫荧光分析，同时将1ml每种培养物加入到9ml补加10％胎牛血清的新鲜RPMI培养基中。
在6天和11天后，分别约有15％和90％的用“野生型”重新环化的CAV基因组DNA转染的培养MDCC-MSB1细胞含有VP3(细胞转染后经一次传代)。
发现缺少完整12bp插入序列/直接重复区的CAV突变基因组“Nae”不产生感染性病毒颗粒。转染后6天，最多有2℃的细胞产生VP3，这是由于“Nae”DNA的瞬时表达所致。用仅编码VP3并已知不能在真核细胞中复制的表达质粒pRSV-VP3(Noteborn etal.，1994b)进行的实验获得了类似的百分比。在3周后及几次传代后，在Nae-DNA转染的MDCC-MSB1细胞培养物中不再存在VP3。
在转染后各种时间间隔，用突变的DNA基因组“6bp”、“12bp”、“18bp”、“24bp”和“wt in Nae”转染的MDCC-MSB1培养物中VP3阳性细胞的百分比显著低于用野生型DNA基因组转染的培养物中的VP3阳性细胞的百分比。这些数据提示各种CAV突变体比野生型CAV复制速度慢，特别是突变体“6bp”和“18bp”降低了它们的复制速率。很可能12bp插入序列的突变导致突变CAV的病毒传播降低。这些实验的结果示于图7。
后来，我们用来自用所有检测的突变CAV-DNA基因组转染的细胞的上清感染新鲜的MDCC-MSB1培养物，除了来自“Nae”-DNA转染的细胞的上清之外，所有上清均证明含有感染性病毒颗粒。对于这些用含“突变病毒”的上清感染的培养物，可以通过间接免疫荧光表明存在含VP3的细胞。
CAV突变体具有降低的致细胞病变效应与实施检测VP3合成的实验平行分析了转染细胞是否会编程性细胞死亡。已知CAV在感染后2-3天会诱导编程性细胞死亡。为此，用碘化丙锭染色细胞，碘化丙锭能强染色“正常”DNA，而对编程性细胞死亡的DNA染色较弱和/或不规则。转染后11天几乎所有用“野生型”DNA转染的MDCC-MSB1细胞均发生编程性细胞死亡，而用各种突变CAV-DNA基因组转染的细胞的大部分没有发生编程性细胞死亡。发现CAV突变体“6bp”和“18bp”的诱导编程性细胞死亡的能力大大降低。
减毒CAV的DNA分析通过聚合酶链反应和对12bp插入序列/直接重复区及侧翼序列的序列分析表明，对于各种CAV突变体“6bp”、“12bp”、“18bp”、“24bp”和“wt in Nae”，原始的突变并未改变。这些结果提示各种CAV突变体是稳定的，至少在MDCC-MSB1中培养约1个月后是如此，并且这些CAV突变体确实是活的并在培养的鸡T细胞中的致细胞病变效应降低。
从用各种CAV突变体感染的MDCC-MSB1培养物分离的DNA的Southern印迹分析表明所有活CAV突变体产生野生型CAV所产生的所有CAV DNA，在野生型和突变CAV中均检测到双链复制中间体和单链DNA。
减毒CAV合成CAV特异性中和表位用中和单克隆抗体CVI-CAV132.1和抗VP2的单克隆抗体CVI-CAV111.2和抗VP3的单克隆抗体CVI-CAV85.1进行的间接免疫荧光分析表明，所有突变的CAV基因组均能合成CAV蛋白VP1、VP2和VP3。更重要的是中和单克隆抗体132.1与用各种CAV突变体感染的细胞反应，这一发现提示突变的CAV将产生所需的中和CAV特异性表位，该表位将被针对CAV免疫接种的鸡的免疫系统识别，从而引发保护性免疫应答。
可以得出如下结论，基于CAV克隆pCAV-EcoRI可以制备突变的CAV基因组，导致产生活的突变CAV颗粒，这些CAV突变体在培养的鸡T细胞中的复制比野生型CAV慢，由这些CAV突变体导致的致细胞病变效应也比野生型CAV低，所有CAV突变体均能产生所有的CAV蛋白，从而产生所需的VP1上的中和表位。
因此，这些CAV突变体是CAV的减毒版本。
附图描述图1示出用来自VP1的肽(12聚体)对132.1型中和单克隆抗体的肽扫描分析。
图2示出用来自VP2的肽(12聚体)对132.1型中和单克隆抗体的肽扫描分析。
图3示出重组转移载体pUW-VP1/VP2的示意图。
图4示出重组转移载体pMD-US10-SV-VP1/VP2的示意图。
图5示出基于含有野生型CAV的2319bp的质粒pCAV/EcoRI产生减毒CAV突变体的策略。
图6示出各种突变的和野生型CAV毒株的CAV启动子/增强子区的示意性结构。
图7示出在转染突变的或野生型环化DNA后各种突变CAV和野生型CAV的VP3表达速率，VP3表达速率以VP3阳性MDCC-MSB1细胞的百分比给出。
图8为CAV的序列。
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权利要求
1.一种中和抗体或抗体片段或其衍生物，其与鸡贫血症病毒(CAV)的病毒蛋白1(VP1)的一个构象表位反应，所述的构象表位被命名为132-1，132-2或132-3的单克隆抗体识别，所述的单克隆抗体由在法国巴斯德研究所保藏，保藏号为xxxxxx，yyyyyy，zzzzzz的杂交瘤产生。
2.一种由权利要求1的抗体识别的鸡贫血症病毒的病毒蛋白1的构象中和表位。
3.一种用于生产包含权利要求2的构象表位的病毒蛋白1的方法，所述方法包括在一个细胞中将所述的病毒蛋白1与所述的CAV的病毒蛋白2一起表达，其中编码VP1的遗传信息和编码VP2的遗传信息独立地存在于一个重组载体中。
4.一种用于权利要求3的方法中的载体，包括作为两个独立编码序列的编码VP1的遗传信息和编码VP2的遗传信息。
5.权利要求4的载体，其是基于Marek氏症病毒载体的载体。
6.权利要求4的载体，其是基于杆状病毒载体的载体。
7.一种提供包括权利要求1的中和构象表位的病毒蛋白1的方法，所述方法包括从编码VP1和VP2的基因表达至少VP1和VP2的功能部分，其中所述的基因处于衍生于转录起始位点上游的CAV序列的调控序列的控制之下，所述的调控序列经修饰以降低其作用。
8.权利要求3或7的方法，其中VP1是以病毒颗粒的形式提供。
9.权利要求7的方法，其中所述的修饰位于启动子/增强子区。
10.权利要求9的方法，其中所述的修饰位于启动子增强子区的12bp插入序列中。
11.由权利要求7-10任一项所述的方法获得的重组病毒颗粒。
12.一种用于权利要求7-10任一项所述的方法中的核酸，所述的核酸包括编码至少VP1的功能部分的基因和编码VP2的功能部分的基因，至少一种所述的基因处于一调控序列的控制之下，所述的调控序列经过修饰以降低作用。
13.一种用于检测或确定样品中是否存在CAV或抗CAV抗体的诊断试剂盒，其使用权利要求1的抗体和/或权利要求2的表位。
14.一种用于治疗或预防CAV相关疾病的疫苗，包括权利要求1的抗体或权利要求2的表位以及适合给药的佐剂和/或赋型剂。
15.一种用于治疗或预防CAV相关疾病的疫苗，包括权利要求11的重组病毒颗粒以及适合给药的佐剂和/或赋型剂。
全文摘要
本发明描述了鸡贫血症病毒的构象中和表位的产生以及用于预防或治疗CAV感染的组合物,特别是比CAV本身致病性低的疫苗。所有这些组合物均显示能合成抗CAV感染的保护性免疫应答所需的构象中和表位。本发明提供了从CAV基因组衍生的重组DNA分子,以及整合进其它病毒载体中的CAV基因组的重组DNA片段。具体地,这些组合物包括抗CAV感染的亚单位疫苗,重组活病毒疫苗以及减毒疫苗。本发明还提供了抗CAV的中和抗体的生产方法以及用于检测CAV的诊断试剂盒。
文档编号C12P21/02GK1194001SQ96195434
公开日1998年9月23日 申请日期1996年6月7日 优先权日1995年6月7日
发明者马休斯·许贝特斯·马丽亚·诺泰博恩, 古斯·科克 申请人:埃斯库拉普公司