专利名称：人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防和治疗用人源基因工程单克隆抗体的制备及应用，尤其是特异性什对甲肝病毒VP1蛋白的中和性基因工程单克隆抗体。
自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来，单克隆抗体作为一类用于基础研究，实验室诊断，临床治疗和预防的新型产物，其运用价值和开发前景已获得普遍的肯定。分子生物学和分子免疫学的研究发展导致了基因工程抗体的产生和发展。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。目前美国FDA批准上市或待批的生物制品中，各种形式的单克隆抗体和基因工程抗体占到一定比例，目前以批准上市的67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体共有9种。正在待批中等抗体有35种(。其中已批准上市并且产生巨大经济和社会效益的四种人源化基因工程抗体中，其中有一种即为抗病毒基因工程抗体，其商品名为“SynagisTM″，为人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗体，而来源于噬菌体抗体库筛选的人源抗RSV病毒基因工程抗体已被批准进入Ⅱ期临床，另一种抗病毒抗体抗乙型肝炎表面抗原抗体也在审批之中。
至今为止，大多数病毒性疾病无特异性治疗药物，用于临床治疗和预防某些病毒性疾病的生物制品仍然以血制品为主，如多年来临床上使用的血源性丙种球蛋白，用于甲肝或乙肝病毒引起的病毒性肝炎以及麻疹等，这些血制品中不仅非特异性杂蛋白多，特异性抗体含量很低，而且最大的问题是血源制品潜在的未能检出的病原污染问题，从长远利益考虑应当摒弃。因此以人源基因工程产品替代血制品已成为国内外研究的一大方向，并正在逐步走向成功。用纯鼠源单克隆抗体预防和治疗病毒性疾病在国际上尚无任何批准的先例，国内有提出申请用于抗脑炎和出血热的临床治疗，鼠源抗体人用最大的不利之处为异源蛋白，在人体内易引起遗传免疫排斥而使抗体失效并引起免疫性疾病。因此，特异性抗病毒人源中和性抗体是病毒性疾病预防和治疗的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗体的研究除已成功的抗RSV抗体外，通过噬菌体表面呈现系统，基因工程抗体库技术和分子生物学手段的联合运用，这一领域的研究已取得重大进展目前已研制成功的人源抗病毒抗体有抗以下病毒的抗体呼吸道合胞病毒，爱滋病毒(HIV)，乙肝病毒，丙肝病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，汉坦病毒，B19病毒，CMV病毒等以及尚未发表的本所已研制成功的抗甲型肝炎病毒，狂犬病毒抗体等。抗甲肝抗体制剂研制成功，将为国内外首创，有可能获一类新药正书。
本发明的目的是通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用，直接从人抗体基因库中筛选出中和性抗甲肝病毒的基因工程单克隆抗体，获得其抗体基因，为将来可能的临床抗病毒预防和治疗提供可行性的特异性抗体药物。
本发明陈述的人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体包括(1)为一种人源的在原核细胞中获得稳定有效表达的重组IgG Fab抗体，由重链Fd和轻链Lambda链组成，命名为HAFab16。
(2)其抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域(Complementarity-Dertemining Regions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。
(3)特异性的轻链和重链基因来源于对人源抗甲肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，轻链和重链相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列，其重链CDR1区氨基酸序列为DYGLS；CDR2区为YINRNGYRTGYADSVKG；CDR3区为RYNYGVQYYFDY。其轻链CDR1区氨基酸序列为SGTSSNIGNNYVS；CDR2区为DNNKRPS；CDR3区为CGTWDSSLSGVV。
(4)特异性识别甲肝病毒VP1蛋白，并具有抗甲肝病毒感染的中和活性(5)利用上述获得的中和性Fab抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒系统中表达此抗体基因或以此为基础的改建后的含有此抗体基因任何其他基因，获得具有中和甲肝病毒感染的抗体产物，可在临床上用于预防和治疗由甲肝病毒引起的甲型肝炎。
传统的利用杂交瘤细胞技术获得人源单克隆抗体相当困难，而且建立的细胞系通常不稳定，基因易丢失。本发明陈述的人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体，是在获得抗体基因的基础上获得基因产物的表达，此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，并可根据不同需要任意改建抗体基因，从而获得一种可行性的临床治疗用抗体制剂。
以下的优先实施例对本发明作详细说明，担不意味着限制本发明的内容。在这些实施例中，为说明本发明，采用噬菌体表达载体为pComb3(Barbas C.Ⅲ et al,Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991,89:10164-10168)。所用主要菌株为商品化产品XLI-Blu(美国Strategene公司)。所用噬菌体为VCSM13。甲肝病毒为从我国病人分离的龙甲株。
实施例1-4为人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体HAFab16的筛选制备方法；实施例5为人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体HAFab16的基因特征；实例6-9为人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体HAFab16的蛋白及功能特征。
实例1人源IgG Fab段基因的PCR扩增用淋巴细胞分离液甲肝病人恢复期抗凝血中分离淋巴细胞，用Tril-Zon(美国Gibco,BRL)提取总细胞RNA，用Olig-dT引物将提取的RNA通过逆转录酶(美国Gibco,BRL)逆转录成cDNA，用一组特异性IgGFabGamma链、Kampa链及Lamda链引物(表1)，对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为94℃ 1分钟，54℃1分钟、72℃ 2分钟，35个循环(PE480)，上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收，经过DNA纯化柱Spin-X(美国Gibco,BRL)纯化后，获得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd链PCR产物。
实例2噬菌体抗体基因库的建立将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合，将不同引物合成的Fd链混合，分别用SacⅠ/XbaⅠ和XhoⅠ/SpeⅠ克隆入噬菌体载体pComb3，将克隆入轻，重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水悬起，电转导入事先制备好的200ul电转菌XLI-Blu，(电转条件为Bio-Red电转仪，0.2cm电转杯，2.5K伏)，电转后加10mlSOC培养液，37℃ 1小时，加入10ml带有氨苄青霉素和四环素的SB培养液(3),37℃ 1小时，加入80-100ml前述SB,37℃ 2小时后加入辅助噬菌体M13GCM 1 X10 12,1小时后加入卡那霉素(70ug/ml),37℃摇床培养过夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌体上清，经9000 rpm,20分钟，4℃离心后，用2m1 0.02M PBS PH7.4重悬沉淀，建立噬菌体抗体库，分装保存于-20℃冰柜中。
实例3用于抗体库富集筛选的甲肝病毒抗原的制备甲肝病毒在Frhk4细胞上培养21天后收获，基本按文献(Hughes,J.V.,L.W.Stanton,J.E.Tomassini,et alNeutralizing monoclonal antibodies to hepatitis A virus:partial localizationof a neutralizing antigenic site.J.Virol,52:465-473.1984)方法通过蔗糖垫层超速离心纯化甲肝病毒抗原，纯化后的甲肝抗原可直接用于包被ELISA板。
实例4富集筛选采用纯化的甲肝病毒包被ELISA板，对上述建立的人抗甲肝病毒抗体库进行了4轮富集筛选。我们对每轮筛选后随机挑取的克隆进行了限制性内切酶酶切鉴定分析。用XbaⅠ/XhoⅠ酶切后，带噬菌体基因Ⅲ和人抗体Fab段轻重链基因插入的克隆应切出约2.2Kb的条带以及3.0Kb的载体带。随筛选轮数的增加，带有双链基因插入的克隆也逐渐增加，到最后一轮约有90％克隆显示有重链和轻链基因的插入。
实例5人IgGFab抗体HAFab16的可变区基因的核酸序列分析用QiagenMiniprep Kit(美国Qiagen)制备质粒DNA进行核酸序列分析。测序为自动测序。至少3个克隆被用于确定同一相同的序列。所获序列均用DNA Strider(美国微软公司)序列分析软件进行分析处理，并比较Internet网络上基因库中的IgG序列。证实人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体HAFab16基因由人IgGγ链Fd和λ链组成，其基因特征由VH和VL结构域中的6个CDR区的特异性核甘酸序列和氨基酸构成，即VH-CDR1,VH-CDR2,VH-CDR3和VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3。序列资料如附
图1，是抗体HAFab16的可变区基因的核酸序列和氨基酸序列。
实例6将带有HAFa16抗体轻重链基因插入的阳性克隆扩增后按常规方法提取质粒DNA，用SpeⅠ和NpeⅠ切除载体中的gⅢ，变FdgⅢ融合蛋白为独立表达的蛋白，连接后转化XLl一Blu菌，从过夜生长的氨苄碟子中挑取单个菌落，接种SB或TB细菌培养液，当细菌长至OD=0.2-0.3，加入1mM IPTG，在30℃诱导表达10-12小时。收获细菌，离心后加入原培养液10倍浓缩量的PBS(0.02M PH7.4)悬起，反复冻融3次，高速离心后其上清即为表达的Fab抗体。
实例7从甲肝病人恢复期血中分离淋巴细胞，用PCR技术扩增了人源IgG Fab抗体基因，建立了噬菌体抗体基因库，用噬菌体表面呈现技术筛选到了12株抗甲肝病毒Fab抗体基因，如图2，是人源抗甲肝病毒基因工程Fab抗体与纯化甲肝病毒抗原ELISA结合和与HRP标记的鼠抗甲肝病毒Mabs的竞争结合。图2同时表明，筛选出的12株抗甲肝病毒Fab抗体包括HAFab16均能良好地竞争HRP标记的中和性鼠抗甲肝单克隆抗体Mab37，而这株Mab已被确定与国际上公认的鼠抗甲肝VP1蛋白的中和抗体K3-4C8和K2-4F2完全竞争。
实例8从获得的上述Fab抗体中选出两株Fab抗体Fab9和Fab16进行进一步研究，如图3显示大肠杆菌表达的Fab抗体粗制品与未标记的国际标准株单抗K3-4C8和K2-4F2竞争ELISA。Fab16能和上述两株抗VP1蛋白单抗结合。说明其可能针对甲肝病毒VP1蛋白。图4显示抗体Fab9和Fab16与甲肝病人血清的良好竞争。表明这两株抗体针对甲肝病毒主要抗体决定簇。
实例9细胞中和试验为了解所获得的人抗甲肝病毒Fab抗体是否具有体外中和活性，对上述8株阳性克隆表达后的细菌裂解上清进行了体外中和实验，结果表明所有HAFab16抗体据有体外中和甲肝病毒的活性(即ELISA检测甲肝病毒为阴性)，而阴性对照则不能中和甲肝病毒(即检测甲肝病毒为阳性)，如下面表1，是重组抗HAVFab抗体对甲肝病毒的中和活性。表1样本 中和试验所用病毒量TCID50病毒检测结果/管数重组抗体Fab9(1∶2稀释) 30 0/4重组抗体Fab16(1∶2稀释)30 0/4阳性血清对照(1∶100稀释) 30 0/4阴性菌裂解上清对照(1∶2稀释) 30 4/4+病毒对照 30 4/4正常细胞对照0 0/权利要求
1.人源抗甲肝病毒中和性基因工程抗体，其特征在于(1)为一种在原核细胞中获得稳定有效表达的基因重组的人源抗甲肝病毒糖蛋白VP1中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体，由Fd和Lambda链组成。(2)其抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域(Complementarity-Dertemining Regions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，如摘要附图。(3)特异性的轻链和重链基因来源于对人源抗甲肝病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达，其相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列其重链CDR1区氨基酸序列为DYGLS；CDR2区为YINRNGYRTGYADSVKG；CDR3区为RYNYGVQYYFDY。其轻链CDR1区氨基酸序列为SGTSSNIGNNYVS；CDR2区为DNNKRPS；CDR3区为CGTWDSSLSGVV。(4)特异性识别甲肝病毒VP1蛋白，并具有抗甲肝病毒感染的中和活性
2.人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体的用途，其特征在于利用上述获得的中和性Fab抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒系统中表达此抗体基因或以此为基础的改建后的含有此抗体基因任何其他基因，获得具有中和甲肝病毒感染的抗体产物，可在临床上用于预防和治疗由甲肝病毒的甲型肝炎。
3.根据权利要求1人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体，其特征在于编码所述特异性Fab抗体蛋白的基因为人源抗甲肝病毒中和性抗体基因，可被用于任何表达系统表达抗甲肝病毒中和抗体。
4.根据权利要求1人源甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体，其特征在于编码所述特异性Fab抗体蛋白的基因为人源中和性抗甲肝病毒抗体基因，其核苷酸序列或由此产生的氨基酸序列可被用于相关基因的改造，而表达抗甲肝病毒VP1蛋白的中和性抗体或多肽产物。
5.根据权利要求1人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体，其特征在于所述抗体具有识别甲肝病毒VP1蛋白上中和抗原，从而阻断甲肝病毒毒感染的功能，其基因表达产物可望在临床上用于预防和治疗由甲肝病毒引起的甲型病毒性肝炎。
全文摘要
人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗体，包括Fab段抗体基因、基因产物及其应用。其特征在于此重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合甲肝病毒的功能性中和抗体。其今后的可能用途在于利用上述获得的中和性Fab抗体或IgG全抗体基因，可以在原核细胞、孝母细胞、昆虫细胞和真核细胞及任何表达系统中生产此抗体，可在临床上预防或治疗甲型肝炎。
文档编号A61K39/42GK1316437SQ0013228
公开日2001年10月10日 申请日期2000年11月22日 优先权日2000年5月12日
发明者梁米芳, 曹经瑗 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所