用于测定甲肝病毒的方法、组合物和试剂盒的制作方法

用于测定甲肝病毒的方法、组合物和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于测定样品中HAV存在或不存在的组合物、方法和试剂盒。
【专利说明】用于测定甲肝病毒的方法、组合物和试剂盒
发明领域
[0001]本发明涉及甲肝病毒(HAV)且包括用于检测其的方法、组合物和试剂盒。
[0002]发明背景
[0003]HAV是导致肝的非慢性感染的RNA病毒，并且其可经由血液产品传播。对收集来用于制造生物治疗物的献血血浆要HAV RNA测试，排除测试阳性的献血。
[0004]因此，仍然需要用于检测HAV的组合物和方法。
[0005]发明概述
[0006]在一个方面，现提供包含如下列出的核苷酸序列或其互补体的分离的核酸分子:
[0007]5，-GCG CCC GGC GGG GTC AAC TCC AT-3， (SEQ ID NO:1)；
[0008]5，-AGC CAA GTT AAC ACT GCA AGG-3，(SEQ ID NO:2);或
[0009]5’-TTA GCA TGG AGC TGT AGG AGT CTA AAT TGG GG-3’ (SEQ IDNO:3)。
[0010]在另一个方面， 本发明提供一种组合物，其包含一对寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物对包含具有如SEQ ID NO:1中所列序列的前向引物和具有如SEQ ID N0:2中所列序列的反向引物，其中所述引物对能够在PCR条件下与靶序列退火以扩增所述靶序列。
[0011]在另一个方面，本发明提供一种用于扩增靶序列的方法，所述方法包括:
[0012]以靶序列作为模板实施PCR，其中实施包括为PCR提供包含如SEQ ID N0:1中所列序列的前向引物和包含如SEQ ID N0:2中所列序列的反向引物。
[0013]在一个方面，本发明提供一种用于测定样品中HAV的方法，所述方法包括:
[0014]用所述样品中的核酸模板实施PCR，其使用包含如SEQ ID NO:1中所列序列的前向引物和包含如SEQ ID N0:2中所列序列的反向引物；和
[0015]检测由前向和反向引物生成的扩增子，其中所述扩增子的存在确定HAV是否存在于样品中。
[0016]仍在别的方面，本发明提供一种试剂盒，其包含本发明的组合物和/或一种或多种核酸分子。
[0017]发明详述
[0018]在一个方面，现提供包含如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列或其互补体的分离的核酸分子。
[0019]在一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含如SEQID NO: K SEQ ID N0:2、或SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列，或其具有至少10个核苷酸(例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、27、29、30、31、或 32个核苷酸)的片段。
[0020]在其他实施方案中，本发明的分离的核酸分子具有不超过约100个碱基对的长度，例如不超过约:100、90、80、70、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、
24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11和 IObp0
[0021]在另一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，其由或基本由选自下组的核苷酸序列组成:SEQ ID N0:USEQ ID N0:2、或SEQ ID N0:3、或其互补体。[0022]术语“核酸分子”在本文中包括由天然存在的核苷酸碱基、糖和共价核苷间(主链)连接构成的聚合物以及具有发挥类似功能的非天然存在部分的核酸分子。此外，术语“核酸分子”还包括为双链、单链的聚合物，包括RNA、DNA、经修饰RNA或DNA、RNA或DNA模拟物、或其任意组合。
[0023]在一些实施方案中，寡核苷酸引物和探针可自本文中公开的核酸序列衍生。在各个实施方案中，引物和探针彼此组合使用。本发明可用于多种不同的应用中，包括但不限于，HAV的研究、医学和诊断性应用。例如，引物和探针能提供用于例如HAV检测测定法和/或试剂盒的试剂。
[0024]一般地，包含前向弓丨物和反向引物的引物对能提供对由该引物侧接的靶核酸的特异性扩增(例如通过PCR)以产生扩增产物(亦称为“扩增子”)。在此方面，每种引物结合其互补或基本互补的靶序列，由此为聚合酶结合提供位置并通过添加核苷酸来延伸每种引物的3’端，如此提供所述靶序列的互补性拷贝。
[0025]在一个实施方案中，引物对包含具有如SEQ ID NO:1中所列序列的前向引物和具有如SEQ ID N0:2中所列序列的反向引物。
[0026]在一个实施方案中，所述靶核酸至少为从HAV的逆转录RNA制备的cDNA的区段。本领域普通技术人员会认可，能使用本领域中已知的方法(例如，逆转录(RT))来逆转录RNA以提供由引物扩增的模板。
[0027]例如，在一些实施方案中，逆转录-PCR(RT-PCR)使用逆转录酶、聚合酶和本发明的一对HAV特异性引物来进行以扩增样品中的HAV病毒RNA。所述样品可以是培养上清或从HAV感染的个体制备的血浆标本。本发明的HAV特异性引物对能够扩增HAV病毒RNA。
[0028]一般而言，探针是与靶核酸的核苷酸序列互补或基本互补的寡核苷酸。探针可用于多种应用，包括但不限于，`检测或捕捉靶核酸或对应于靶物的扩增子。例如，适用于基于扩增的检测方法的探针可从位于扩增产物序列内和/或包含扩增产物序列的任何序列来设计，所述扩增产物是使用两种选定的引物产生的那些。
[0029]在一个实施方案中，所述探针包含与由弓丨物对生成的扩增子序列的至少一部分互补或基本互补的核苷酸序列，所述引物对包含具有如SEQ ID N0:1中所列序列的前向引物和具有如SEQ ID N0:2中所列序列的反向引物。
[0030]在其他实施方案中，所述探针包含如SEQ ID N0:3中所列的核苷酸序列或其互补体。
[0031]本领域技术人员将认可，本发明的分离的核酸分子(包括引物和/或探针)可通过记载于 Current Protocols in Molecular Biology (1999.Ausubel FM, Brent R, KingstonRE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K 编.John ffiley&Sons, Inc.)的标准分子生物学技术或通过化学合成或通过核酸类似物来获得。牵涉化学合成的方法可以是自动化和商品化的，且可以包括例如,磷酸二酯、磷酸三酯或亚磷酰胺(phosphoramidite)方法。通过提述并入本文的美国专利N0.4，458，066 ;4，415，732 ;及Meth.Enzymol.197968:90和109披露了化学合成方法的例子。化学核酸合成允许向核酸分子中掺入非天然或经修饰的碱基以及多种标记模块。此外，经修饰的主链化学如例如肽连接、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoroamidate)、憐酸三酯、2’ -O-甲基 RNA、2’ -O-Mt RNA、P-乙氧基 DNA 和 P-乙氧基2’-O-Mt RNA也是容易可获且本领域中已知的。此外,在核酸杂交测定法中使用可交联探针来交联至祀序列是本领域中已知的。例如，基于呋喃香豆素(furocoumarin)或补骨脂素(psoralen)经由形成加合物而附接于核酸分子所得的化合物记载于美国专利N0.4，826，967和美国专利N0.5，082, 934 (两者均通过提述并入本文)，这些文献描述了可光活化的核苷类似物，其包含香豆素模块，在不存在干扰性碱基模块的情况下，所述模块经由其苯环连接至核糖或脱氧核糖糖模块的1-位。
[0032]核酸类似物和模拟物具有与天然核酸分子类似的化学结构，但具有独特的修饰。核酸类似物如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代改进了传统核酸分子的能力并突破了与标准核酸化学有关的限制(Karkare S和Bhatnagar D.Appl.Microbiol.Biotechnol.200671:575-586)。这类核酸类似物极大地扩展并改进了检测和鉴定相关核酸序列的能力。
[0033]在一些方面，本发明的分离的核酸分子还包含一个或多个异源核苷酸。术语“异源核苷酸”在本文中指并非分离的核酸分子的天然部分但天然或人工地连接至该分离的核酸分子的一个或多个核苷酸。异源核酸序列的例子包括但不限于，载体序列、与纯化探针的碱基序列互补的序列和包含一个或多个限制酶位点的序列。
[0034]在一个实施方案中，所述一个或多个异源核苷酸包含与纯化探针的碱基序列互补的序列。所述纯化探针可连接至固体支持物如例如基质或游离在溶液中的颗粒。固体支持物的非限制性例子包括硝酸纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合的聚合物、聚苯乙烯、硅烷聚丙烯和可磁性吸引的颗粒。例如，可用胺或生物素标签经由交联剂标记所述纯化探针，其可包含DNA或RNA序列。然后，在这些经生物素或胺标记的纯化探针上实施允许体外核酸:核酸或蛋白质:核酸相互作用的固定化和检测策略。如此，分离的核酸分子的异源区段与其在纯化探针上的互补碱基序列的退火能促进与该分离的核酸分子的病毒特异性序列区段退火的那些分子的样品纯化。通过提述并入本文的美国专利N0.6，534，273描述了一种用于将样品中的靶核酸分子捕获到固体支持物上的方法。
[0035]在一个实施方案中，将本发明的分离的核酸分子连接至如上文所述的固体支持物。例如。
[0036]在一些实施方案中，所述一个或多个异源核苷酸包含一个或多个重复碱基序列，例如，与纯化探针的一个或多个重复碱基序列互补的一个或多个重复碱基序列。重复碱基序列可以是有规律重复的碱基序列，如通过例如聚腺嘌呤(An)、聚胸腺嘧啶(Tn)、聚胞嘧啶(Cn)、聚鸟嘌呤(Gn)和聚尿嘧啶(Un)的核酸同聚物形成的那些。重复序列还可以包括混合的聚合物，如AT重复([AT]n)等。
[0037]分离的核酸分子的一个或多个异源核苷酸的重复碱基序列的碱基数可以等于、大于或小于纯化探针的重复碱基序列的碱基数。互补重复序列的长度可确定异源区段:纯化探针复合物的解链温度CU。在一个实施方案中，异源区段的重复碱基序列长于纯化探针的互补重复碱基序列。在另一个实施方案中，异源区段或纯化探针的重复碱基序列的长度可以为至少约5个碱基，例如约5至约40、约10至约30、或约15至约20等。
[0038]在其他实施方案中，所述一个或多个异源核苷酸包含可操作连接的调控序列。在一个实施方案中，所述调控序列是增强子或启动子序列，其被结合该序列并启动转录以产生RNA转录本的RNA聚合酶特异性识别。被RNA聚合酶识别的启动子的非限制性例子包括启动子如Τ3、Τ7、或SP6。如此，分离的核酸分子可用于多种基于核酸的测定法，包括使用RNA聚合酶来产生多个RNA转录本的测定法，如例如转录介导的扩增(TMA)测定法，如记载于Nature350:91-92 (1991);和美国专利N0.5，399，491的，两者均通过提述并入本文。
[0039]在一个实施方案中，将本发明的分离的核酸序列标记，例如放射性、化学发光性、荧光性、磷光性标记或用红外线染料或用表面增强的Raman标记物或等离子体共振颗粒(PRP)标记。例如，对核苷酸的修饰包括添加吖啶或其衍生物、Acrydite?、胺、生物素、BHQ-lTM、BHQ-2TM、BHQ-3?、硼烷dNTP、碳间隔物(例如，C3、C6、C7、C9、C12或C18)、cascade blue、
胆固醇、香豆素或其衍生物、Cy3?、Cy3.5?、Cy5?、Cy5.5?、Cy7? DABCYL、丹
酰氯(dansylchloride)、洋地黄毒苷、二硝基苯基、双重生物素、EDANS、6_FAM、突光素、3’ -甘油基、HEX、IAEDANS,倒转 dA、倒转 dG、倒转 dC、倒转 dG、IRD-700、IRD-800、JOE、La Jolla Blue、金属簇如金纳米颗粒、苯基硼酸、磷酸盐补骨脂素、3’-或5’-磷酸化、花—、3，核糖-腺苷、3’核糖-鸟苷、3’核糖-胞苷、(LC)Red640、(LC) Red705、罗丹明、R0X、硫醇(SH)、间隔物、TAMRA, TET、AMCA-S?、SE、BODIPY?、Marina Blue?、
Oregon Green?、Pacific Blue'?、QSY71' Rhodamine Green?、 Rhodamine
Red?、Rhodol Green?、四甲基罗丹明、Texas Red?、Un1-Link NH2 修饰物、放射性标
记物(例如，1251、1311、35s、14c、32p、33p、3h)和纳米颗粒。多种标记技术是本领域普通技术人员已知的。
[0040]标记物可直 接或间接连接于分离的核酸分子。核酸标记可通过将可检测基团(标记物)共价附接于例如内部或末端位置来进行。本领域技术人员知道有多种用允许添加标记物的反应性官能来衍生化寡核苷酸的方式。有许多用于将标记物直接附接于核酸分子和用于生物素化探针从而可经由抗生物素蛋白来附接放射性、荧光、化学发光、酶或电子致密性标记的办法。描述标记和用于标记核酸方法的参考文献的非限制性例子包括美国专利N0.4，605，735;美国专利N0.4，757，141;美国专利N0.6，965，020;Nucl.Acids Res.5:363(1978);Nucl.Acids Res.13:1529(1985);Nucl.Acids Res.15:3131(1987) ;Nucl.Acids Res.1 5:6455 (1987) ;Nucl.Acids Res.13:4485 (1985) ;Nucl.Acids Res.15:4837 (1987) ;and Anal.Biochem.169:1_25 (1988)，通过提述将其涉及核酸标记的公开内容并入本文。
[0041]在一些实施方案中，使用荧光共振能量转移(FRET)来标记分离的核酸分子以用于检测方法。FRET涉及两种染料，供体燃料和受体染料。如果受体本身是荧光性的话，FRET可通过所述受体染料的荧光("被致敏的荧光")检测，或者如果受体是猝灭性非荧光染料的话，通过猝灭供体染料荧光来检测。如果供体染料在一段时间内释放其荧光，那么FRET可延迟。该过程称为〃TR-FRET〃或〃时间分辨FRET〃。供体和受体染料还可以是相同的，在此情况下通过荧光去极化来检测FRET。染料还可以是共价偶联的以形成串联荧光染料或串联染料或串联偶联物。例如，单种供体染料能同时激发两种受体染料，其导致多种波长的光的发射。优选地，供体发射波长谱至少应部分与受体吸收波长谱重叠。
[0042]可采用的荧光染料包括但不限于，BODIPY FL、Cy3?、Cy3.5?, Cy5.RTM.、
Cy5.5?、EDANS、FAM、荧光素、HEX、IAEDANS, JOE、Oregon Green?、(LC)Red640、(LC)Red705、ROX, TAMRA, TET、四甲基罗丹明和Texas Red?。[0043]猝灭剂染料包括但不限于，BHQ-l?、BHQ-2?、BHQ-3?、DABCYL、金属簇如金纳米颗粒和QSY7?。
[0044]可采用的供体/受体对包括但不限于，FAM/BHQ-1、TET/BHQ-1、J0E/BHQ-1、HEX/BHQ-1、Oregon Green/BHQ-1、TAMRA/BHQ-2、R0X/BHQ-2、Cy3/BHQ_2、Cy3.5/BHQ-2、TexasRed/BHQ-2、TexasRed/BHQ-2、Cy5/BHQ_3、Cy5.5/BHQ-3 荧光素 / 四甲基罗丹明、荧光素 /荧光素、荧光素/QSY7、荧光素/LC RED640、荧光素/LC Red705IAEDANS/荧光素、EDANS/DABCYL和 BODIPY FLI/BODIPY FL。
[0045]在一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NOiUSEQID N0:2、或SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列或其互补体，其中所述核酸分子还包含可检测标记物。
[0046]在一些实施方案中，所述可检测标记物对应于适于使用FRET检测的供体/受体对。
[0047]在其他实施方案中，所述供体/受体对是FAM/BHQ-1。
[0048]仍在别的实施方案中，本发明提供一种分离的核酸分子，其包含如SEQ ID N0:3中列出的核苷酸序列，其中所述核酸分子在5’端包含FAM且在3’端包含BHQ-1。
[0049]在其他实施方案中，本发明的核酸分子能用于同时使用两种或更多种利用供体-受体能量转移的探针的情形，由此例如制备具有带不同色荧光团的分子信标，使得能够在同一反应中进行同时检测不同靶物的测定法。例如，多重测定法可包含许多不同的引物集，每个集能够从不同HAV的扩增独特的基因序列，而且可存在相应数目的分子信标，每种各包含对扩增子之一特异性的探针序列，且每种用具有不同颜色的荧光团标记。所得荧光的颜色(若存在)鉴定样品中的HAV，且生成可检测荧光所需的扩增循环数提供对存在的靶生物数的定量量度。如果样品中存在超过一种类型的HAV，那么存在的荧光颜色能鉴定出存在哪种。`
[0050]在其他方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明的一种或多种分离的核酸分子。在一些实施方案中，所述组合物是缓冲溶液。在其他实施方案中，所述组合物是冻干的。
[0051]在一个实施方案中，所述组合物包含一对引物，其具有如(SEQ ID NO:1/SEQ IDNO:2)中所列序列。
[0052]在一个实施方案中，所述组合物还包含一种探针，其具有如SEQ ID NO: 3中所列序列或其互补体。
[0053]在另一个实施方案中，提供一种包含第一、第二和/或第三对引物的组合物，其中第一对引物具有如(SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2)中所列序列。在一个实施方案中，所述组合物还包含第一、第二和/或第三探针，其中所述第一、第二和/或第三探针各包含适于在多重实时PCR中使用的可检测标记物。
[0054]在其他实施方案中，所述组合物包含一对具有如(SEQ ID NO:1/SEQ ID NO: 2)中所列序列的引物和具有如SEQ ID NO:3中所列序列的探针或其互补体。
[0055]在一个实施方案中，除了本发明的一种或多种核酸分子以外，所述组合物还包含另外的试剂如合适浓度的DNA聚合酶、辅因子和脱氧核糖核苷-5’-三磷酸以提供靶核酸的扩增。举例而言，在一些实施方案中，其中所述组合物是PCR溶液，最小量的DNA聚合酶可以是至少约0.5单位/100 μ I溶液，例如约0.5至约25单位/100 μ I溶液和约7至约20单位/100 μ I溶液。其他量可用于给定的扩增反应或系统。“单位”可定义为在74°C在30分钟内将10纳摩总核苷酸(dNTPs)掺入到正在延伸的核酸链中所需的酶活性的量。另举个例子，在其他实施方案中，扩增中使用的每种引物的量可以为至少约0.075微摩，例如约
0.075至约2微摩，但给定的扩增反应或系统中可使用其他量。再举个例子，在一些实施方案中，溶液中每种dNTP的量可以为约0.25至约3.5毫摩，但其他量可用于给定的扩增反应或系统。
[0056]在其他方面，本发明提供一种用于扩增对应于HAV的靶序列的方法。例如，在合适的PCR条件下用靶序列和各自能够与靶序列退火的至少一种前向引物和反向引物能提供对靶序列的扩增。
[0057]在一个实施方案中，本发明提供一种用于扩增靶序列的方法，所述方法包括:以靶序列作为模板实施PCR，其中实施包括为PCR提供包含如SEQ ID NO:1中所列序列的前向引物和包含如SEQ ID N0:2中所列序列的反向引物。在一个实施方案中，靶序列对应于从包含HAV的样品的RNA制备的cDNA。
[0058]在其他方面，本发明提供一种用于测定样品中HAV的方法。例如，所述样品可包含HAV RNA或所述样品可以是其中待测定HAV的存在或不存在的样品。
[0059]在一个实施方案中，本发明提供一种用于测定样品中HAV的方法,所述方法包括:
[0060]a.用样品中的核酸模板实施PCR，其使用包含如SEQ ID NO:1中所列序列的前向引物和包含如SEQ ID NO:2中所列序列的反向引物；和
[0061]b.检测由前向和反向引物生成的扩增子，其中所述扩增子的存在确定样品中的HAV0
[0062]在一个实施方案中，模板是从包含HAV的样品的RNA制备的cDNA。
[0063]检测步骤可通过本领域普通技术人员已知的许多技术来进行。在一个实施方案中，所述扩增子可使用探针来检测，所述探针针对检测标记过且可与扩增子直接或间接杂交。探针可以是可溶性的或附接于固体支持物。
[0064]在一个实施方案中，所 述探针包含可检测标记物，其对应于适合使用FRET检测的供体/受体对，其中所述探针包含如SEQ ID N0:3中所列序列或其互补体。例如,在一些实施方案中，供体/受体对是FAM/BHQ-1。
[0065]在另一个实施方案中，可将用于扩增靶核酸的一种或多种引物例如用特异性结合模块标记。所得引物延伸产物(其中已掺入经标记的引物)可用探针捕捉。对与探针杂交的扩增后靶物的检测可通过检测经标记探针或经标记扩增靶物的存在来实现，其使用本领域中公知的合适检测装备和规程。
[0066]在其他实施方案中，将用于扩增靶核酸的一种或多种引物用生物素标记，且将生物素化的扩增后靶核酸与附接于固体支持物的探针杂交。然后，结合的靶物通过将它们与链霉亲合素-过氧化物酶偶联物在存在氧化剂如过氧化氢和合适的染料形成组合物的情况下接触来检测。
[0067]其它用于检测的技术是本领域普通技术人员已知的，包括但不限于，涉及southern印迹的方法、点印迹技术、或用经标记探针的非同位素捕捉检测。
[0068]在其他实施方案中，本发明提供一种用于测定样品中HAV的方法，所述方法包括:
[0069]a.对样品实施单一 PCR，该PCR包括包含如SEQ ID NO:1中所列序列的前向引物和包含如SEQ ID NO:2中所列序列的反向引物；和
[0070]b.检测由前向和反向引物生成的扩增子，其中所述扩增子的存在确定样品中的HAV0
[0071]在一个实施方案中，检测步骤包括在PCR中纳入一种寡核苷酸探针，其包含对应于适于使用FRET检测的供体/受体对的可检测标记物，其中所述探针包含如SEQ ID NO: 3中所列序列或其互补体。例如，在一些实施方案中，供体/受体对是FAM/BHQ-1。
[0072]如此，在用于扩增和/或测定HAV的多种方法中可单独或组合地采用本发明的核酸分子。因此，在一些实施方案中，本发明的组合物、方法和试剂盒提供PCR测定法、实时PCR测定法和/或多重实时PCR测定法，其中根据测定法的类型，所述测定法在可同一 PCR主混合物中包含一个、两个、三个或更多个引物和探针集。例如，在一些实施方案中，多重实时PCR测定法能使用单一测试检测出不同的HAV基因型。在此方面，所述引物和探针能仅与其特异性靶物相互作用且不与主混合物中存在的其他引物和探针相互作用(例如，不形成引物二聚体)，由此在PCR例如多重PCR中提供有效的靶物扩增和检测。
[0073]在其他方面，本发明的引物/探针可在定量方法中使用。可通过例如半定量或定量方法，如本领域普通技术人员已知的那些来对HAV定量。
[0074]在一个实施方案中，半定量RT-PCR结果可通过对RT-PCR反应混合物取样接着通过例如点印迹分析生成。
[0075]在另一个实施方案中，定量过程可使用非竞争性或竞争性RT-PCR技术。
[0076]非竞争性RT-PCR可包括，例如靶HAV RNA与第二 RNA分子在试剂浓度和条件下的共扩增从而在靶物和标准品之间没有竞争，且其与标准品既不共有引物识别位点也不共有任何内部序列。`
[0077]在竞争性RT-PCR中，内部标准与主要靶物共有相同的引物识别和内部序列，这导致对试剂的竞争。两者均可以相同或基本相同的效率扩增，且其扩增子可通过向标准品添加限制酶、通过改变其大小等来区分。例如，在一些实施方案中，向一系列含有靶HAV RNA的PCR管加入已知内部标准拷贝数的系列稀释。内部标准的浓度越高，则引物会结合并扩增它而非靶物的可能性就约大。溴化乙锭染色的标准品和靶物扩增子的强度的比较(例如在凝胶电泳之后)允许靶物定量。
[0078]在一个实施方案中，所述方法可能牵涉在RT之前向HAV RNA样品加入已知量的可RT-PCR扩增的竞争物，其优选为合成的HAV RNA分子。
[0079]在另一个实施方案中，本发明提供定量实时PCR测定法，例如端点PCR测定法继之以使用southern印迹、点印迹、荧光或比色检测或用于核酸检测的其他已知定性或定量方法用本文中描述的探针序列来检测。
[0080]在其他方面，本发明提供一种试剂盒，其包含分离的核酸分子，所述核酸分子包含本发明的引物和探针。试剂盒可使用本文中公开的核酸序列开发。这些序列可用作核酸扩增反应中的引物，和/或核酸杂交方法中的探针。所述试剂盒可用于确定样品中HAV核酸的存在。试剂盒中的组分可商业性获得或依照本领域中公知的方法制备。另外，如适宜地，试剂盒的组分可以在溶液中或为冻干的。在一个实施方案中，所述组分在同一区室中，而在另一个实施方案中，所述组分在分开的区室中。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含使用说明书。[0081 ] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含前向引物、反向引物和探针，其中前向引物包含如(SEQ ID NO:1)中所列前向引物核酸序列或其互补体，其中反向引物包含如(SEQ IDNO:2)中所列反向引物核酸序列或其互补体，其中探针包含如(SEQ ID NO:3)中所列探针核酸序列或其互补体。
[0082]以下实施例的提供仅用于例示。
实施例
[0083]实施例1:通过RT-PCR测定HAV
[0084]为了测定血浆样品中HAV RNA的存在，实施RT-PCR测定法。
[0085]采用具有以下序列的引物和检测探针:
[0086]前向引物:5'-GCG CCC GGC GGG GTC AAC TCC AT-3，(SEQ ID NO:1)；
[0087]反向引物:5’-AGCCAA GTT AAC ACT GCA AGG-3’ (SEQ ID NO:2)；
[0088]探针:5，-TTAGCA TGG AGC TGT AGG AGT CTA AAT TGG GG-3，(SEQ ID NO:3)。
[0089]探针在5’端用FAM标记且在3’端用BHQ-1标记。 [0090]制备包含如下的RT-PCR主混合物(MMX): Invitrogen2x PCR反应混合物；400 μ MdNTP ；4.0mM MgCl2 ;Ix ROX参照染料(0.5 μ Μ) ;400ηΜ前向引物；400ηΜ反向引物;50ηΜ 探针；IOOnM 内部对照探针；I μ L/50y L PCR 反应液的 Invitrogen SSIII One StepReverse Transcriptase (RT)和 Taq DNA 聚合酶混合物(Invitrogen, Carlsbad, CA)。
[0091]将MMX与使用本领域已知的病毒提取方法自含有病毒的血浆样品分离的病毒RNA组合。组合的HAV RNA/MMX进行一步PCR，其中在同一管中进行逆转录、cDNA扩增和检测，其使用商业实时PCR仪(Applied Biosystems7300)。热循环条件显示于表1:
[0092]表1:PCR循环条件
[0095]PCR扩增后，使用仪器软件分析生成的信号。结果显示强扩增曲线。
【权利要求】
1.一种分离的核酸分子，其包含如下列出的核苷酸序列或其互补体:
5’-GCG CCC GGC GGG GTC AAC TCC AT-3’ (SEQ ID NO:1)；
5’-AGC CAA GTT AAC ACT GCA AGG-3’ (SEQ ID NO:2);或
5’-TTA GCA TGG AGC TGT AGG AGT CTA AAT TGG GG-3’ (SEQ ID NO:3)。
2.一种组合物，其包含一对寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物对包含具有如SEQ IDNO:1中所列序列的前向引物和具有如SEQ ID N0:2中所列序列的反向引物，其中所述引物对能够在PCR条件下与靶序列退火以扩增所述靶序列。
3.权利要求2的组合物，其进一步包含寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针具有如SEQID NO:3中所列序列，其中所述探针能够与所述靶序列退火。
4.一种扩增靶序列的方法，所述方法包括: 以靶序列作为模板实施PCR，其中实施包括为PCR提供包含如SEQ ID NO:1中所列序列的前向引物和包含如SEQ ID N0:2中所列序列的反向引物。
5.权利要求4的方法，其中所述靶序列对应于从包含HAV的样品的RNA制备的cDNA。
6.一种用于测定样品中HAV的方法，所述方法包括: a.用所述样品中的核酸模板 实施PCR，其使用包含如SEQID NO:1中所列序列的前向引物和包含如SEQ ID NO:2中所列序列的反向引物；和 b.检测由前向和反向引物生成的扩增子，其中所述扩增子的存在确定HAV是否存在于样品中。
7.权利要求6的方法，其中所述检测包括向PCR提供多核苷酸探针，由此所述扩增子在存在时与探针接触，其中所述探针包含如SEQ ID NO:3中所列序列或其互补体。
8.权利要求7的方法，其中所述探针用FAM/BHQ-1标记。
9.一种试剂盒,其包含权利要求1的一种或多种分离的核酸分子。
【文档编号】C12N15/11GK103764829SQ201280040404
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年8月1日 优先权日:2011年9月7日
【发明者】S.伯德, B.布诺, D.朗斯卡 申请人:基立福疗法公司