一种1型鸭甲肝病毒vp4重组蛋白、elisa试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、 ELISA试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸭甲肝病毒（DuckΗ印atitisAVirus，DHAV)能引起雏鸭爆发鸭病毒性肝炎，其 具有发病急、病程短、传播迅速、病死率高等特点，临床上主要表现为食欲减退、神经症状、 突然死亡和肝脏肿大出血，又称歪脖病。目前几乎遍布世界各个养鸭国家和地区，给养鸭业 带来了较大的经济损失。DHAV可分为DHAV-UDHAV-2和DHAV-3三个基因型。DHAV-1为1 型鸭甲肝病毒，是引起鸭病毒性肝炎最主要的一种病原，分布最为广泛且致病性强、感染率 高，对雏鸭致死率可高达90 %以上。目前几乎遍布世界各个养鸭国家和地区，给养鸭业带来 了较大的经济损失。
[0003] 根据疾病的流行病学特点、特征性临床症状和有诊断意义的剖解病变，一般可做 出初步诊断，但是确诊尚需借助实验室检测。检测DHAV的实验室方法众多，各有优缺点，中 和试验是最经典的方法，虽然结果准确，但是操作费时，不适合临床检测。RT-PCR技术、环 介导的恒温扩增技术（LAMP)等一系列分子生物学新技术为该病毒的检测提供了快捷、高 效的方法。而用于该病抗体检测的ELISA方法操作简单，容易掌握，不需要高端精密的仪器 设备，易于推广。目前针对鸭甲肝病毒抗体检测的ELISA方法为间接ELISA，但现有的间接 ELISA方法依然存在耗时长、花费大、纯化蛋白量小，不能规模化生产。
[0004] 小RNA病毒是RNA病毒中最小的一类，分布极为广泛，可归为肠道病毒属 (enterovirus)、口疮病毒属（Aphthovirus)、心病毒属（Cardiovirus)、嗜肝病毒属 (Hepatovirus)、副肠孤病毒属（Parechovirus)、马鼻病毒属（Erbovirus)、嵴病毒属 (Kobuvirus)、捷申病毒属（Teschovirus)、禽肝炎病毒属（Avihepatovirus)等。小RNA病 毒呈圆形，病毒粒子直径为20~40nm，无囊膜，病毒的结构蛋白（衣壳蛋白）一般包括VP1、 VP2、VP3和VP4。其中VP4埋在粒子内部，处于蛋白外壳的内部与基因组RNA相连接。VP1、 VP2、VP3暴露在病毒表面，组成一个亚单位。小RNA病毒VP4蛋白在生理温度下的向外暴露 与病毒颗粒吸附细胞膜时发生的构象改变有直接的联系，VP4蛋白在病毒毒粒吸附细胞膜 之后可能参与了病毒进入细胞过程有关的相关事件。小RNA病毒的蛋白外壳具有很强的自 身动态变化，而不是像晶体结构图所反映的那样处于一个静止状态。抗体与病毒结构构象 关系的研究对理想疫苗的设计及更好地预防小RNA病毒的传播具有重要意义。但对DHAV衣 壳蛋白的研究相对很少。生物信息学分析和推测表明，DHAV的衣壳蛋白可能为VP1、VP3和 VP0而不是像其他小RNA病毒那样为VP1、VP2、VP3和VP4,因此DHAV到底是VP0还是VP2 和VP4,他们是否位于暴露在病毒表面及抗原性如何目前未见报道。
[0005] 由此可见，能否对VP4蛋白进行深入研究，基于鸭甲肝病毒的VP4蛋白建立一种重 组蛋白的方法，使得纯化获得的蛋白纯度高，并且建立间接ELISA方法，使其敏感性、重复 性及特异性好，操作简便，可规模化生产成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0006] 本发明为了解决上述技术问题，提供一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试 剂盒及其制备方法。
[0007] 本发明技术方案包括以下内容：
[0008] 一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白，所述的1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的氨基 酸序列如SEQIDN0:1所示。
[0009] 一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 步骤一：获取VP4目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP4截断基因酶切位点和特异性 引物，所述上游引物为 5' -GAATTCTACCAGTAGACTTTCATGCAATGG-3'，序列如SEQIDN0:2 所 示，下游引物为 5' -CTCGAGTTGAGCTCCTACTTCATAAGAACA-3 '，序列如SEQIDN0:3 所示，增殖 DHAV-1病毒株，提取DHAV-1病毒株的RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到VP4目 的片段；
[0011] 步骤二：构建重组表达质粒PET-32C-VP4:将所述VP4目的片段克隆至PMD19-T Simple载体中，加入连接酶，得到连接产物I，将所述连接产物I转化至感受态细胞中培养， 筛选出阳性克隆体，经鉴定后得到重组质粒PMD19-TSimple-VP4,将所述重组质粒pMD19-T Simple-VP4和表达质粒pET-32c的菌株扩大培养后提取质粒DNA，分别用EcoRI和XhoI 双酶切、纯化回收，将回收得到的VP4目的片段和载体片段pET-32c连接，得到连接产物II， 将所述连接产物II转化至感受态细胞中培养、筛选出阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质 粒pET-32c-VP4;
[0012] 步骤三：制备VP4重组蛋白：重组表达质粒pET-32c-VP4转化至大肠杆菌BL21中， 进行重组蛋白诱导表达，结束后纯化、鉴定，得到1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白。
[0013] 所述步骤二中，VP4目的片段与所述pMD19-TSimple载体的物质的量之比为6:1， 取5μL所述连接产物I加入50μL感受态细胞E.coliDH5α，吹打混匀，冰浴30min后 42°C热击60~90s，冰浴lmin，加入LB液体培养基450μL，37°C摇床1. 5h后，经Amp抗性 LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。
[0014] 所述步骤二中，所述回收得到的VP4目的片段与载体片段PET-32C的物质的量之 比为6:1，取5μL所述连接产物II加入50μL感受态细胞E.coliDH5α，吹打混匀，冰浴 30min后42°C热击60~90s，冰浴lmin，加入LB液体培养基450μL，37°C摇床1. 5h后，经 Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。
[0015] 所述步骤二中，所述重组质粒pMD19-TSimple-VP4和重组表达质粒pET-32c-VP4 的鉴定方法均包括菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定，选取所述菌液PCR鉴定正确的阳 性菌液提取质粒DNA，对提取的所述质粒DNA用EcoRI和XhoI进行双酶切鉴定，选取经菌 液PCR和双酶切鉴定均正确的菌株进行所述测序鉴定。
[0016] 优选地，所述重组蛋白诱导表达步骤包括：IPTG浓度为0. 6~1. 2mM/L诱导4~ 1211、温度为37°(：。
[0017] 优选地，IPTG浓度为0· 6mM/L诱导4h。
[0018]优选地，所述步骤三中纯化方法为Ni亲和层析挂柱纯化。
[0019] 上述制备方法中，所述步骤一中的1型鸭甲肝病毒株为1型鸭甲肝病毒Η株，小 RNA病毒科（Picornaviridae)，禽肝病毒属（Avihepatovirus)，学名为1型鸭甲肝病毒 (DuckHepatitisAVirustype1，DHAV-1)，所述1型鸭甲肝病毒Η株保藏于中国典型培 养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO.V201539。
[0020] 一种用于检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，包括ELISA板、PBST缓冲液、 封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的1型鸭 甲肝病毒VP4重组蛋白。
[0021] 所述的封闭液为含1 %脱脂奶粉的PBS缓冲液；所述的酶标二抗为HRP标记的兔 或羊抗鸭IgG稀释液。
[0022] -种制备上述ELISA试剂盒的方法，包括以下步骤：
[0023] 步骤一：包被：1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白包被ELISA板，所述VP4重组蛋白的 最佳包被浓度为3. 375μg/ml，100μL/孔，37°C孵育3h后转入4°C过夜，次日PBST缓冲液 洗板3~5次，每次3min，拍干；
[0024] 步骤二：封闭：加入含1 %脱脂奶粉150 μ L/孔于37°C封闭lh，按照步骤一的方法 洗板，拍干；
[0025] 步骤三：待检血清孵育：加入1:160稀释待检血清，于37°C孵育lh，按照步骤一洗 板，拍干；
[0026] 步骤四：酶标二抗孵育：加入工作浓度的HRP标记的兔或羊抗鸭IgG稀释液，酶标 二抗稀释度为1:1600,37°C孵育0. 5h，按照步骤一洗板，拍干。
[0027] 步骤五：显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光显色30min;
[0028] 步骤六：终止：加入终止液2mol/LH2S04, 50μ L/孔；
[0029] 步骤七：读数：用酶标仪以双波长形式读取0D45Qnni-0D63Qnni值。
[0030] 本发明的有益效果包括：本发明提供一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试 剂盒及其制备方法，成功构建了pET32c(+) -VP4重组原核表达质粒，成功获得VP4重组蛋白 可溶性表达，并且与兔抗DHAV血清具有良好的反应原性，说明病毒DHAV-1VP4蛋白成功获 得了原核表达。对DHAV-1的VP4进行原核表达获得重组蛋白，并以表达的重组蛋白建立了 检测DHAV-1抗体的间接ELISA检测方法，建立了检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂 盒，建立的ELISA方法具有良好的特异性、重复性及灵敏度，