系列广谱抗菌肽的制备、纯化、鉴定及其用图
【技术领域】
[0001]本发明为一种短短芽孢杆菌X23外泌新型非核糖体抗菌肽Edeine家族同系物及其发酵制备，属于生物医药领域，本发明涉及新型非核糖体抗菌肽的微生物发酵、纯化、鉴定及其应用。
【背景技术】
[0002]短短芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个种，菌体呈短杆状，细胞壁厚，广泛分布于自然界。该菌在生长过程中可以向外界分泌种类丰富、数量可观的蛋白质和非核糖体肽(non-ribosomal peptide, NRPs)等次生代谢产物。
[0003]NRPs 由非核糖体狀合成酶(non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs)催化合成。NRPSs是由多个酶按模块化(module)组成的大的复合体，每个酶含一个或多个模块，每个模块激活一个特定的氨基酸并将其整合到新生的肽链中(Griinewald and Marahiel,
2006)。典型的模块由腺苷酰化结构域(A结构域)、巯基化结构域(T结构域)和缩合结构域(C结构域)等三个核心结构域组成，模块的数量、排列顺序和方向与其产物的氨基酸数量、排列顺序和方向之间存在严格的共线性关系，如短杆菌酪肽(tyrocidine)等。此后还发现了另外 2 种合成 NRPs 的方式:iterative NRPSs 和 nonlinear NRPSs。IterativeNRPSs是指同一个模块或结构域在肽链合成过程中不止一次地往新生肽链上重复激活和添加某个氨基酸，导致肽链由多个小的重复序列组成；Nonlinear NRPSs方式合成的肽链顺序与其合成酶的模块之间并不存在严格的共线性关系(Mootz et al.，2002)。在NRPSs的最后一个模块的C-末端通常有起终止延伸和释放产物功能的硫酯(th1esterase, TE)结构域。除了上述核心结构域，在同一个模块内可能还存在一些附加的结构域，如差向异构结构域(E结构域)和甲基化结构域(M结构域)等，它们在肽链合成过程中对氨基酸底物进行修饰；乙酰化、糖基化和脂质化等结构域则对肽链骨架进行修饰。如果不具有这些结构域，修饰作用则由独立于NRPSs的酶催化完成(Schwarzer et al., 2003; Griinewald andMarahiel, 2006)。
[0004]NRPs在医药、农业和生物学等领域具有极大的研究价值和应用潜力，除了可以杀死或抑制病原菌，NRPs还被广泛用于抗肿瘤和抑制免疫反应等(Copping and Duke,
2007)。目前临床应用最多的10种抗生素类产品中有8种为NRPs(Saleem et al.，2010)，在抗感染和抗肿瘤等领域的市场份额分别达到了 68.3%和79.8%(Cragg et al.，2009)。NRPs也可以抑制或杀死作物病原微生物，在农业领域也具有良好的应用潜力。因此，NRPs的分离、鉴定和应用是当前天然产物研究的热点之一，预示该非核糖体抗菌肽在治疗和预防癌症和抗病毒方面具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明涉及非核糖体抗菌肽Edeine家族的制备、纯化、鉴定及其应用。
[0006]短短芽孢杆菌X23是一种能分泌对多种病原微生物具有抑制杀伤作用的非核糖体抗菌肽的根际微生物。这些非核糖体抗菌肽具有热稳定性高、耐受蛋白酶水解的能力强和不易诱导靶标微生物产生选择性抗性等特点。由于此类抗菌肽通常以多种结构类似物的形式共同存在于其发酵液中，并且有环状结构和非编码氨基酸。
[0007]X23发酵液的制备
将冷冻保存的短短芽孢杆菌X2 3菌种接种于装有NB或LB培养基的三角瓶中，25°C -30°C过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液。将该种子液接种于新鲜的液体培养基，得到X23的发酵液；X23发酵液经高速离心后，取上清液经微孔滤膜过滤，彻底去除菌体，得到无菌发酵液，减少了后续处理中因残留菌体破裂、胞内蛋白质和小分子物质对非核糖体抗菌肽分离纯化的干扰。
[0008]X23非核糖体抗菌肽粗制备液
取上一步骤制备的X23无菌发酵液，浓缩后用等体积氯仿抽提，高速离心后收集上层水相；再经80°C水浴后高速离心，弃沉淀，上清液即为X23非核糖体抗菌肽的粗制备液。其有益效果是为了简化样品组成。
[0009]X23非核糖体抗菌肽的富集
为了进一步简化样品组成，并富集非核糖体抗菌肽，将粗制备液经弱阳离子交换树脂处理。其有益效果是样品被大大简化，同时也为工业化生产工艺的研发奠定了基础。
[0010]X23非核糖体抗菌肽的高效制备液相色谱分离
将非核糖体抗菌肽粗品进一步利用硅胶基质C8或C18作为反相固定相，采用高压制备液相色谱对目标峰进行制备，得到高纯度Edeine家族同系物。
[0011]X23非核糖体抗菌肽的质谱、核磁鉴定
将高纯度的非核糖体Edeine家族同系物进行高分辨质谱和全二维核磁共振测试，经过谱图解析，确定系列同系物分别为Edeine A> Edeine B> Edeine D> Edeine F。
[0012]Edeine系列非核糖体抗菌肽应用
系列非核糖体抗菌肽同时对真菌和细菌有杀灭作用，包括烟草青枯病菌、大肠杆菌、大白菜软腐病菌、水稻白叶枯病菌和金黄色葡萄球菌、马铃薯晚疫病菌、烟草黑胫病菌和水稻稻瘟病菌等。
【具体实施方式】
[0013]实施方式一:
将-80°C保存的短短芽孢杆菌X23菌种接种于装有NB液体培养基的三角瓶中，30°C、200 rpm过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液。将该种子液以体积比15%接种于新鲜的NB液体培养基，30°C、250rpm培养36h，得到X23的发酵液；X23发酵液经8000 rpm离心，取上清液经孔径为0.22 μ m的过滤器过滤，得到无菌发酵液；取①制备的无菌发酵液，冷冻真空干燥浓缩50倍后用氯仿抽提，11000 rpm离心10 min后收集上层水相，经80°C水浴lOmin后llOOOrpm离心lOmin，水相即为X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液；采用弱阳离子交换树脂富集非核糖体抗菌肽，5%NaOH溶液活化柱系统，将非核糖体抗菌肽粗制备液过柱，收集抗菌肽所在洗脱部分，富集得到含量为50%左右的非核糖体抗菌肽；洗脱液经冷冻真空干燥后用ddH20溶解，采用十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈-0.2%甲酸水为流动相，检测波长为254 nm，梯度洗脱，收集主峰，进一步将非核糖体抗菌肽的纯度提高到98%。取适量样品进行UPLC-QTOF精确分子量测定和核磁测试并综合分析，确认该非核糖体抗菌肽为Edeine家族同系物。
[0014]实施方式二:
将-80°C保存的短短芽孢杆菌X23菌种接种于装有NB液体培养基的三角瓶中，28°C、200 rpm过夜培养至对数生长期，即为发酵培养的种子液。将该种子液以体积比10%接种于新鲜的NB液体培养基，28°C、200rpm培养32h，得到X23的发酵液；X23发酵液经7，600rpm离心，取上清液经孔径为0.22 μ m的过滤器过滤，得到无菌发酵液；取①制备的无菌发酵液，冷冻真空干燥浓缩100倍后用氯仿抽提，11000 rpm离心10 min后收集上层水相，经70°C水浴lOmin后llOOOrpm离心lOmin，水相即为X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液；采用强阳离子交换树脂富集非核糖体抗菌肽，5%NaOH溶液活化柱系统，将非核糖体抗菌肽粗制备液过柱，富集得到含量为50%左右的非核糖体抗菌肽；洗脱液经冷冻真空干燥后用ddH20溶解，采用辛烷基键合硅胶为填充剂，甲醇-0.2%甲酸水为流动相，检测波长为254 nm,梯度洗脱，收集主峰，进一步将非核糖体抗菌肽的纯度提高到98%。取适量样品进行UPLC-QT0F精确分子量测定和核磁测试并综合分析，确认该非核糖体抗菌肽为Edeine家族同系物。
【主权项】
1.一系列由短短芽孢杆菌X23菌株{Brevibacillus brevis X23)合成并分泌的非核糖体抗菌肽，是非核糖体抗菌肽Edeine家族的同系物，其特征在于具有如下的氨基酸序列:(S)- Phe-(S)- Les-(S)-A2pr-(2R, 6S, 7R)-A2ha-Gly-Gsper> (S)- Tyr-(S)-Les-(S)-A2pr-(2R, 6S, 7R)-A2ha_Gly-Gsper、(S)_ Phe-(S)- Les-(S) -A2pr-(2R, 6S,7R)-A2ha-Gly-Sper、(S) - Tyr- (S) - Les-(S)-A2pr-(2R, 6S, 7R) -A2ha-Gly-Sper02.权利要求书1所述非核糖体抗菌肽Edeine家族的制备、纯化、鉴定方法，其特征在于，包括: 步骤一:将冷冻保存的短短芽孢杆菌X23菌种接种于装有培养基的三角瓶中，培养即得发酵培养的种子液，再将该种子液接种于新鲜的液体培养基，得到X23的发酵液； 步骤二:去除X23发酵液中菌体等固体杂质，得到无菌发酵液； 步骤三:将无菌发酵浓缩后经有机溶剂抽提，收集水相，高温处理后去除沉淀，得X23外泌非核糖体抗菌肽粗制备液； 步骤四:采用树脂富集粗制备液中的非核糖体抗菌肽，吸附后洗脱去除非活性组分，得到非核糖体抗菌肽粗品； 步骤五:采用高效制备液相色谱对步骤四所述粗品进一步纯化； 将粗品溶解后，采用疏水反相分离材料为固定相，有机溶剂和水为流动相，收集活性肽洗脱液，进一步将非核糖体抗菌肽的纯度提高到>95% ； 步骤六:采用高分辨质谱测定精确分子量，并结合核磁共振数据，确认系列非核糖体抗菌肽为 Edeine 家族同系物 Edeine A、Edeine B、Edeine D、Edeine F。3.根据权利要求书1中步骤一所述，其特征在于采用PDA、ΝΒ、ΝΑ或LB作为培养基，20°C —35°C,100-350rpm培养过夜，将该种子液以体积比5%_20%接种于新鲜的NB液体培养基，培养24h-48h，得X23发酵液；更优选的条件是采用NB或LB作为培养基，25°C —30°C，180-250rpm培养过夜，将该种子液以体积比8%-15%接种于新鲜的NB液体培养基，培养30h-40h。4.根据权利要求书1中步骤二所述，其特征在于采用高速离心或微滤膜过滤等方式去除固体杂质。5.根据权利要求书1中步骤三所述，其特征在于所述有机溶剂为石油醚、正己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的一种或几种，更优选的是氯仿。6.根据权利要求书1中步骤四所述，其特征在于所选用的树脂为阳离子交换树脂，包括强阳离子交换树脂和弱阳离子交换树脂，更优选的为弱阳离子交换树脂；洗脱方法为本领域技术人员所熟知的方法。7.根据权利要求书1中步骤五所述，其特征在于高效液相制备色谱所采用的分离材料为反相材料，包括聚合物基质反相材料和硅胶基质反相材料，更优选硅胶基质键合辛烷基或十八烷基的反相材料；洗脱方法为本领域技术人员所熟知的方法。8.权利要求书1所述非核糖体抗菌肽，其特征在于，包括但不限于对真菌和细菌有杀灭作用，包括烟草青枯病菌、大肠杆菌、大白菜软腐病菌、水稻白叶枯病菌和金黄色葡萄球菌、马铃薯晚疫病菌、烟草黑胫病菌和水稻稻瘟病菌等。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一系列非核糖体抗菌肽的制备、纯化、鉴定及应用。本发明通过对短短芽孢杆菌X23发酵条件的优化、发酵液前处理方法的选择、粗液富集和精制工艺的摸索，分离纯化出了一系列广谱抗菌肽。再通过现代分析化学技术鉴定其分别为Edeine家族同系物。Edeine家族同系物具有抗菌谱广、安全性好、环境友好等优点，可以开发成为一种新型的杀菌制剂，广泛用于植物和动物病原菌的控制，对于减少因病原菌危害具有重要意义。
【IPC分类】C12R1/01, C07K7/06, C12P21/02, A01P3/00, C07K1/18, C07K1/20, A01P1/00
【公开号】CN105330722
【申请号】CN201410402969
【发明人】曾静, 赵志远, 其他发明人请求不公开姓名
【申请人】湖南唯创前沿科技有限公司, 湖南农业大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年8月15日