一种新的柠檬苦素类化合物及其制备方法和治疗前列腺癌的医药用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从黄皮的干燥叶中分离得到的一种具有治疗 前列腺癌作用的柠檬苦素类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 黄皮Clausenalansium(Lour. )Skeels属芸香科黄皮属（Clausena)植物，别名黄 批、黄弹、黄皮子、黄弹子、黄檀子、黄坛子等。黄皮是原产于我国热带以及亚热带地区的一 种特产果树，在我国至少已有1500年的栽培历史。国内主要分布于广东、广西、福建、台湾、 云南、海南等地。在国外，印度、越南、泰国、斯里兰卡、马来西亚等东南亚国家以及美国的佛 罗里达州等地均有栽种。
[0003] 黄皮具有很高的药用价值，黄皮的果、叶、根、种子均能入药。黄皮的果实有行气、 消食、化痰之功效，主治食积胀满，脘腹疼痛，疝痛，痰饮，咳喘。根、叶及种子也可治腹痛、胃 痛、感冒发热等症。20世纪80年代，从黄皮叶片中分离得到黄皮酰胺类化合物，并发现该类 化合物具有较大的药理活性。此后，对黄皮活性成分的分离以及药理作用的研究在医药界 得到广泛的关注。近年来，也有黄皮提取物对一些植物病原菌、农业害虫及杂草具有较高生 物活性的报道。
[0004] 黄皮化学成分结构多样，含有生物碱类、香豆素类、挥发油类、黄酮类等多种化学 成分，黄皮酰胺类化合物是黄皮中具有较强生理活性的一类重要生物碱。黄皮中的肉桂酰 胺类生物碱结构较简单，为苯丙烯酰胺类衍生物。咔唑类生物碱在黄皮中普遍存在。黄皮 含有的挥发油是多种类型成分的混合物，但其大多数属于萜类化合物及其衍生物，少数为 脂肪族和芳香族化合物。黄皮中含有的黄酮是一类重要的天然抗氧化剂生理活性物质，它 具有多种功能，如抗肿瘤作用；对血管的防护作用；较强的抗氧化活性和抗真菌活性等。
[0005] 现代研究表明黄皮具有明显的降血糖、保肝、抗氧化、抗细胞凋亡等多方面的药理 作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种从黄皮的干燥叶中分离得到的一种具有治疗前列腺癌 作用的柠檬苦素类化合物及其制备方法。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0008] 具有下述结构式的化合物（I)，
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将黄皮的干燥叶粉碎， 用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱 和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤（a) 中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱10 个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤（b)中75% 乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、20:1、10:1和1:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤（c)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体 积比为25:1、20:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤⑷中组分 2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱， 收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)。
[0011] 进一步地，步骤（a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0012] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0013] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的 载体。
[0014] 所述的化合物（I)在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
[0015] 所述的药物组合物在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
[0016] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0017] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、 对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0018] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0019] 图1为化合物（I)结构式；
[0020] 图2为化合物（I)理论E⑶值与实验E⑶值比较；
[0021] 图3为不同浓度化合物（I)作用72h后PC3和DU145存活率；
[0022] 图4为10.Omg/L化合物（I)作用不同时间后PC3和DU145存活率。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0024] 实施例1 :化合物（I)分离制备及结构确证
[0025] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0026] 制备方法：（a)黄皮的干燥叶（10kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取（25LX3次）， 合并提取液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和水饱 和的正丁醇（3LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（398g)和正丁醇 萃取物；(b)步骤（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用15%乙醇洗脱8个 柱体积，再用75 %乙醇洗脱10个柱体积，收集75 %乙醇洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱 物浸膏（163g) ;(c)步骤（b)中75 %乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体 积比为85:1 (10个柱体积）、45:1 (9个柱体积）、20:1 (8个柱体积）、10:1 (8个柱体积）和 1:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤（c)中组分3 (49g) 用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为25:1 (8个柱体积）、20:1 (10个柱体 积）和10:1 (5个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤（d)中组分 2 (31g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶0DS-C18分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶 液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I)(44mg)。
[0027] 结构确证：HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z499. 3302,结合核磁特征可得分子式为 C30H4604,不饱和度为 8。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMS0-d6,400MHz) :H-1 (1. 04,ddd，J= 13. 4,12. 2,4· 2)，H-1(L59，m)，H-2(L51，m)，H-2(L56，m)，Η-3(3· 14，dd，J= 11. 2,4· 2)， H-5 (1. 22,m)，H-6 (2. 05,m)，H-6 (1. 88,dddd，J= 17. 8,12. 0, 3. 3, 2. 4)，H-7 (5. 18,dd，J =6. 4, 2. 9)，H-9 (2. 13,m)，H-ll(1. 48,m)，H-ll(1. 48,m)，H-12 (1. 61，m)，H-12 (1. 69,m)， H-15(l. 46,m)，H-15(l. 47,m)，H-16(l. 59,m)，H-16(l. 75,m)，H-17(2. 36,m)，H-18(0. 81， s)，H-19 (0· 77,s)，H-20 (2. 60,ddd，J= 12. 0,9. 0, 5. 8)，H-22 (2. 09,m)，H-22 (2. 29,m)， H-23(4.51，ddd，J= 10. 1，6·l，L8)，H-24(3. 18，d，J= 1.8)，H-26(1. 19，s)，H-27(1.25， s)，H-28(0.91，s)，H-29(0.84,s)，H-30(1.01，s);核磁共振碳谱数据δε(ρρπι，DMS0-d6， 125MHz) :36. 8 (CH2a_C)，27. 2 (CH2, 2-C)，78. 7 (CH，3-C)，38. 6 (C，4-C)，50. 3 (CH，5-C)， 23. 7 (CH2, 6-C)，117. 9 (CH，7-C)，144. 6 (C，8-C)，48. 4 (CH，9-C)，34. 6 (C，10-C)，17. 3 (CH2， 11-C)，30. 8(CH2,12-C)，43. 3(C，13-C)，50. 2(C，14-C)，33. 5(CH2,15-C)，23. 6(CH2,16-C)， 46. 5 (CH，17-C)，23. 1 (CH3, 18-C)，12. 7 (CH3, 19-C)，39. 9 (CH，20-C)，177. 7 (C，21-C)， 29. 2 (CH2, 22-C)，77. 0 (CH，23-C)，75. 6 (CH，24-C)，72. 1 (C，25-C)，26. 1 (CH3, 26-C)， 26. 2 (CH3, 27-C)，27. 2 (CH3, 28-C)，14. 3 (CH3, 29-C)，27. 1 (CH3, 30-C);碳原子标记参见图 1。13CNMR谱显示有30个碳原子，包括七个甲基，八个亚甲基，八个次甲基（两个含氧，一 个烯烃），七个季碳（一个酯羰基碳，一个烯烃碳，一个含氧季碳）。核磁数据表明该化合 物含有3-羟基和21-内酯功能团。HMBC谱中Η3-28(δΗ0. 91)和氏-29(5肌84)与含氧 次甲基碳（SC78. 7,C-3)，以及Η-20 (δΗ2. 60)与酯羰基（δC177. 7,C-21)的相关性验证 了上述推论。红外波谱在1765cm1处出现强的吸收带，证实了γ-内酯环的存在，且排除 6或7元内酯部分的可能性，因为它们的吸收波数比1750cm1低。Η-3(δΗ3. 14,dd，J= 11.2,4. 2Hz)信号的分裂模式表明C-3-OH是β构型。Η-7(δΗ5. 18，dd，J= 6. 4,2. 9Hz)， C-7(δC117. 9)和C-8(δC144. 6)的化学位移表明C-7和C-8之间存在双键。此外，两个 含氧碳信号[δC75. 6 (CH，24-C)和 72. 1 (C，25-C)]和氢质子信号[δH3. 18 (d，J= 1. 8Hz， H-24)]的相关性表明该化合物含有一个24, 25-环氧基团。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY 谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通 过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致（图2)。
[0028] 实施例2 :化合物（I)药理作用试验
[0029] 一、材料和仪器
[0030] 前列腺癌细胞株PC3 (ArCC-CRL-1435)、前列腺癌细胞株DU145 (ATCC-HTB-81)。化 合物（I)自制，HPLC归一化纯度大于98%，用二甲基亚矾（DMS0)配制成浓度为1.0g/L 的储存液备用。CCK-8试剂盒为