一种柠檬苦素类化合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的柠檬苦素类化合物及其制备方法，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的柠檬苦素化合物，可以从两面针的干燥根中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物对缺氧培养条件下人胰腺癌MiaPaCa?2细胞有明显的增殖抑制作用，随着化合物(Ⅰ)浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用愈明显，即在一定浓度范围内存在时间——剂量依赖性。这可能成为胰腺癌治疗的另一新思路，可以用来开发成治疗胰腺癌的药物。
【专利说明】
一种柠檬苦素类化合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从两面针的干燥根中分离得到的一种柠檬苦 素化合物，含其的药物组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 两面针[Zanthoxylum nitidum(Roxb. )DC.]又名蔓椒、两背针、入地金牛，属芸香 科花椒属植物，传统入药部位为根，是临床常用中药，广泛分布于我国广西、广东、云南、台 湾等南方省份。两面针最早以蔓椒之名记载于《神农本草经》;《全国中草药汇编》记载："两 面针活血，麻醉止痛，主治神经痛、胃、十二指肠溃疡、胃肠绞痛、胆道蛔虫病引起的疼痛、咽 喉肿痛，并用于皮肤粘膜麻醉"。它在中医临床上的应用十分广泛，可治疗风湿麻痹、牙痛、 腰腿痛、跌打损伤肿痛以及咽炎、淋巴结炎等感染性疾病。
[0003] 两面针化学成分方面的研究较为系统，目前从两面针中已分离多种化合物，分属 于生物碱类、木脂素类、香豆素类、脂肪酸类等。生物碱类化合物是两面针中最主要的化学 成分，其药理活性最为显著，具有较强的抗肿瘤活性。
[0004] 氯化两面针碱是两面针中活性生物碱类的主成分，在抗炎、镇痛、心血管系统疾病 以及抗氧化活性等方面具有广泛的药理活性。两面针的提取物具有广泛的药理活性，如镇 痛、消炎、止血作用及对化学性肝损伤的保护作用等;其作为驰名的牙膏品牌而开发的系列 口腔护理产品，则是基于两面针提取液显著的抗菌消炎和止血作用。而两面针在民间用药 的组合方剂中应用也十分广泛，对等常见病症均有显著的疗效，也有报道以两面针为主成 分的组合中药对跌打损伤、关节肿痛、腰椎间盘突出症、痛经、血栓外痔、冻疮、口腔溃疡及 慢性溃疡性结肠炎等病症均有较好的疗效。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从两面针的干燥根中分离得到的一种柠檬苦素化合物， 含其的药物组合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] -种柠檬苦素化合物，具有下述结构式的化合物(I):
[0008] v i
[0009]所述的化合物(I)的制备方法，包含以下操作步骤：
[0010] (a)将两面针的干燥根粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无 醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯 萃取物和正丁醇萃取物；
[0011] (b)步骤（a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再用 75 %乙醇洗脱8个柱体积，收集75 %洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱浓缩物；
[0012] (C)步骤(b)中75 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、30:1、 15:1和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；
[0013] ⑷步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、8:1和5:1的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；
[0014] (e)步骤（d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为 75 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物 (1)〇
[0015] 进一步地，步骤(a)中，用85%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0016]进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0017] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的载 体。
[0018] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0019] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0020] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0022]化合物（I)对缺氧培养条件下人胰腺癌MiaPaCa-2细胞有明显的增殖抑制作用，随 着化合物（I)浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用愈明显，即在一定浓度范围内存在时 间--剂量依赖性。
【附图说明】
[0023] 图1为化合物(I)结构式；
[0024] 图2为化合物（I)计算E⑶和实验E⑶图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0026] 主要材料、试剂来源及仪器类型：
[0027]乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限 公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0028]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0029] (a)将两面针的干燥根(8kg)粉碎，用85%乙醇热回流提取(30LX3次），合并提取 液，浓缩至无醇味（6L)，依次用石油醚(6L X 3次）、乙酸乙酯（6L X 3次）和水饱和的正丁醇 (6LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(375g)和正丁醇萃取物；（b)步骤 (a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙醇洗 脱8个柱体积，收集75 %洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱浓缩物（129g); (c)步骤（b)中 75 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1 (8个柱体积）、30 :1 (8个柱体 积）、15:1(8个柱体积)和8:1(10个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步 骤(c)中组分4(27g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为12:1(8个柱体积）、8:1(10个 柱体积)和5:1(8个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2 (15g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75 %的甲醇水溶液等度洗 脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I) (40mg)。
[0030] 结构确证:册431]\^显示[]\1+他]+为111/2 591.2214，结合核磁特征可得分子式为 C31H36〇1Q，不饱和度为 14。核磁共振氢谱数据δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，400MHz):H-3(4 · 99，s)，H-5 (2.88，t，J = 6.7)，H-6(2.23，dd，J = 6.7)，H-6(2.01，dd，J = 6.7)，H-ll(5.73，dd，J = 4.4， 3.3)，H-12(2.04，dd，J=18.5,4.4)，H-12(2.47，dd，J=18.5,3.3)，H-14(1.73，dd，J = 12.3,6.9)，H-15(2.67，dd，J=18.4,6.9)，H-15(2.98，dd，J=18.4，12.3)，H-17(5.06，s)， H-18(0.95，s)，H-19(1.19，s)，H-21(7.26，br，s)，H-22(6.18，br，s)，H-23(7.33，t，J= 1.7)，H-28(0.81，s)，H-29(0.73，s)，H-30(3.34，s)，H-2，（5.89，dq，J=15.5，1.7)，H-3' (7.09，dq，J=15.5,7.0)，H-4,（1.92，dd，J = 7.0，1.7)，8-OH(3.95，br，s)，7-0CH3(3.61， s);核磁共振碳谱数据3。(？?111，0130-(16，1001抱）：209.4((：，1-〇,78.1((：，2-〇,84.2(〇1，3-C)，38.7(C，4-C)，46.9(CH，5-C)，30.6(CH2,6-C)，172.7(C，7-C)，70.3(C，8-C)，136.5(C，9- C)，50.6(C，10-C)，126.3(CH，11-C)，31.1(CH2，12-C)，34.7(C，13-C)，38.7(CH，14-C)，28.6 (CH2，15-C)，169.0(C，16-C)，81.2(CH，17-C)，22.6(CH3，18-C)，13.9(CH 3，19-C)，121.2(C， 20-C)，140.1(CH，21-C)，108.8(CH，22-C)，143.1(CH，23-C)，19.7(CH 3,28-C)，23.2(CH3,29-C)，63.8(CH，30-C)，164.6(C，1'-C)，120.7(CH，2'-C)，147.5(CH，3'-C)，18.1(CH3,4'-C)， 51.7(CH 3,7-0CH3);碳原子标记参见图1。红外光谱显示该化合物含有羟基和羰基基团 (3438cnf 1和1728cnf1)。4和13C NMR数据的分析表明该化合物为柠檬苦素类化合物，包含四 个叔甲基，一个甲氧基，一个三取代双键，一个三取代的环氧乙烷，一个酮羰基，三个酯羰基 以及一个β-取代呋喃环。HMBC谱中，H3-19(δΗΙ. 19，s)和H-30(δΗ3.34，s)与C-l (SC209.4)的 相关性表明C-1为酮羰基。两个碳信号0〇78.1，2-(：;63.8,3〇-〇以及质子信号0!13.34, 8， H-30)表明该化合物含有一个30，2-环氧基团。此外，C-3 (SC84.8)位上连有一个2-丁烯酸乙 酯。腿8<：谱中，!1-3(4.99,8)，!1-2'（5.89，(^，了=15.5，1.7)和!1-3'（7.09，(^，了=15.5,7.0) 与C-Γ (δ(： 164.6)的相关性验证了上述推论。H-2 '和H-3 '之间的耦合常数(J = 15.5Hz)表明 2_丁烯酸乙酯结构为E构型。HMBC谱中，-OCH3(δΗ3 · 61，s)与C-7(δ(：172 · 7)，H-6(δΗ2 · 23，dd， 了 = 6.7抱；2.〇1，(1(1，1 = 6.7抱）与(：-50〇46.9)和(：-7的相关性表明(：-60〇3〇.6)连有一个甲 氧羰基片段。根据HMBC谱中H-17(5.06，s)与C-20(SC121.2)，C-21(SC14(hl)和022(δ C108.8)的相关性，可推断呋喃环位于C-17位上。ROESY谱中，Η-5与Η 3-29，Η-5与Η-17,以及 Η-υβ与Η-17表明这些质子为β-构型。此外，Η-14与Η3-18的交叉峰表明Me-18和Η-14是α-构 型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和R0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化 合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0031]实施例2:化合物(I)药理作用试验 [0032] -、材料和仪器
[0033]人胰腺癌MiaPaCa-2细胞由天津医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所惠赠。化合物 (I)自制，HPLC归一化纯度大于98% ABS、胰蛋白酶-EDTA消化液购于美国Hyclone公司。PBS 粉购于天津润泰科技发展有限公司。DMEM低糖培养液购于美国Gibco公司。MTT购于美国 Sigam公司。DMS0购于北京化工厂。注射用青霉素钠购于哈药集团制药总厂。注射用硫酸链 霉素购于大连美罗大药厂。
[0034]超净工作台、细胞培养箱(美国Thermo公司），4°C冰箱、-20°C冰箱（山东青岛海尔 公司），-80°C冰箱(FormaScientific)，电热鼓风干燥箱(天津实验仪器厂），光学显微镜（日 本Olympus公司），倒置相差显微镜(德国leica公司），超速低温离心机（日本日立公司），酶 标仪（上海科华生物工程股份有限公司），E-Centrifug e(WealteC)，微量加样器（德国 Eppendorf)，电子恒温水浴锅(余姚市东方电工仪器厂），高压灭菌锅（山东新华医疗器械有 限公司），电子天平(上海天平仪器厂）。
[0035]二、试验方法 [0036] 1、细胞培养：
[0037] (1)常氧培养:将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞放入5 % C02、37 °C、饱和湿度的C02孵箱中 贴壁培养，适时换培养液，细胞贴壁生长融合至80 %~90 %时传代。
[0038] (2)缺氧培养:将人胰腺癌MiaPaCa-2细胞放在5 % C02、94 %N2、1 % 02、37 °C、饱和湿 度的缺氧小室中培养。缺氧小室建立:缺氧装置为可调式培养容器，有一进气孔和一出气 孔。实验时，将缺氧培养的细胞放入可调式培养容器内，由进气孔充入低氧混合气体(5% C02+95 % N2+l % 02)，测得小室内氧气浓度维持在1 %后密闭，移入细胞培养箱中，37 °C培养。 每24h再冲气和换气一次后置37°C培养箱继续培养，分别在24h、48h、72h后收集各组细胞， 用于MTT实验。
[0039] 2、细胞增殖的检测
[0040] (1)收集对数生长期MiaPaCa-2细胞，制备成单细胞悬液进行计数，调整浓度以每 孔5 X 103个细胞接种96孔细胞培养板中，每孔总体积100yL(边缘孔用同体积的无菌ros填 充），于5%C02、37°C、饱和湿度的C02培养箱中培养，待细胞形成单层后弃上清给予不同浓度 化合物（I)处理。
[0041 ] (2)分空白对照组(不加药物处理的等体积培养液)和化合物（I)药物20ymol/L、40 4111〇1/1、8(^111〇1/1)，每组设6个平行孔，实验重复三次，置入37°(：，5%0)2、94%吣、1%0 2的缺 氧小室中分别培养24h、48h、72h。
[0042] (3)用PBS轻轻冲洗96孔细胞培养板2次后，每孔加入10yL MTT(5mg/mL)，继续培养 4h后离心弃上清，每孔加入15yL的DMS0,放在摇床上振荡15min，使结晶物充分溶解。
[0043] (4)酶联免疫检测仪于570nm处测量各孔的吸光度值(A值），计算细胞增殖抑制率。
[0044] (5)抑制率（％ )=(空白对照组平均A值-药物组平均A值)/空白对照组平均A值X 100%〇
[0045] (6)以浓度为横轴，抑制率（％ )为纵轴绘制抑制率直方图。
[0046] 3、统计学方法
[0047]采用SPSS 17.0进行数据处理，计量资料计量资料符合正态分布的，以均数士标准 差（S±s)表示，均数间比较采用单因素方差分析或t检验，以P〈0.05为差异有统计学意义。 [0048]三、结果及结论
[0049] MTT结果显示：（1)化合物（I)干预人胰腺癌MiaPaCa-2细胞同等时间（24h、48h、 72h)时，随着化合物（I)浓度(在实验浓度范围间内）的增加，其所对应的0D值越小，表明在 缺氧条件下化合物（I)对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞干预时间相同时，随着药物浓度的增加， 细胞存活率降低。结果见表1 (注:aP〈〇.01VS对照组;bP〈0.01VS 20ymol/L组;。P〈0.01VS 40μ mol/L组）。
[0050] (2)不同浓度的（20ym〇l/L、40ym〇l/L、80ym 〇l/L)化合物（I)干预人胰腺癌 MiaPaCa-2细胞48h后，不同浓度作用下细胞增殖抑制率分别为（20.13 ± 0.80) %、（ 34.83 土 0.66) %、（45.68± 1.45) %，抑制率随药物浓度增加呈上升趋势，组间差异有统计学意义(P 〈0·05) JOymol/L的化合物（I)干预胰腺癌MiaPaCa-2细胞24h、48h、72h后，MiaPaCa-2细胞 生长抑制率分别为（38.78±0.92)%、（45.68±1.45)%、（55.95±2.20)%，呈时间依赖性 增高，组间差异有统计学意义(P〈〇.〇5)。结果见表2(注: aP〈0.01VS对照组;bP〈0.01VS 20μ mol/lig^PW.OlVS 40ymol/L组）。
[00511结论，化合物（I)对缺氧培养条件下人胰腺癌MiaPaCa-2细胞有明显的增殖抑制作 用，随着化合物（I)浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用愈明显，即在一定浓度范围内 存在时间一一剂量依赖性。这可能成为胰腺癌治疗的另一新思路。
[0052 ] 表1化合物（I)对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞生长的影响(η = 6，X土s)
[0053]
[0054] 表2化合物（I)对人胰腺癌MiaPaCa-2细胞生长抑制率的影响(η = 6，i士 s)
[0055]
[0056」 实施例3
[0057] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0058] 实施例4
[0059] 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口 服液。
[0060] 实施例5
[0061] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0062] 实施例6
[0063] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0064] 实施例7
[0065] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0066] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种柠檬苦素化合物，其特征在于，具有下述结构式的化合物（I)， I 1 )〇2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤： (a) 将两面针的干燥根粉碎，用80~90%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味， 依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物； (b) 步骤(a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用5%乙醇洗脱6个柱体积，再用75%乙 醇洗脱8个柱体积，收集75 %洗脱液，减压浓缩得75 %乙醇洗脱浓缩物； (c) 步骤(b)中75 %乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为65:1、30:1、15:1 和8:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分； (d) 步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、8:1和5:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分； (e) 步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的 甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用85%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61P35/00GK106008549SQ201610392328
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】朱正直
【申请人】朱正直