去甲斑蝥素单酯盐衍生物及其抗肿瘤应用
【专利摘要】本发明提供了一种去甲斑蝥素单酯盐衍生物，其结构式如式4所示，其中，R选自C1-C3的烷基或苄基；M选自正一价或正二价阳离子。活性测试证明，本发明设计并合成得到的去甲斑蝥素单酯盐衍生物4对于肝癌、胃癌、结肠癌及结肠癌四种肿瘤具有良好的抑制活性，可望应用于制备上述四种抗肿瘤药物。
【专利说明】
去甲斑蝥素单酯盐衍生物及其抗肿瘤应用
技术领域
[0001] 本发明属于新药设计与合成领域，具体涉及一类新型去甲斑蝥素单酯盐衍生物及 其抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002] 斑蝥，也写作斑蟊，俗称班苗、西班牙苍蝇等，在我国现存最早的中药学专著《本草 纲目》、《神农本草经》等中都曾有记载。斑蝥是芫菁科昆虫南方大斑蟊或黄黑小斑蟊的干燥 体，属鞘翅目芫菁科昆虫，是我国最早发现的具有抗癌作用的药材之一。斑蝥性辛，热，具有 很强的肾毒性，同时具有破血逐瘀、去除淤积，消肿以及攻毒蚀疮的功效，临床常用于恶疮， 顽癣，狂犬病及癌症肿痛等的治疗。
[0003] 而后的研究表明，斑蝥的体内含有一种倍半萜类衍生物，称之为斑蝥素 (cantharidin，Ci〇Hi2〇4)，具有较高的抗癌活性，具有非常高的药用价值。斑蜜素为无色结 晶，不溶于冷水，微溶于热水，溶于丙酮和氯仿。斑蝥素主要存在于多种昆虫中，能使人体皮 肤起疱，斑蝥素及其衍生物抗肿瘤的机制主要是抑制蛋白质与酸的合成，增强机体对肿瘤 细胞的杀伤力而达到治疗目的。斑蝥素及其类似物对肝癌，卵巢癌，食道癌等有良好的疗 效，它是通过改变蛋白质的活性，抗肿瘤侵袭转移，引起细胞周期阻滞，抑制肿瘤生长，从而 使得其死亡。其抗肿瘤的机制为通过减少癌细胞对氨基酸的摄取，抑制蛋白质的合成，刺激 淋巴细胞、巨噬细胞、多形核细胞产生白细胞介素，从而提高机体免疫力，同时杀伤肿瘤细 胞而达到治疗目的，与其他的抗肿瘤药物相比，斑蝥素及其衍生物有许多优点:其在抑制肿 瘤的同时，不仅没有免疫抑制的副作用，还能提升机体白细胞等。
[0004] 但斑蝥素对泌尿系统和肠胃系统有较大的毒副作用，斑蝥素既是抗肿瘤的活性成 分，同时也是毒性的主要成分。对其进行恰当的结构修饰，会在保留其抗肿瘤活性的基础 上，大大减低对机体的毒副作用，以去甲斑蝥素衍生物的合成为例。去甲斑蝥素不但保留了 其较强的抗肿瘤活性和升高白细胞的作用，还消除了其对泌尿系统的副作用，后来，以去甲 斑蝥素为先导化合物进行结构改造成为了研究的热点。这种优势在抗肿瘤药物中还是少见 的，所以引起了广泛的关注，陆续合成了许多减少其毒副作用但同时又保留其活性的同类 药物，开发更新高效低毒的衍生物是一个很好的研究方向。
[0005] 对斑蝥素进行结构修饰后用于治疗癌症的衍生物近年来陆续的出现，并开始运用 于临床治疗。如去甲斑蝥素，它比斑蝥素少了两个甲基，其毒性明显减低，而治疗作用却优 于斑蟊素。
[0006] 目前，斑蝥素和去甲斑蝥素都已经应用在临床中，这两个药物都各具有临床特点， 但不足之处是:这两个药物的水溶性都较差，生物利用度不高。从化学结构中看出，斑蝥素 和去甲斑蝥素的结构中均包含了分子内酸酐结构。而斑蝥酸即斑蝥素化合物的酸酐水解后 得到的二元羧酸化合物;斑蝥酸还未被开发成为药物，仅仅是报道了其结构式。
[0007]
[0008] 此外，临床上处妍％ /斑蝥索钢，去甲斑蝥索钢，甲基斑蝥胺等，这些结构改造均 将斑蝥素及去甲斑蝥素的内酸酐环打开，以开环方式存在，从化学结构上看;对应的开环化 合物其相应的溶解度较大，其体内生物利用度也高。对斑蝥素的结构进行修饰，寻找高效低 毒的斑蝥素抗肿瘤药物，具有重要的工业应用价值和广泛的市场前景。申请号为 21^201410163619.4、21^201410163711.0、21^01410163705.5的中国专利公开了制备去甲基 斑蝥素酸盐的方法，迄今，尚未有报道设计并合成开环的去甲斑蝥素单酯盐衍生物结构及 合成方法。
【发明内容】
[0009] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型去甲斑蝥素单酯盐衍生 物、其合成方法及其抗肿瘤应用。
[0010] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0011] -方面，本发明提供了一种新型的去甲斑蝥素单酯盐衍生物，其结构式如式4所 示，
[0012]
[0013] 其中，R选自C1-C3的烷基或苄基等;Μ选自正一价或二价阳离子。
[0014] 本发明的常规技术人员清楚，在羧酸与金属氢氧化物Μ0Η的酸碱成盐反应后，得到 相应羧酸盐的结构中，羧酸酸根离子与金属阳离子的正负电荷需要配平。因此，非常清楚， 当Μ为正一价阳离子及正二价阳离子时，金属氢氧化物的结构分别为Μ0Η或Μ(0Η)2,而当Μ为 正一价阳离子及正二价阳离子时，在本发明的式4所示的去甲斑蝥素单酯盐衍生物结构中， 所述去甲斑蝥素单酯盐衍生物具有以下的相应的结构：
[0015]
[0016] 优选的，结构式如式4所示的去甲斑蝥素单酯盐衍生物，R选自甲基、乙基、丙基或 苄基等，Μ选自钠 Na、钾Κ、镁Mg或钡Ba离子等。
[0017]更优选的，结构式如式4所示的去甲斑蝥素单酯盐衍生物，包括但不限于，以下结 构式：
[0018]
[0019]另一方面，本发明提供了如上所述的去甲斑蝥素单酯盐衍生物4的合成方法，包括 以下步骤:去甲斑蝥素单酯单酸3与相应的金属氢氧化物[Μ0Η或Μ(0Η)2]反应得到;合成路 线为：
[0020；
[0021 ]上述合成路线中，式3所示化合物结构中相应R基团的选取，以及金属氢氧化物Μ0Η 中的Μ选取与上述相同式4相应的基团选取一致。
[0022] 优选的，上述本发明提供的新型去甲斑蝥素单酯盐衍生物中，其结构式中，R选自 甲基或乙基。
[0023] 优选的，上述本发明提供的新型去甲斑蝥素单酯盐衍生物中，其结构式中，Μ选自Μ 选自钠 Na、钾Κ、镁Mg或钡Ba离子;更优选的，Μ选自Μ选自钠、钾或镁Mg离子。
[0024] 上述合成路线一中，化合物3的制备采用以下的合成方法，包括以下步骤：1)、顺丁 烯二酸酐与呋喃经环合加成反应得到5-烯去甲斑蝥素1，2)、5_烯去甲斑蝥素1在有机溶剂 中在催化剂存在下加氢还原得到去甲斑蝥素2,3)、去甲斑蝥素2与相应的醇(R0H)反应得到 去甲斑蝥素单酸单酯衍生物3;合成路线为：
[0025]
[0026] 上述合成路线二中，所述步骤1)的催化剂选自Pd/C，Pd(0H)2/C，Pt/C或Raney Ni 等氢化催化剂;所述步骤1)的催化剂优选Pd/c或Pd(0H)2/C。
[0027] 上述合成路线二中，所述步骤2)的醇R0H选自选自C1-C3的烷基或苄基;更优选为 甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、苄醇。
[0028]在上述合成路线二中，有机溶剂可以依据反应对温度、溶剂极性的需求，从N，N_二 甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氢呋喃或乙醚中选择。例如，所述步骤2) 的采用的反应溶剂为醚类溶剂、卤代烃或醇类溶剂，例如：乙醚、丙醚、四氢呋喃、二氯甲烷、 氯仿、甲醇或乙醇等。所述步骤3)中采用的反应溶剂可以为相应的醇溶剂或者是卤代烃溶 剂，例如:二氯甲烷、氯仿等。
[0029] 活性测试证明，本发明设计并合成得到的去甲斑蝥素单酯盐衍生物4对肝癌、胃 癌、结肠癌及胰腺癌四种肿瘤细胞具有良好的抑制活性。因此，本发明的第三方面提供了去 甲斑蝥素单酯盐衍生物4用于制备抗肝癌、胃癌、结肠癌及胰腺癌四种肿瘤的药物中的用 途。
[0030] 术语
[0031]本文中的缩写具有以下含义:小时缩写为h，分钟缩写为min;四氢呋喃缩写为THF， N，N-二甲基甲酰胺缩写为DMF、二甲基亚砜缩写为DMS0;在合成实施例中Μ代表mol/L。
【具体实施方式】
[0032]以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。 在不脱离本发明构思的前提下，本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪 器作出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。
[0033]本发明中使用的呋喃，顺丁烯二酸酐，呋喃，四氢呋喃，二氯甲烷等反应试剂及有 机溶剂均来自上海国药集团。除特别说明外，所用试剂均为化学纯。
[0034]合成路线为：
[0035]
[0036] 上述合成路线的各步骤反应，可以用色谱法、液质连用谱来监控反应进程。色谱法 中，可适用薄层色谱TLC还可用气相色谱法或液相色谱法如HPLC代替等。
[0037]实施例1.5-烯去甲斑蝥素1的制备
[0038] 从试剂瓶中取出一定量的顺丁烯二酸酐，置于干燥的研体中研细，再用电子天平 称取研细的顺丁烯二酸酐12.021g，置于干燥的三口烧瓶中，塞上塞子，再加乙醚搅拌，在乙 醚量为90mL时顺丁烯二酸酐完全溶解。待顺丁烯二酸酐完全溶解后，用滴液漏斗缓慢加入 13mL呋喃，用时13min。控制温度在38 °C开始反应。反应lh后溶液出现白色固体，且时间越长 白色固体越多。反应至24h后抽滤，得白色固体的化合物1，即5-烯去甲斑蝥素。干燥称重为 17.46g，收率85.8%。熔点：122~123°C，比移值Rf :0.52(展开剂为石油醚：乙酸乙酯=3: l);lHNMR(CDC13):S:3.18(s，2H)，5.47(s，2H)，6.58(s，2H)。
[0039] 实施例2.去甲斑蝥素2的制备
[0040] 取5-烯去甲斑蝥素1 (1.09g)于施兰克瓶中，加入20ml四氢呋喃使其溶解，加入 llOmg钯碳，真空除去烧瓶中空气后通入氢气，25°C下搅拌使其反应，反应结束后抽滤除去 钯碳，将所得滤液旋蒸，干燥，即得去甲斑蝥素（72.2 % )，白色固体794.311^。1!1匪1?(0150-d6):S:4.85(s，2H)，3.34(d，J = 20Hz，2H)，1.65(d，J = 8Hz，4H)<a3CMffi(DMS0-d6):S: 173·35,80·08,51·14,40·35,40·14,39·93,39·72,27·90。
[0041]实施例3.去甲斑蝥素单酸乙酯(3，R = Et)的合成：
[0042] 取去甲斑蝥素2 672mg于烧瓶中，加入30ml无水乙醇使其溶解，80°C加热回流，4.5 小时后反应完全，旋蒸，以乙酸乙酯为洗脱液过硅胶柱，点板，收集显色的样品旋蒸，干燥， 即得去甲斑蝥素单酸乙酯（87%)，白色固体747.2mg<aHNMR(CDC13)J:4.91(d，J = 24Hz， 2H)，4.11(d，J = 8Hz，2H)，2.99(q，J=12Hz，3H)，1.81(t，J = 4Hz，2H)，1.52(d，J = 8Hz，2H)， 1.21(^ = 8取，3!1)。13(：匪1?(〇)(：13):3:176.45，170.87,78.59,78.29,77.03,76.71， 61.16,52.27,28.97,13.94.
[0043] 实施例4.去甲斑蝥素单酸甲酯(3，R=Me)的合成：
[0044] 称取去甲斑蜜素2 503.6mg(3mmol)，溶于5ml甲醇中，加热到80°C~85°C，冷却回 流，反应3.5h后放置冰箱中冷却12h，析出无色固体，抽滤，得到去甲斑蝥素单酸甲酯产物 145.2mg(0.725mmol)，产率24.2% .lHNMR(DMS0-d6):S:12.22(s，lH)，4.66(s，2H)，3.49(s， 3H),2.98(s,2H),1.50(m,4H).13CNMR(DMS0-d6)：δ：172.72,172.04,78.26,77.93,52.38, 51.63,51.30,28.96,28.89.
[0045] 实施例5.去甲斑蝥素甲酯钠盐的合成
[0046]
[0047] 取去甲斑蜜素单酸甲酯50〇11^(09!11205,2.5〇1111]1〇1)，溶于1〇1111甲醇中，加入氢氧化 钠105mg(2.63mmol)，室温下搅拌反应，反应结束后，减压除去溶剂，以甲醇为洗脱液过硅胶 柱，点板，收集显色样品，旋蒸干燥，得到固体产物343.7g( 1.55mmol)，产率为62.0% . 1HNMR (D20)，：S:4.65(t，J = 8Hz，2H)，3.45(s，3H)，2.85(dd，J=12Hz，8Hz，2H)，1.48(dd，J = 4Hz， 4Hz，4H)·13C匪R(D20):δ:178·66，175·39,79·33,78·25,55·23,52·00,51·75,28·22， 28.00.
[0048]实施例6.去甲斑蝥素甲酯钾盐的合成
[0049]
[0050] 取去甲斑蜜素单酸甲酯500mg(2.50mmol)，溶于10ml甲醇中，加入氢氧化钾147mg (2.61mmol)，室温下搅拌反应，反应结束后，减压除去溶剂，以甲醇为洗脱液过硅胶柱，点 板，收集显色样品，旋蒸干燥，得到固体产物381mg( 1.60mmol)，产率为64.0 %，1HNMR (D20)，：S:4.65(t，J = 8Hz，2H)，3.45(s，3H)，2.85(dd，J=12Hz，8Hz，2H)，1.48(dd，J = 8Hz， 8Hz，4H)·13C匪R(D20):δ:178·52，175·36,79·30,78·27,55·00,52·02,51·74,28·21， 28.02.
[0051 ]实施例7.去甲斑蝥素乙酯钠盐的合成：
[0052]
[0053] 取去甲斑蝥素单酸乙酯525mg于烧瓶中，加入10ml无水乙醇使其溶解，按比例加入 氢氧化钠100.97mg，25°C下搅拌使其反应，反应结束后旋蒸，以无水乙醇为洗脱液过硅胶 柱，点板，收集显色的样品旋蒸，干燥，即得去甲斑蝥素乙酯钠盐(70%)，白色固体654.6mg， Rf = 0.73(展开剂为甲醇），Mp :250 °C，样品编号：LCM-20151015。
[0054] 4匪1?(0)(：13):3:4.82((1，了 = 20抱，2!〇,4.12(9，了 = 8!^，2!〇,2.95((1，了 = 8抱，2!〇， 1.72(d，J = 4Hz，2H)，1.45(d，J = 8Hz，2H)，1.22(t，J = 8Hz，3H)。
[0055] 13C匪R(CDC13) :δ: 176.97,174.59,79.42,78.07,61.03,57.23,55.24,52.03， 28.75.13.98.
[0056] IR(KBr): v(cm-l):3427，1715，1603，1398,1203,1050，905,928,813.
[0057] 同理，合成了以下产物：
[0058] 去甲斑蝥素乙酯钾盐(74.6%)，白色固体，心=0.71(甲醇），1^:250°(：，样品编号： LCMjOlSH^lc/HMfl^CDCh) J:4.77(d，J=16Hz，2H)，4.05(q，J = 8Hz，2H)，2.95(d，J = 8Hz，lH)，2.87(d，J = 8Hz，lH)，1.66(d，J = 8Hz，2H)，1.43(d，J = 8Hz，2H)，1.19(t，J = 8Hz， 3H).
[0059] 13C匪R(CDC13) :δ: 176.63,174.38,79.23,60.88,57.12,55.36,51.94,28.89， 18.37.13.99.
[0060] IR(KBr):v(cm-l):3400，1696，1384，1301，1223，1051，927，833，815·
[0061 ] 去甲斑蝥素乙酯镁盐(81.2%)，白色固体及=0.53(甲醇），1^:103-108°(：，样品 编号：LCM-20151022.
[0062] 4匪1?(0)3〇0):3:4.81((1，了 = 20抱，2!〇,4.10((1，了 = 8抱，2!〇,3.01(8,2!〇，1.66((1， J = 8Hz，2H)，1.23(t，J = 8Hz，3H).
[0063] 13C匪R(CD30D) :δ: 176.10,173.30,79.08,78.40,60.49,54.17,51.63,51.54， 28.40,13.01.
[0064] IR(KBr):v(cm-l):3433，1726，1620，1403，1194，1049，929，812，568 ·
[0065] 去甲斑蝥素乙酯钡盐(71 % )，灰白色固体，Rf = 0.41 (甲醇），Μρ: 197-202°C，样品 编号：1^^-20168.4^1^(0)300):3:4.95(8,210,4.09(9,1 = 8^,210,3.05((1,1 = 81^,210, 2.94(d，J = 8Hz，2H)，l .56-1.69(m，4H)，l .23(t，J = 8Hz，3H).
[0066] 13C匪R(CD30D) :δ: 178·56，175·94,79·69,78·32,61·33,55·65,51·69,28·11， 27.92,13.10.
[0067] IR(KBr): v(cm-l):3414,1713，1581，1399,1043，923,804,718,647.
[0068] 实验例8.去甲斑蝥素单酯盐4的抗肿瘤活性测试 [0069]细胞株和溶剂
[0070] 人肝癌细胞HEPG2，
[0071] 人胃癌细胞BGC803，
[0072] 人结肠癌细胞SW480，
[0073] 人胰腺癌细胞PANK-1，
[0074] 细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640中培养基，
[0075] 溶剂:二甲亚砜(简称为DMS0)。
[0076] CCK-8染色法检测细胞抗肿瘤活性实施方案
[0077] 本试验按照SRB方法，以斑蟊素为阳性对照，DMS0溶剂为空白对照，进行了浓度为 50nnmol/mL的去甲斑蝥素单酯盐衍生物4对肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803、结肠癌细 胞SW480及人胰腺癌细胞PANK-1的四种肿瘤细胞的抑制活性测试。
[0078] 具体测试方案为：选用待测肿瘤活细胞比例达90%以上的细胞进行实验。细胞增 殖抑制试验采用EnoGeneCell? Counting Kit-8(简称为CCK-8)细胞活力检测试剂盒。细胞 消化、计数、制成浓度为1 X 105个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入1 OOyL细胞悬液(每孔1 X104个细胞）；96孔板置于37°C，5%C02培养箱中培养24小时；每孔加入100yL相应的含药 物的培养基，作用浓度为50yMol/L(g卩：微摩尔/升），同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳 性对照组（阳性对照分别选用斑蝥素和喜树碱），每组5复孔;96孔板置于37°C，5%⑶2培养 箱中培养72小时后;每孔加入10yL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪 测定在450nm处的吸光值（简称0D值），计算各个化合物对人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞 BGC803、结肠癌细胞SW480及人胰腺癌细胞PANK-1肿瘤细胞的抑制率。
[0079]
[0080]实验结果详见表1。
[0081] 表1、去甲斑蝥素单酯盐衍生物4对于四种肿瘤细胞的抑制活性
[0082]
[0083]由表1可知，在50nmol/L的相当低的作用浓度下，本发明合成得到的去甲斑蝥素单 酯盐衍生物4对人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞BGC803、结肠癌细胞SW480及人胰腺癌细胞 PANK-1四种肿瘤细胞具有一定的抑制效果，可将其用于制备抗肝癌、胃癌、结肠癌及胰腺癌 四种肿瘤的抗肿瘤候选药物。
【主权项】
1. 一种去甲斑蝥素单酯盐衍生物，其结构式如式4所示，其中，R选自C1-C3的烷基或苄基;M选自正一价或正二价阳离子；当M分别选自正一价或 正二价阳离子，所述的去甲斑蝥素单酯盐衍生物实质上具备以下的结构，2. 如权利要求1所述的式4所示的去甲斑蝥素单酯盐衍生物，其特征在于，R选自甲基、 乙基、丙基或苄基，M选自钠 Na、钾K、镁Mg或钡Ba离子。3. 如权利要求2所述的式4所示的去甲斑蝥素单酯盐衍生物，其特征在于，R选自甲基、 乙基或苄基等，M选自钠 Na、钾K、镁Mg或钡Ba离子。4. 权利要求1所述的去甲斑蝥素单酯盐衍生物4的合成方法，包括以下步骤:去甲斑蝥 素单酯单酸3与相应的金属氢氧化物[MOH或M(OH) 2]反应得到;反应式为：上述合成路线中，式3所示化合物结构中相应R基团的选取，以及金属氢氧化物MOH中的 M选取与上述相同式4相应的基团选取一致。5. 权利要求1-3任意一项所述的去甲斑蝥素单酯盐衍生物4用于制备抗肝癌、胃癌、结 肠癌及结肠癌四种抗肿瘤药物的用途。
【文档编号】C07D493/08GK106008546SQ201610455313
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】赵长阔, 王先恒, 贾佳, 罗灿敏
【申请人】遵义医学院