专利名称：：一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素壳聚糖衍生物及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
，涉及一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)壳聚糖衍生物及其制备方法。
背景技术：
：甲壳素存在于甲壳类生物的外壳，据估计地球上每年由生物产生的甲壳素约有100亿吨。甲壳素以其稳定性、韧性、金属离子络合性、黏度可调节性、生物可降解性、生物安全性等特点而闻名。壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰基产物，是自然界中唯一存在的碱性多糖。壳聚糖的分子量从几百到上百万道尔顿不等，脱乙酰化度为70-90%，并且分子量越小，脱乙酰度越高，在水中溶解性越好。壳聚糖中存在大量游离的氨基，使其成为自然界中为数不多的带正电的生物大分子，这一独特的结构赋予它独特的生物活性，使其成为一种具有广阔应用前景的生物材料。壳聚糖的分子结构中有许多重复的活性基团，可以进行N-酰化反应、脱乙酰化反应，络合物形成反应，成盐反应，酯化反应，接枝聚合反应等。若把小分子物质接枝在壳聚糖骨架上，可能得到有较强缓控释能力的高分子药物或者避免突释的长效药物。并且，选择特殊的小分子物质对壳聚糖进行修饰，不但可以改变其理化性质，还可以得到药性互补的新型药物。斑鳌素是斑鳌的有效成分，可以抑制细胞蛋白质的合成，影响细胞的生长分化，但因其对泌尿系有强烈剌激作用，限制了其在临床的推广应用。去甲斑蝥素是我国自行研制生产的新型抗肿瘤药物，是中药抗癌活性成分斑蝥素去除1，2位两个甲基合成而得，具有显著的抗癌活性，并且毒副作用较低，也是目前唯一具有升高白细胞作用的抗肿瘤药物。去甲斑蝥素对肝癌，食管鳞癌等细胞株的形态，增殖有破坏或抑制作用，可提高癌细胞呼吸控制率及溶酶体活性，干扰癌细胞分裂，抑制其DNA合成，并且对骨髓细胞无抑制作用。吸收后在肝、肾、脾、肠、癌组织中均有较高药物浓度，24小时内大部分经肾脏排泄，体内积蓄甚少。本发明的目的是克服现有的制备方法的不足，提供一种水溶性，成本低的壳聚糖衍生物及其制备方法。将壳聚糖和斑蝥素、去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)进行酰化反应，生成一种新的水溶性壳聚糖衍生物，具有抗肿瘤的药理活性。
发明内容本发明的目的是克服现有的制备方法的不足，提供一种水溶性壳聚糖衍生物及其制备方法。本发明提供的水溶性壳聚糖衍生物的化学结构式如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中R，R'分别独立的选自于斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，n为0.5-3000(壳聚糖的分子量为179-1，000，000)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中RnR2分别独立的选自于氢、钠、钾、氨、锌、硒、锗。本发明所述的水溶性壳聚糖衍生物的制备方法如下，(以下均以质量分数表示)方法1:将1-5份壳聚糖加入50-200份的纯净水/或稀酸溶液中，加热搅拌至完全溶解，O.1%-1.0%活性炭脱色，再加入催化剂0.1-1.0mL调pH值至中性或者弱碱性，然后加入1-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，20-10(TC下，搅拌反应1-10小时。反应完毕，将混合物溶液超滤除去小分子物质，冻干，也可以加入有机溶剂沉淀，抽虑收集沉淀，沉淀用有机溶剂清洗，离心，干燥，或者将沉淀分散于水中，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物。其中壳聚糖分子量为179-1，000，000，稀酸为冰醋酸或者盐酸，有机溶剂为甲醇或者乙醇，催化剂为吡啶。方法2:将1-5份壳聚糖加入50-200份的纯净水/稀酸溶液中，加热搅拌至完全溶解，O.1%_1.0%活性炭脱色，再加入l-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，20-10(TC下，搅拌反应10-48小时。反应完毕，将混合物溶液超滤除去小分子物质，冻干，也可以加入有机溶剂沉淀，抽虑收集沉淀，沉淀用有机溶剂清洗，离心，干燥，或者将沉定分散于水中，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物。其中壳聚糖分子量为300-1，000，000，稀酸为冰醋酸或者盐酸，有机溶剂为甲醇、乙醇或者丙酮。方法3:将l-5份壳聚糖加入5-20份的稀酸中，加热搅拌至完全溶解，0.1%-1.0%活性炭脱色，再加入5-200份的有机溶剂，然后加入1-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，20-10(TC下，搅拌反应10-48小时。反应完毕，加入碱性溶液调pH至进中性，产生沉淀，过滤收集沉淀，将沉淀分散于纯净水中，用碱性溶液调pH至碱性，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物。其中壳聚糖分子量为10，000-1，000，OOO，稀酸为乳酸或者冰醋酸，有机溶剂为甲醇或者乙醇，碱性溶液为氢氧化钠，氢氧化钾水溶液(l-10X，w/v)，或者氨水。本发明的一种水溶性壳聚糖衍生物的反应方程式如下所示斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)本发明一种水溶性壳聚糖衍生物的制备过程中采用水、稀酸和有机溶剂为反应介质，成本低，易于工业化。图1是壳聚糖(分子量2，000)的IR图谱图2是壳聚糖(分子量3，000)的IR图谱图3是壳聚糖(分子量10，000)的IR图谱图4是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量2，000)的IR图谱图5是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量3，000)的IR图谱图6是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量10，000)的IR图谱图7是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量2，000)的力NMR图谱图8是去甲斑蝥素壳聚糖(分子量2，000)的13CNMR图谱具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明本发明实施例采用的壳聚糖的分子量为179(n=0.5)_1，000，000。实施例1将0.5g氨基葡萄糖(分子量179，n=0.5)溶解于30mL纯净水中，室温搅拌溶解，加入0.15g活性炭40。C水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45ym微孔滤膜。然后加入0.5g去甲斑蝥素，室温磁力搅拌反应10小时。加入丙酮30mL产生沉淀。抽虑收集沉淀，用丙酮清洗3次，45t:烘干。实施例2将O.5g壳聚糖(分子量2，000)溶解于30mL纯净水中，40°C水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40。C水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，O.45ym微孔滤膜。加入0.2mL吡啶调pH值至7，搅拌成均相。然后加入0.5g去甲斑蝥素，室温磁力搅拌反应3小时。将产物分别过0.8iim，0.45iim微孔滤膜，用截留分子量为1，000的超滤膜除去未参加反应小分子物质，冻干。图1为壳聚糖的红外光谱图，3439cm—1为羟基，氨基的0H，NH振动，1634cm—、1524cm—1为壳聚糖与金属离子络合的显著特征峰。图2为去甲斑蝥素壳聚糖的红外光谱图，3426cm—1为羟基，氨基的0H，NH振动，1701cm—1为去甲斑蝥素壳聚糖中羧基的C=0振动，1642cm—1为酰胺键的C=0振动(I谱带)，1551cm—1为酰胺键的NH弯曲振动(II谱带)。图7为去甲斑蝥素壳聚糖的力NMR图谱，S4.7002卯m为溶剂重水的特征峰，S4.8096卯m为HpS3.5-4.O卯m为H3_H6。图8为去甲斑蝥素壳聚糖的13CNMR图谱，S182.718卯m为羧酸的羰基碳，S177.240ppm和S177.75卯m为酰胺键的羰基碳，S100.556ppm为C"S79.012ppm为C4，S77.490ppm为C5，S72.844ppm为C3，S60.080ppm为Ce，S58.601卯m为C2，S24.783ppm为乙酰基中的甲基碳，说明壳聚糖没有完全脱乙酰化。S82.119卯m和S70.248卯m为C3'和C6'，S62.691卯m和S57.024卯m为C4'和C5'，S21.749ppm和S17.648ppm为Q，和C2，。红外和核磁都证明了去甲斑蝥素壳聚糖的结构。实施例3将O.5g壳聚糖(分子量3，000)溶解于30mL纯净水中，40°C水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40。C水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45ym微孔滤膜。加入0.3mL吡啶调pH值至8，搅拌成均相。然后加入1.Og去甲斑蝥酸，4(TC磁力搅拌反应3.5小时。将产物分别过0.8iim，0.45iim微孔滤膜，再加入50mL乙醇产生沉淀，抽虑收集沉淀，用乙醇清洗3次，45t:烘干。实施例4将l.Og壳聚糖(分子量5，000)溶解于60mL纯净水中，4(TC水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40。C水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45ym微孔滤膜。加入0.3mL吡啶调pH值至7，搅拌成均相。然后加入0.5g去甲斑蝥素酸钠，5(TC磁力搅拌反应4小时。将产物分别过0.8iim，0.45iim微孔滤膜，再加入60mL乙醇产生沉淀，抽虑收集沉淀，用乙醇清洗3次，45°C烘干。实施例5将0.5g壳聚糖(分子量10，000)溶解于30mL2%(质量分数)的醋酸水溶液中，4(TC水浴加热溶解，加入0.15g活性炭4(TC水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45iim微孔滤膜。加入O.6mL吡啶调pH值至7，搅拌成均相。然后加入0.5g去甲斑蝥素，0.5g斑蝥素，6(TC磁力搅拌反应5小时。将产物分别过0.8iim，0.45iim微孔滤膜，用截留分子量为10，000的超滤膜除去未参加反应小分子物质，冻干。实施例6将1.Og壳聚糖(分子量20，000)溶解于60mL2%(质量分数)的醋酸溶液中，4(TC水浴加热溶解，加入0.15g活性炭4(TC水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45iim微孔滤膜。加入O.8mL吡啶调pH值至9，搅拌成均相。然后加入0.5g去甲斑蝥酸，0.5g斑蝥素，6(TC磁力搅拌反应5小时。将产物分别过0.8iim，0.45iim微孔滤膜，再加入70mL乙醇产生沉淀，抽虑收集沉淀，用乙醇清洗3次，45t:烘干。实施例7将0.5g壳聚糖(分子量50，000)溶解于30mL2%(质量分数)的醋酸溶液中，4(TC水浴加热溶解，加入0.15g活性炭4(TC水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45iim微孔滤膜。加入0.6mL吡啶调pH值至7，搅拌成均相。然后加入1.5g去甲斑蝥素，7(TC磁力搅拌反应6小时。将产物分别过0.8iim，O.45iim微孔滤膜，用截留分子量为50，000的超滤膜除去未参加反应小分子物质，冻干。实施例8称取2g壳聚糖(分子量IOO，OOO)置于反应器，加入2%(质量分数)的醋酸溶液120mL，加热搅拌下溶解形成均相溶液，加入0.15g活性炭4(TC水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8iim，0.45iim微孔滤膜。称取2g去甲斑蝥素，使之溶于5mL丙酮，搅拌下加入反应器，在室温下反应15小时。将产物分别过0.8iim，0.45iim微孔滤膜，再用丙酮提纯，烘干。实施例91.Og壳聚糖(分子量400，000)溶解于4.8%(v/v)乳酸水溶液中(21mL)，加入0.15g活性炭40。C水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45ym微孔滤膜。然后力口入80mL甲醇稀释，混合均匀。再加入3.Og去甲斑蝥素，室温搅拌反应24小时。用5%w/vNaOH水溶液调pH值至5，产生沉淀。过滤收集沉淀，再将沉淀分散于50mL水中，用5%w/vNaOH水溶液调pH值至12，用透析袋(截留分子量12000-14000)透析3天，然后冻干得产物。实施例10将1.0g壳聚糖(分子量3，000)溶于30mL水中，4(TC水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40。C水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45ym微孔滤膜。加入30mL无水乙醇，再加0.5mL吡啶调pH值至6并搅拌成均相；加入1.OgNCTD，室温反应2小时。产物用250mL无水乙醇沉淀、离心、再用无水乙醇清洗3次，然后分散于30mL纯净水中，透析3天，冻干。实施例11称取O.lg壳聚糖(分子量3，000)溶于10mL水中，4(TC水浴加热溶解，加入0.15g活性炭40。C水浴加热脱色30min，抽滤，分别过0.8ym，0.45ym微孔滤膜。加入40mL无水乙醇，再加0.2mL吡啶调pH值至6并搅拌成均相；加入0.2gNCTD，室温搅拌反应2小时。过滤收集沉淀，烘干。实施例12抗肿瘤、升白与注射部位剌激性实验实验组"实施例2"产物，用生理盐水配成所用浓度。阳性对照5-FU(5-氟尿嘧啶)；去甲斑蝥素(NCTD);壳聚糖(分子量2，000)。试验动物和瘤株18-22g昆明小鼠，来源沈阳药科大学实验动物室。肉瘤(S180)由中国医科大学提供。实验方法取70只小鼠，体重1822g，每只小鼠皮下注射S180肉瘤细胞混悬液0.2ml(约2X106个瘤细胞)。动物移植瘤株后，随机分组、编号、称体重，随机均分7组对照组(生理盐水，NS)、实验组高、中、低剂量、阳性对照组，给药途径，尾静脉注射，NS对照组(10m1kg—0、实验高剂量(20mgkg-1)，中剂量(lOmgkg-1)、低剂量(5mgkg-1)和5-FU(20mgkg—1)、NCTD(20mgkg—1)、壳聚糖(分子量2，000)(20mgkg—1)，每天1次，连续10天(注5-FU隔3天给药一次，供给药4次)，末次给药后24h，称动物体重后脱颈椎处死，剥取瘤体组织称重，并计算抑瘤率。结果实验组的抑瘤率分别为60.8%、40.6%、32.9%，阳性对照组(5-FU)的抑瘤率为59.4%。实验组的白细胞数(X109.L-"依次分别为9.82、15.4、15.0;阳性对照组(5-FU)的白细胞数(X109L—0为2.28;生理盐水组的白细胞数(X109L—0为8.36;NCTD组的白细胞数(X109L—0为10.2。即所合成的衍生物具有升白作用。数据见表1。表1、对小鼠S180的抑瘤作用与升白作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>备注实验过程中发现，在第二次给药时，NCTD组小鼠尾部已经有轻微的糜烂，第四次给药时，部分小鼠的尾部已经断裂；余下其它各组的小鼠尾部正常。权利要求一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素壳聚糖衍生物，其特征在于化学结构式如下所示其中R，R’分别独立的选自于斑蝥素和/或去甲斑蝥素，n为0.5-3000，壳聚糖的分子量为179-1,000,000。F2008102290770C0000011.tif2.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于所述的去甲斑蝥素包括去甲斑蝥酸及其盐。3.根据权利要求1所述的壳聚糖衍生物，其特征在于其化学结构分别为其中^&分别独立的选自于氢、钠、钾、氨、锌、硒、锗。4.一种如权利要求1所述的一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于将1-5份壳聚糖加入50-200份的纯净水/或稀酸溶液中，加热搅拌至完全溶解，0.1%-1.0%活性炭脱色，再加入催化剂0.1-1.0mL调pH值至中性或者弱碱性，然后加入1-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素，20-10(TC下，搅拌反应1-10小时，反应完毕，将混合物溶液超滤除去小分子物质，冻干，也可以加入有机溶剂沉淀，抽虑收集沉淀，沉淀用有机溶剂清洗，离心，干燥，或者将沉淀分散于水中，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物；其中壳聚糖分子量为179-1，000，000，稀酸为冰醋酸或者盐酸，有机溶剂为甲醇或者乙醇，催化剂为吡啶；或将1-5份壳聚糖加入50-200份的纯净水/稀酸溶液中，加热搅拌至完全溶解，0.1%_1.0%活性炭脱色，再加入l-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素，20-10(TC下，搅拌反应10-48小时；反应完毕，将混合物溶液超滤除去小分子物质，冻干，也可以加入有机溶剂沉淀，抽虑收集沉淀，沉淀用有机溶剂清洗，离心，干燥，或者将沉定分散于水中，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物；其中壳聚糖分子量为300-1，000，000，稀酸为冰醋酸或者盐酸，有机溶剂为甲醇、乙醇或者丙酮；或将1-5份壳聚糖加入5-20份的稀酸中，加热搅拌至完全溶解，0.1%-1.0%活性炭脱色，再加入5-200份的有机溶剂，然后加入1-15份的斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，20-10(TC下，搅拌反应10-48小时；反应完毕，加入碱性溶液调pH至进中性，产生沉淀，过滤收集沉淀，将沉淀分散于纯净水中，用碱性溶液调pH至碱性，透析1-5天，冻干，得到一种水溶性壳聚糖衍生物；其中壳聚糖分子量为10，000-1，000，000，稀酸为乳酸或者冰醋酸，有机溶剂为甲醇或者乙醇，碱性溶液为氢氧化钠，1_10%的氢氧化钾水溶液(w/v)，或者氨水(以上均以质量份表示)。全文摘要本发明属于医药
技术领域：
，公开了一种水溶性斑蝥素和/或去甲斑蝥素壳聚糖衍生物及其制备方法，它由壳聚糖和斑蝥素或者去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)反应得到。所得到壳聚糖衍生物如下所示，其中R，R’分别独立的选自于斑蝥素和/或去甲斑蝥素(去甲斑蝥酸及其盐)，n为0.5-3000(壳聚糖的分子量为179-1,000,000)。该衍生物的水溶性好，毒副作用小，并且反应产物具有抗肿瘤活性，减轻斑蝥素的血管刺激性，升高白细胞，可以用于肿瘤的治疗。文档编号C07H13/00GK101735335SQ20081022907公开日2010年6月16日申请日期2008年11月26日优先权日2008年11月26日发明者周欣羽,宋阳,张玲,洪维为,邓意辉,邹佳申请人:沈阳药科大学