一种水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有聚集诱导发光特性的水溶性壳聚糖基荧光探针的制备方法。
【背景技术】
[0002]荧光探针是以荧光物质作为指示剂，并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光，通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。当前，荧光探针主要应用于生物、医学和环境监测等领域，所以水溶性荧光探针具有广泛的应用价值。然而传统的荧光探针面临着聚集诱导淬灭(ACQ)效应和细胞毒性两大问题。聚集诱导发光(AIE)荧光分子的发现无疑提供了一种解决上述问题的思路。AIE效应使得荧光探针易于使用，并且AIE体系对细胞没有毒性，不会影响细胞生理学和细胞增殖。壳聚糖(CS)作为一种富含氨基的天然多糖，具有良好的生物相容性和生物活性，无毒且易于生物降解，被广泛应用于生物医学领域。因此，制备一种水溶性壳聚糖基荧光探针分子具有重要的科学意义和良好的应用前景。
[0003]
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针的制备方法。
[0005]本发明制备水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针的方法，包括如下步骤:
O以粘均分子量为I万-100万、脱乙酰度60%-95%的壳聚糖为溶质，以DMSO为溶剂，配置壳聚糖浓度为0.lg/mL的溶液，在50-65°C溶胀24_48h，再向该溶液中加入TPEITC (含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物)，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为1%-20%，反应24-48h，获得溶液A ；
2)向溶液A中加入无水乙醇，无水乙醇与溶液A的体积比为20，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用体积分数为2%的醋酸溶液溶解，过滤得到滤液；
3)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配置透析液，将步骤2)的滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析5-7天，取出后用质量分数为5%的NaOH中和滤液，离心并水洗冻干，获得荧光标记壳聚糖；
4)将步骤3)的荧光标记壳聚糖溶于体积分数为2%的醋酸溶液中，得到荧光标记壳聚糖浓度为10mg/mL的溶液，再向其中加入体积为上述醋酸溶液体积2倍的甲醇，获得溶液B ；配置丁二酸酐的丙酮溶液，并将其滴入溶液B中，使丁二酸酐与荧光标记壳聚糖中氨基的摩尔比为1:1-3:1，搅拌反应l_3h，获得溶液C ;将溶液C装入截留分子量为3500的透析袋中并置于去离子水中透析至溶液C呈中性，取出透析后的溶液C冻干，获得水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。
[0006]本发明通过将四苯基乙烯(TPE)荧光分子标记到壳聚糖链上得到具有AIE特性的TPE-CS，再采用醋酸/甲醇混合溶剂体系进行琥珀酰化改性，从而制得具有聚集诱导发光特性的水溶性荧光探针分子(TPE-N-CS)。本发明的产物TPE-N-CS的分子式如图1所示，其1H核磁共振谱图如图2所示。
[0007]由于壳聚糖的N-酰化反应破坏了分子内和分子间氢键，导致结晶度降低，引入羧基提高了亲水性，因此本发明的产物具有很好的水溶性，且具有聚集诱导发光特性，与传统荧光探针相比，具有灵敏度高，光稳定性好，高浓度时无淬灭，荧光光谱不漂移等优点，成像效果佳。有望应用于细胞示踪、药物代谢检测、环境监测等领域。
[0008]
【附图说明】
[0009]图1是水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针分子结构示意图。
[0010]图2是水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针分子的1H核磁共振谱图。
[0011]
【具体实施方式】
[0012]以下结合附图和具体实例进一步说明本发明。
[0013]实施例1:
1)称取Ig壳聚糖(粘均分子量为I万，脱乙酰度60%)加入到茄形瓶中，加入1mLDMS0，50°C下溶胀24h，然后向茄形瓶中加入TPEITC，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为1%，反应24h，获得溶液A并将其倒入250mL烧杯中；
2)向溶液A中加入200mL无水乙醇，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用40mL体积分数为2%的醋酸溶液溶解，过滤得到滤液；
3)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配置透析液，将滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析5天，取出后用质量分数为5%的NaOH中和滤液，离心并水洗冻干，获得荧光标记壳聚糖TPE-CS ；
4)称取0.5g TPE-CS溶于50mL 2%醋酸溶液中，再加入10mL甲醇稀释，得到溶液B ；称取0.1637g 丁二酸酐溶于5mL丙酮中，配置丁二酸酐的丙酮溶液，并将其滴入溶液B中，使丁二酸酐与荧光标记壳聚糖中氨基的摩尔比为1:1，搅拌反应lh，获得溶液C ;将溶液C装入截留分子量为3500的透析袋中并置于去离子水中透析至中性，取出透析后的溶液C，冻干，获得水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。
[0014]本例制得的TPE-N-CS荧光探针TPE标记率为0.83%，羧化度为45%。
[0015]实施例2:
1)称取Ig壳聚糖(粘均分子量为I万，脱乙酰度60%)加入到茄形瓶中，加入1mLDMS0，55°C下溶胀24h，然后向茄形瓶中加入TPEITC，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为5%，反应24h，获得溶液A并将其倒入250mL烧杯中；
2)向溶液A中加入200mL无水乙醇，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心后，将沉淀用40mL体积分数为2%的醋酸溶液溶解，过滤得到滤液；
3)将四氢呋喃和去离子水以体积比1:1混合配置透析液，将滤液装入截留分子量为3500的透析袋中并置于透析液中透析5天，取出后用质量分数为5%的NaOH中和滤液，离心并水洗冻干，获得荧光标记壳聚糖TPE-CS ； 4)称取0.5g TPE-CS溶于50mL 2%醋酸溶液中，再加入10mL甲醇稀释，得到溶液B ；称取0.1583g 丁二酸酐溶于5mL丙酮中，配置丁二酸酐的丙酮溶液，并将其滴入溶液B中，使丁二酸酐与荧光标记壳聚糖中氨基的摩尔比为1:1，搅拌反应lh，获得溶液C ;将溶液C装入截留分子量为3500的透析袋中并置于去离子水中透析至中性，取出透析后的溶液C，冻干，获得水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针。
[0016]本例制得的TPE-N-CS荧光探针TPE标记率为1.71%，羧化度为46.6%。<