专利名称：一种水溶性甲壳素pH探针及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新的用作酸性细胞器检测的水溶性甲壳素pH探针及其制备方法，属于化学领域。
背景技术：
荧光探针在细胞生物中有着广泛的应用，可以用来检测细胞内的锌离子、单线态氧等。在众多细胞内的研究对象中，质子是最重要的目标之一，因为pH在细胞中起着关键的作用。通常细胞中存在两种pH范围，一种是细胞液中，pH范围为6.8-7.4；另一种是酸性细胞器中，比如溶酶体，pH范围为4.5-6.0，多为病变细胞。目前用在细胞液中的探针已有商品存在，但对用在酸性细胞器中的探针却研究较少，但如能将探针扩展到酸性环境，将对细胞中疾病的诊断有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的能用作酸性细胞器检测的水溶性甲壳素pH探针及其制备方法，该水溶性甲壳素pH探针不仅扩充了现有pH探针的酸度范围，而且其制备方法工艺安全、简单有效、符合环保要求，所制得的荧光探针能很好的保持糖原有的生物活性。
本发明提供的技术方案是该水溶性甲壳素pH探针由脱乙酰度为48-53％的水溶性甲壳素接枝9-蒽醛，通过还原胺化生成，得到的水溶性甲壳素pH探针取代度在0.2％-1.8％之间，其具体方法制备如下(1)于室温将水溶性甲壳素溶于蒸馏水中，制得浓度为5-20mg/mL的壳聚糖衍生物水溶液；(2)在搅拌条件下向制得的水溶性甲壳素水溶液中加入浓度为0.023-0.34mg/mL的9-蒽醛甲醇溶液，搅拌至反应达到平衡，然后加入物质的量是9-蒽醛的物质的量的1～2倍的氰基硼氢化钠作还原剂，继续搅拌至反应完成；(3)所得溶液用0.8-1万的透析袋在去离子水中透析充分，之后产物用有机溶剂环己烷或乙醚萃取，然后冷冻干燥，所得产物即为水溶性甲壳素pH探针。
制备时所用的水溶性甲壳素的脱乙酰度为48-53％。透析前可将反应完的溶液旋转蒸发使其浓缩。
水溶性甲壳素是带有生物活性的壳聚糖衍生物，已经广泛地被作为生物材料应用于生物医学领域，实践证明它具有良好的生物相容性、无毒性和免疫原性。本发明使用水溶性甲壳素作母体，在水溶液中制备pH探针，不仅赋予了探针较好的水溶性，而且与生物活性物质的结合解决了生物相容性的问题。以水溶性甲壳素为母体制备的水溶性pH探针可不需经过相容性修饰直接应用于生物体系。且在中性条件下的水溶液中制备荧光探针，还避免了有机溶剂的毒性作用，适合荧光探针在生物医药领域的应用。而水溶性甲壳素表面的各种活性基团，又可以使这种探针方便的与抗体、DNA等各种生物分子结合，拓宽其应用范围。因此本发明提供的水溶性甲壳素pH探针可适用于细胞识别、生物标记、疾病诊断等领域。从操作过程可知本发明提供的制备方法工艺安全、简单有效、符合环保要求。该方法在常温常压温和条件下制成，可以避免荧光探针合成过程对探针的内部结构的破坏，能合成出更好地保持糖原有的生物活性的荧光探针。
具体实施例方式
实施例1向100mL浓度为10mg/mL的脱乙酰度为48％的水溶性甲壳素溶液中加入100mL浓度为0.023mg/mL的9-蒽醛甲醇溶液，混合物搅拌8h，然后加入1mg氰基硼氢化钠，继续搅拌12h，将反应溶液旋转蒸发，浓缩溶液用0.8-1万的透析袋在去离子水中透淅3-4天，之后产物用乙醚萃取，直到有机相中检测不到9-蒽醛为止。然后溶液冷冻干燥。即得取代度为0.2％水溶性甲壳素pH探针。
实施例2向100mL浓度为10mg/mL的脱乙酰度为53％的水溶性甲壳素溶液中加入100mL浓度为0.057mg/mL的9-蒽醛甲醇溶液，混合物搅拌8h，然后加入2.0mg氰基硼氢化钠，继续搅拌12h，将反应溶液旋转蒸发，浓缩溶液用0.8-1万的透析袋在去离子水中透淅3-4天，之后产物用乙醚萃取，直到有机相中检测不到9-蒽醛为止。然后溶液冷冻干燥。即得取代度为0.45％水溶性甲壳素pH探针。
实施例3向100mL浓度为10mg/mL的脱乙酰度为51％的水溶性甲壳素溶液中加入100mL浓度为0.12mg/mL的9-蒽醛甲醇溶液，混合物搅拌8h，然后加入5mg氰基硼氢化钠，继续搅拌12h，将反应溶液旋转蒸发，浓缩溶液用0.8-1万的透析袋在去离子水中透淅3-4天，之后产物用环己烷萃取，直到有机相中检测不到9-蒽醛为止。然后溶液冷冻干燥。即得取代度为0.8％水溶性甲壳素pH探针。
实施例4向100mL浓度为10mg/mL的脱乙酰度为51％的水溶性甲壳素溶液中加入100mL浓度为0.34mg/mL的9-蒽醛甲醇溶液，混合物搅拌8h，然后加入20mg氰基硼氢化钠，继续搅拌12h，将反应溶液旋转蒸发，浓缩溶液用0.8-1万的透析袋在去离子水中透淅3-4天，之后产物用环己烷萃取，直到有机相中检测不到9-蒽醛为止。然后溶液冷冻干燥。即得取代度为1.8％水溶性甲壳素pH探针。
经检测分析，本发明合成的水溶性甲壳素pH探针，取代度在0.2％-1.8％之间，溶解性随取代度减小而增大，其中取代度为1.8％的产物在水中的溶解度可达5g/L，最大荧光强度80％到20％之间所对应的pH范围为3.5-5.5。
权利要求
1.一种水溶性甲壳素pH探针，其特征在于它由脱乙酰度为48-53％的水溶性甲壳素接枝9-蒽醛，通过还原胺化生成，得到的水溶性甲壳素pH探针取代度在0.2％-1.8％之间，其具体方法制备如下(1)于室温将水溶性甲壳素溶于蒸馏水中，制得浓度为5-20mg/mL的壳聚糖衍生物水溶液；(2)在搅拌条件下向制得的水溶性甲壳素水溶液中加入浓度为0.023-0.34mg/mL的9-蒽醛甲醇溶液，搅拌至反应达到平衡，然后加入物质的量是9-蒽醛的物质的量的1～2倍的氰基硼氢化钠作还原剂，继续搅拌至反应完成；(3)所得溶液用0.8-1万的透析袋在去离子水中透析充分，之后产物用有机溶剂环己烷或乙醚萃取，然后冷冻干燥，所得产物即为水溶性甲壳素pH探针。
2.权利要求1所述的水溶性甲壳素pH探针的制备方法，其特征在于采用步骤如下(1)于室温将水溶性甲壳素溶于蒸馏水中，制得浓度为5-20mg/mL的壳聚糖衍生物水溶液；(2)在搅拌条件下向制得的水溶性甲壳素水溶液中加入浓度为0.023-0.34mg/mL的9-蒽醛甲醇溶液，搅拌至反应达到平衡，然后加入物质的量是9-蒽醛的物质的量的1～2倍的氰基硼氢化钠作还原剂，继续搅拌至反应完成；(3)所得溶液用0.8-1万的透析袋在去离子水中透析充分，之后产物用有机溶剂环己烷或乙醚萃取，然后冷冻干燥，所得产物即为水溶性甲壳素pH探针。
3.根据权利要求2所述的水溶性甲壳素pH探针的制备方法，其特征在于所使用的水溶性甲壳素脱乙酰度为48-53％。
4.根据权利要求2所述的水溶性甲壳素pH探针的制备方法，其特征在于透析前将反应完的溶液旋转蒸发使其浓缩。
全文摘要
本发明公开了一种新的能用作酸性细胞器检测的水溶性甲壳素pH探针及其制备方法。这种pH探针由水溶性甲壳素接枝9－蒽醛，通过还原胺化生成，得到的水溶性甲壳素pH探针取代度在0.2％－1.8％之间，其制备方法是将水溶性甲壳素溶解于蒸馏水中，在室温搅拌条件下加入9－蒽醛，然后加入还原剂，经过透析、萃取除去杂质，冷冻干燥，得到pH敏感的荧光探针。这种在中性水溶液中制备的新型荧光量子点，可避免有机溶剂的毒副作用，该荧光探针适合于生物分子的结合，尤其适合于酸性细胞器检测，在细胞识别、生物标记和疾病诊断等领域有广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/02GK1975419SQ20061012543
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月11日 优先权日2006年12月11日
发明者杜予民, 庞知益, 李艳 申请人:武汉大学