专利名称：纳豆功能活性成分高效连续化生产方法
技术领域：
本发明涉及一种利用超声波和膜分离技术高效连续化生产纳豆中的纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽的方法，属农、林副产品深加工领域。
背景技术：
纳豆是日本传统的大豆发酵食品，是利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对大豆原料进行发酵而成的产品。科学研究表明，纳豆富含多种具有调节人体身体机能的代谢物，如多种酶、抗菌物质吡啶二羧酸、皂角苷、卵磷脂、异黄酮、多种维生素、粘蛋白、氨基酸及矿物质等。纳豆是开发抗衰老、降血脂及预防糖尿病功能食品的绝好原料，也是防治高血脂症、肥胖症、心血管等疾病有待开发的药物因子。在纳豆功能活性成分中，目前最受关注的是纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽。须见洋行教授发现纳豆中含有高浓度的血栓溶解成分——纳豆激酶(Nattokinase)，分子量为27.7KDa，纳豆激酶的溶栓能力优于目前普遍采用的尿激酶(Urokinase)和链激酶(Streptokinase)，可以开发成为新型的血栓溶解剂。纳豆中还含有大量的聚谷氨酸(γ-PGA)，分子量范围为100～600KDa，这是一种性质极其优良的天然高分子材料。γ-PGA具有极佳的高吸水性，生物可降解性，保湿性，无毒性，安全性以及生物化学特性。聚谷氨酸经辐射后，变成纳豆树脂。该树脂具有极强的吸水性，可吸收相当于自重5000倍的水。γ-聚谷氨酸为一种全天然、多功能性、生物可分解性的生物高分子材料，在医药、化学工业、食品工业、环境、农业、林业及其它领域有广泛用途。纳豆肽的分子量小于5KDa，易于吸收，必需氨基酸平衡良好且具有多种生理功能，在食品、化妆品和药学方面有广泛的应用。目前，关于纳豆中纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽生产的专利技术已有相关报道，但也存在一些缺陷。
在已公开的专利技术中，关于纳豆激酶的中国专利比较多，如CN1453356、CN1451745、CN1273274、CN1594560、CN1695734、CN1766096和CN1799627所述，主要有纳豆激酶的生产、微胶囊化和口服液制造的工艺。关于聚谷氨酸生产应用的专利只有一项，如CN1718735所述，利用纳豆芽孢杆菌固体发酵，生理盐水搅拌提取后，过300KDa膜超滤得到聚谷氨酸。关于纳豆肽的专利有纳豆肽营养粉的生产工艺，如CN1545910和CN1545911所述，杀菌后的大豆采用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行多肽化处理，提高纳豆肽含量。以上中国专利技术普遍采用一种或几种技术完成单一产品的生产，存在工艺复杂、操作时间长、原料需求量大、能耗高、收率低、污染严重等问题，而且产品在长时间提取过程中容易变性失活。沉淀剂硫酸铵有腐蚀性，水解后使溶液的pH值降低，于高pH下释放氨，残留于食品中。有机溶剂容易引起蛋白质变性，常需要在低温下进行，而且有机溶剂使用量大，溶剂的使用和回收、储存都比较困难或麻烦。而本专利将超声波高效提取和膜分离技术结合，实现纳豆功能活性成分高效连续化生产，同时得到纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽三种成分，提高了生产效率，降低了生产成本。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的在于提供一种工艺周期短、能耗低、提取效率高并可适于工业化生产的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，该纳豆功能活性成分为纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽三种成分。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于它包括如下步骤1).发酵称取大豆，洗净后以水浸泡，沥干后的大豆高温灭菌，得煮后大豆；煮后大豆冷却后接纳豆菌种，纳豆菌种的接入量为纳豆菌悬液体积/煮后大豆质量＝2～5％，放入培养箱中，35-40℃恒温发酵培养，培养20-24小时；2).粉碎将发酵后的纳豆粉碎，加入粉碎纳豆重量2～10倍的提取液，搅拌混合，得发酵液；3).浸提采用搅拌或/和超声进行浸提；4).离心分离将超声处理后的发酵液冷冻离心，离心后的上清液过0.22～0.45μm过滤器，得到纳豆功能活性成分提取液；5).超滤分离将纳豆功能活性成分提取液进行超滤分离，得到纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽不同组分；6).干燥将超滤后的纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽浓缩液，经过喷雾干燥得到产品。
步骤1)所述的纳豆菌种为大豆发酵菌种(Bacillus subtilis)。
步骤2)所述的提取液为Tris盐酸缓冲液。
步骤2)所述的提取液加入量为粉碎纳豆重量8～10倍。
步骤3)所述的采用搅拌和超声进行浸提，搅拌为1～2h，超声为200～1000W。
步骤3)所述的采用超声进行浸提为将超声波仪器中的变幅杆浸入发酵液中，进行超声波处理，超声波处理时间为5min～40min。超声处理效果较优。超声波处理的参数为超声频率为20KHz～100KHz，超声功率调节为400～800w；超声处理时间较优的范围为20min～30min。变幅杆浸入发酵液中的深度为1～3cm；变幅杆采用的材料可以是钛合金、黄铜、普通铸铁、不锈钢、工具钢、45号钢、20号钢、铝镁合金、硬质合金(WC)等；变幅杆可采用指数形、悬链线形、圆锥形、阶梯形或复合形的纵向振动变幅杆。
步骤4)的发酵液在6000～12000rpm冷冻离心20～30min较优。
步骤5)的超滤分离的操作压力为0.1Mpa～0.8Mpa，采用截留分子量为5KDa和100KDa的聚醚砜复合膜、纤维素膜或纤维素复合膜作为超滤膜。
本发明的主要特点是利用超声波高效提取和膜分离技术连续化生产纳豆功能活性成分。超声波是物质介质中的一种弹性机械波，具有束射特性、吸收特性以及能量传递特性，其频率高于20kHz。超声波由于其具有独特的机械粉碎作用以及在通过液体时可形成空化效应，当其用于浸提时，可以增大物料分子运动频率和速度，提高物料分子的浸出速度和浸出数量。超声波可能导致空泡周围质膜的击穿或可逆的质膜透性改变，高强度的超声波可导致酶失活，而当超声强度适宜时，生物活性保持不变，同时提高了破碎速率和提取率。膜分离技术具有分离过程不发生相变、常温操作、步骤简单、选择性高、能耗低等特点，特别适合热敏性物质如蛋白质、多肽、氨基酸等的分级分离和浓缩。膜分离技术，尤其是超滤技术已经用于蛋白质和蛋白质水解液中酶、多肽及其它大分子有机物的分级分离。超滤对这些组分的分离主要依据筛分原理，根据膜的截留分子量不同进行分离。它有以下特点可以在分子级对蛋白质进行分离而不影响其性质和结构；不需要加热就可以浓缩；无化学变化，典型的物理分离过程使蛋白质保持原有的活性；能耗低、节约能源；容易清洗、可以再生；便于线性放大，易于实现连续化生产。
本发明的有益效果在于1、采用超声波和超滤纯化的物理提取技术应用于纳豆活性成分的制取，提高了提取效率；2、制备工艺较为简便，缩短了工艺周期、降低了能耗及生产成本，可适于工业化规模生产；3、工艺过程设置合理，污染小，并且提取后的纳豆发酵物还能进行再利用，可使纳豆资源得到充分的应用和开发。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1称取大豆20g，以200mL水浸泡24h，沥干后的大豆高温灭菌，得煮后大豆；冷却后，按2％(纳豆菌悬液体积/煮后大豆质量)的接种量接种(纳豆菌种)。放入培养箱中，37℃培养20h。发酵后的纳豆破碎，采用Tris盐酸缓冲液(pH值7.8)进行超声处理(400W，20min)，Tris盐酸缓冲液加入量为粉碎纳豆重量8倍。将发酵液冷冻离心(6000rpm，20min)，离心后的上清液过0.22μm过滤器，得到纳豆功能活性成分提取液，将纳豆功能活性成分提取液进行超滤分离，得到不同分子量的组分。将超滤后的纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽浓缩液，经过喷雾干燥得到产品，得到聚谷氨酸0.30g、纳豆激酶活力为76.74IU/mg和纳豆肽0.55g。
实施例2称取大豆20g，以200mL水浸泡24h，沥干后的大豆高温灭菌，得煮后大豆；冷却后，按2％(纳豆菌悬液体积/煮后大豆质量)的接种量接种(纳豆菌种)。放入培养箱中，37℃培养20h。发酵后的纳豆破碎，采用生理盐水磁力搅拌1h，生理盐水加入量为粉碎纳豆重量9倍。将发酵液冷冻离心(8000rpm，20min)，离心后的上清液过0.45μm过滤器，得到纳豆功能活性成分提取液，将纳豆功能活性成分提取液进行超滤处理，得到不同分子量的组分。将超滤后的纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽浓缩液，经过喷雾干燥得到产品，得到聚谷氨酸0.10g、纳豆激酶活力为83.32IU/mg和纳豆肽0.38g。
实施例3称取大豆20g，以200mL水浸泡24h，沥干后的大豆高温灭菌，得煮后大豆；冷却后，按2％(纳豆菌悬液体积/煮后大豆质量)的接种量接种(纳豆菌种)。放入培养箱中，37℃培养20h。发酵后的纳豆破碎，采用Tris盐酸缓冲液(pH值7.8)进行磁力搅拌1h，Tris盐酸缓冲液加入量为粉碎纳豆重量10倍。将发酵液冷冻离心(6000rpm，20min)，离心后的上清液过0.22μm过滤器，得到纳豆功能活性成分提取液，将纳豆功能活性成分提取液进行超滤处理，得到不同分子量的组分。将超滤后的纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽浓缩液，经过喷雾干燥得到产品，得到聚谷氨酸0.15g、纳豆激酶活力为80.37IU/mg和纳豆肽0.43g。
实施例4纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，它包括如下步骤1).发酵称取大豆，洗净后以水浸泡，沥干后的大豆高温灭菌，得煮后大豆；煮后大豆冷却后接纳豆菌种(为现有菌种)，纳豆菌种的接入量为纳豆菌悬液体积/煮后大豆质量＝3％，放入培养箱中，35℃恒温发酵培养，培养20小时；所述的纳豆菌种为大豆发酵菌种(Bacillus subtilis)。
2).粉碎将发酵后的纳豆粉碎，加入粉碎纳豆重量2倍的提取液，搅拌混合，得发酵液；所述的提取液为Tris盐酸缓冲液。
3).浸提采用搅拌和超声进行浸提；磁力搅拌2h后，将超声波仪器中的变幅杆浸入发酵液中，进行超声波处理，超声为200W，超声波处理时间为40min；变幅杆浸入发酵液中的深度为1～3cm；变幅杆采用的材料可以是钛合金、黄铜、普通铸铁、不锈钢、工具钢、45号钢、20号钢、铝镁合金、硬质合金(WC)等；变幅杆可采用指数形、悬链线形、圆锥形、阶梯形或复合形的纵向振动变幅杆。
4).离心分离将超声处理后的发酵液冷冻离心，发酵液在6000rpm冷冻离心20min，离心后的上清液过0.3μm过滤器，得到纳豆功能活性成分提取液；5).超滤分离将纳豆功能活性成分提取液进行超滤分离，得到纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽不同组分；步骤5)的超滤分离的操作压力为0.1Mpa，采用截留分子量为5KDa和100KDa的聚醚砜复合膜、纤维素膜或纤维素复合膜作为超滤膜。
6).干燥将超滤后的纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽浓缩液，经过喷雾干燥得到产品。
实施例5纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，它包括如下步骤1).发酵称取大豆，洗净后以水浸泡，沥干后的大豆高温灭菌，得煮后大豆；煮后大豆冷却后接纳豆菌种(为现有菌种)，纳豆菌种的接入量为纳豆菌悬液体积/煮后大豆质量＝5％，放入培养箱中，40℃恒温发酵培养，培养24小时；所述的纳豆菌种为大豆发酵菌种(Bacillus subtilis)。
2).粉碎将发酵后的纳豆粉碎，加入粉碎纳豆重量10倍的提取液，搅拌混合，得发酵液；所述的提取液为Tris盐酸缓冲液。
3).浸提采用搅拌和超声进行浸提；磁力搅拌2h后，将超声波仪器中的变幅杆浸入发酵液中，进行超声波处理，超声为1000W，超声波处理时间为5min；变幅杆浸入发酵液中的深度为1～3cm；变幅杆采用的材料可以是钛合金、黄铜、普通铸铁、不锈钢、工具钢、45号钢、20号钢、铝镁合金、硬质合金(WC)等；变幅杆可采用指数形、悬链线形、圆锥形、阶梯形或复合形的纵向振动变幅杆。
4).离心分离将超声处理后的发酵液冷冻离心，发酵液在12000rpm冷冻离心30min；离心后的上清液过0.45μm过滤器，得到纳豆功能活性成分提取液；
5).超滤分离将纳豆功能活性成分提取液进行超滤分离，得到纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽不同组分；步骤5)的超滤分离的操作压力为0.8Mpa，采用截留分子量为5KDa和100KDa的聚醚砜复合膜、纤维素膜或纤维素复合膜作为超滤膜。
6).干燥将超滤后的纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽浓缩液，经过喷雾干燥得到产品。
权利要求
1.纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于它包括如下步骤1).发酵称取大豆，洗净后以水浸泡，沥干后的大豆高温灭菌，得煮后大豆；煮后大豆冷却后接纳豆菌种，纳豆菌种的接入量为纳豆菌悬液体积/煮后大豆质量＝2～5％，放入培养箱中，35-40℃恒温发酵培养，培养20-24小时；2).粉碎将发酵后的纳豆粉碎，加入粉碎纳豆重量2～10倍的提取液，搅拌混合，得发酵液；3).浸提采用搅拌或/和超声进行浸提；4).离心分离将超声处理后的发酵液冷冻离心，离心后的上清液过0.22～0.45μm过滤器，得到纳豆功能活性成分提取液；5).超滤分离将纳豆功能活性成分提取液进行超滤分离，得到纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽；6).干燥将超滤后的纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽浓缩液，经过喷雾干燥得到产品。
2.根据权利要求1所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于步骤1)所述的纳豆菌种为大豆发酵菌种(Bacillus subtilis)。
3.根据权利要求1所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于步骤2)所述的提取液为Tris盐酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于步骤2)所述的提取液加入量为粉碎纳豆重量8～10倍。
5.根据权利要求1所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于步骤3)所述的采用搅拌和超声进行浸提，搅拌为1～2h，超声为200～1000W。
6.根据权利要求1所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于步骤3)所述的采用超声进行浸提为将超声波仪器中的变幅杆浸入发酵液中，进行超声波处理，超声波处理时间为5min～40min。
7.根据权利要求6所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于所述的超声波处理的参数为超声频率为20KHz～100KHz，超声功率调节为400～800w；超声处理时间的范围为20min～30min。
8.根据权利要求6所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于所述的变幅杆浸入发酵液中的深度为1～3cm；变幅杆采用的材料是钛合金、黄铜、普通铸铁、不锈钢、工具钢、45号钢、20号钢、铝镁合金、硬质合金；变幅杆采用指数形、悬链线形、圆锥形、阶梯形或复合形的纵向振动变幅杆。
9.根据权利要求1所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于步骤4)的发酵液在6000～12000rpm冷冻离心20～30min。
10.根据权利要求1所述的纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于步骤5)的超滤分离的操作压力为0.1Mpa～0.8Mpa，采用截留分子量为5KDa和100KDa的聚醚砜复合膜、纤维素膜或纤维素复合膜作为超滤膜。
全文摘要
本发明涉及一种纳豆功能活性成分生产方法。纳豆功能活性成分高效连续化生产方法，其特征在于它包括如下步骤1).发酵称取大豆，浸泡，高温灭菌，接纳豆菌种，放入培养箱中，35－40℃恒温发酵培养，培养20－24小时；2).粉碎；3).浸提采用搅拌或/和超声进行浸提；4).离心分离将超声处理后的发酵液冷冻离心，离心后的上清液过0.22～0.45μm过滤器，得到纳豆功能活性成分提取液；5).超滤分离将纳豆功能活性成分提取液进行超滤分离，得到纳豆激酶、聚谷氨酸和纳豆肽不同组分；6).干燥将超滤后，经过喷雾于燥得到产品。本发明工艺周期短、能耗低、提取效率高并可适于工业化生产。
文档编号A23L1/29GK1943411SQ20061012485
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月26日 优先权日2006年10月26日
发明者陈洪, 董绪燕, 胡小加, 江木兰, 刘昌盛, 郭璐璐, 汪雪芳, 张文, 周新安, 李培武, 黄凤洪 申请人:中国农业科学院油料作物研究所