分离的茄子Cu/ZnSOD蛋白及其制备与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离的茄子cu/znsod蛋白及其制备与应用。

背景技术：

sod是一种广泛存在于真核生物和需氧原核生物的金属酶，既是抵御活性氧的第一道防线，也是第一个参与超氧阴离子清除的酶蛋白。超氧阴离子是生物体内主要的自由基；很多情况下对机体是有害的，它也是导致衰老的原因之一。而sod是一类重要的清除氧自由基的抗氧化酶，它能催化使其发生歧化反应，生成o2和h2o2；h2o2又在过氧化氢酶(cat)的作用下，生成无毒的h2o和o2，从而起到抗衰老作用。

植物细胞在正常代谢活动和逆境条件下均能产生活性氧。近年来，国内外的专家学者主要研究了sod与植物抗逆性的关系。研究表明，在逆境条件下，植物的抗性与植物体内能否维持较高的sod活性水平有关。环境胁迫能诱导植物sod基因的表达。当前，不同类型的sod基因已被转化到多种植物中，有实验结果表明，sod在转基因植物中的过量表达可以不同程度地提高植物对环境胁迫的抵抗能力。因此，可利用基因工程方法来获得抗逆植株。

sod基因最先从玉米中克隆获得，目前已从番茄、烟草、水稻、拟南芥等多种植物中克隆获得。植物中的sod根据其活性中心结合金属离子的不同，可以分为三类：cu/znsod、mnsod、fesod。其中cu/znsod是植物中含量最高的sod，占总sod的90％左右。茄子是重要的蔬菜作物，但相关研究相对比较滞后。目前，未有任何与茄子cu/znsod基因及其编码蛋白的相关文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种分离的茄子cu/znsod蛋白及其制备与应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种分离的茄子cu/znsod蛋白，其氨基酸序列如seqidno.2所示，具体为：

mvkavavlnssegvsgtifftqeadgpttvsgnisglkpglhgfhvhalgdttngcmst gphfnpagkdhgapedelrhagdlgnitagedgtasftitdkqipltgsqsiigravvvhadpddlgkgghelskstgnaggriacgiiglqg。

本发明的第二方面提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述茄子cu/znsod蛋白。

本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。

编码所述蛋白的多核苷酸序列可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组dna技术、化学合成等方法。

在本案的较佳实施例中，所述分离的多核苷酸的碱基序列如seqidno.1所示，具体为：

atggtgaaggctgtggctgttcttaacagcagtgaaggtgttagtggcaccatcttcttcactcaagaggcagatggtccaaccacagttagtggaaatatctctggcctaaaacctggacttcatggcttccatgtccatgcccttggtgatactacaaatggctgcatgtccacaggaccacatttcaatcctgctggtaaggaccatggtgcgcctgaagatgagttgcgtcatgctggtgatcttggtaacatcacagctggagaagatggtactgcatcttttactattactgacaagcagattcctctcactggttcacaatccattattggaagagccgtagttgttcatgctgatcctgatgatcttggaaagggaggacatgagctcagtaaaagcactggaaatgctggcggaaggattgcttgtggtattattggtctccagggttaa。

其对应的蛋白氨基酸序列如seqidno.2所示，具体为：

mvkavavlnssegvsgtifftqeadgpttvsgnisglkpglhgfhvhalgdttngcmstgphfnpagkdhgapedelrhagdlgnitagedgtasftitdkqipltgsqsiigravvvhadpddlgkgghelskstgnaggriacgiiglqg。

本发明的第三方面提供了一种表达载体，其含有所述多核苷酸。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述载体。这些方法包括重组dna技术、dna合成技术等。可将编码所述蛋白的dna有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mrna合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。

较佳的，所述载体为原核载体或穿梭质粒，如原核载体pmd-19t质粒等。

本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，其被所述载体所转化。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门菌、李斯特细菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho,cos.293细胞、或bowes黑 素瘤细胞的动物细胞等。

其中，特别优选大肠杆菌，如(e.coli)dh5α等。

本发明的第五方面提供了所述茄子cu/znsod蛋白的制备方法，选自以下任一：

(1)利用化学合成方法合成所述蛋白；

(2)在合适的条件下，获得目的基因片段；将目的基因片段插入表达载体中，构建重组表达质粒；构建的重组表达质粒转化宿主菌，在宿主菌中进行表达；而后分离及纯化获得所述茄子cu/znsod蛋白。

较佳的，(2)中，所述目的基因片段的碱基序列如seqidno.1所示。

较佳的，(2)中，所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，优选pmd-19t质粒。

较佳的，(2)中，所述宿主菌可以是适合原核系统表达的配套大肠杆菌，优选e.colidh5α。

本发明的第六方面提供了所述茄子cu/znsod蛋白或其编码基因在制备调控植物生长状况和抵御逆境胁迫产品中的用途。

本发明第七方面，提供了所述茄子cu/znsod蛋白或其编码基因在制备抗衰老产品的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、茄子cu/znsod基因在盐胁迫下表达量受到显著诱导，表明茄子cu/znsod基因能够参与茄子的抗盐胁迫，具有提高茄子耐盐能力的的功能。

2、本发明针对目前茄子研究基础薄弱的现状，首次成功分离和克隆抗逆相关的关键基因茄子cu/znsod，为今后利用基因工程技术改良植物抗逆性状，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

图1：茄子cu/znsod基因在茄子的根、茎、叶、花、果皮、果肉中的表达情况。

图2：茄子cu/znsod基因在盐胁迫下的表达情况。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

实施例1、茄子cu/znsod基因的克隆

1.植物材料的获得

本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。实验材料栽培于上海市闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄子的叶片用于提取rna。

2.rna的提取

采用trizol法提取总rna(trizol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用甲醛变性胶电泳鉴定rna的完整性，然后在分光光度计(thermoscientificnanodrop1000spectrophotometer)上测定rna的纯度及浓度。

3.基因的全长克隆

基于genbank中cu/znsod基因的保守序列设计一对简并引物。将提取rna进行反转录(primescriptii1ststrandcdnasynthesiskit：宝生物工程(大连)有限公司)，以第一链cdna为模板，利用引物

f1：5′-atggtgaaggcygtsgchgtyctt-3′(seqidno.3)；

r1：5′-ttaaccctggagrccaataatrcc-3′(seqidno.4)；

进行pcr，扩增得到预期长度后回收并连接到pmd-19t(宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化大肠杆菌dh5α，利用α互补及菌落pcr筛选阳性克隆，送至英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，得cdna序列如seqidno.1所示，具体为：

atggtgaaggctgtggctgttcttaacagcagtgaaggtgttagtggcaccatcttcttcactcaagaggcagatggtccaaccacagttagtggaaatatctctggcctaaaacctggacttcatggcttccatgtccatgcccttggtgatactacaaatggctgcatgtccacaggaccacatttcaatcctgctggtaaggaccatggtgcgcctgaagatgagttgcgtcatgctggtgatcttggtaacatcacagctggagaagatggtactgcatcttttactattactgacaagcagattcctctcactggttcacaatccattattggaagagccgtagttgttcatgctgatcctgatgatcttggaaagggaggacatgagctcagtaaaagcactggaaatgctggcggaaggattgcttgtggtattattggtctccagggttaa。

实施例2、茄子cu/znsod基因的序列信息与同源性分析

本发明所得新的茄子cu/znsod基因全长cds开放读框序列为459bp，详细序列见seqidno.1。根据cds开放读码框序列获知茄子cu/znsod的氨基酸序列，共152个氨基酸残基，分子量为15.25kd(千道尔顿)，理论等电点(pi)为5.47，序列如seqidno.2所示，具体为：

mvkavavlnssegvsgtifftqeadgpttvsgnisglkpglhgfhvhalgdttngcmstgphfnpagkdhgapedelrhagdlgnitagedgtasftitdkqipltgsqsiigravvvhadpddlgkgghelskstgnaggriacgiiglqg。

将茄子cu/znsod的cds开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用blast程序在non-redundantgenbank+embl+ddbj+pdb和non-redundantgenbankcdstranslations+pdb+swissprot+superdate+pir数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与马铃薯cu/znsod基因(nm_001288080)在核苷酸水平上具有95％一致性；在氨基酸水平上，它们两者之间相似性高达93％。

由此可见，茄子cu/znsod基因与马铃薯cu/znsod基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例3、茄子cu/znsod基因在不同组织中的表达

1.植物材料的获得

在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。

2.rna的提取

采用trizol法提取总rna(trizol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×tbe电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rrna亮度应为第二条rrna亮度的1.5-2.0倍，否则表示rrna样品的降解。纯度较好的rna，a260/a280以及a260/a230约为2.0左右。用分光光度计测定od值并计算rna含量。

3.cdna的获得

以500ng的总rna为模板，按照宝生物公司takaraprimescript^tmrtreagentkitperfectrealtime试剂盒操作说明进行反转录获得cdna备用。

4.设计特异性引物以进行实时荧光定量pcr分析基因在不同组织中的表达量。根据已经获得的茄子cu/znod基因序列，利用引物设计软件设计用于real-timepcr中茄子cu/znsod基因定量分析的特异性引物，

cu/znsod-f：5′-cgcctgaagatgagttgcgt-3′(seqidno.5)；

cu/znsod-r：5′-ggatcagcatgaacaactacgg-3′(seqidno.6)；

内参基因为actin(gu984779.1)，其引物为

actin-f：5′-gtcggaatgggacagaaggatg-3′(seqidno.7)；

actin-r：5′-gtgcctcagtcaggagaacagggt-3′(seqidno.8)。

5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用easydilution(试剂盒提供)将标准品cdna溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cdna溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行real-timepcr扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的pcr扩增产物。通过标准曲线确定模板cdna的合适稀释倍数。

6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cdna第一条链为模板，分别 用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，real-timepcr反应在ftc-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μl。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

7.采用2^-△△ct法作相对定量分析。结果如图1所示，表明茄子cu/znsod基因在茄子的根、茎、叶、花、果皮、果肉中都有表达，其中在花中的表达量最高，其次是叶，而在根中的表达量较低，说明茄子cu/znsod基因的表达具有明显的空间差异性。

实施例4、茄子cu/znsod基因在盐胁迫下的诱导表达

1.植物材料的获得

茄子幼苗用0.15mol/lnacl溶液(浇灌土壤)胁迫处理，并分别在0、3、6、12、24、48h取样(叶片)，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。

2.rna的提取

采用trizol法提取总rna(trizol购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×tbe电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rrna亮度应为第二条rrna亮度的1.5-2.0倍，否则表示rrna样品的降解。纯度较好的rna，a260/a280以及a260/a230约为2.0左右。用分光光度计测定od值并计算rna含量。

3.cdna的获得

以500ng的总rna为模板，按照宝生物公司takaraprimescript^tmrtreagentkitperfectrealtime试剂盒操作说明进行反转录获得cdna备用。

4.设计特异性引物以进行实时荧光定量pcr分析基因在不同组织中的表达量。根据已经获得的茄子cu/znod基因序列，利用引物设计软件设计用于real-timepcr中cu/znsod基因定量分析的特异性引物，

cu/znsod-f：5′-cgcctgaagatgagttgcgt-3′(seqidno.5)；

cu/znsod-r：5′-ggatcagcatgaacaactacgg-3′(seqidno.6)；

内参基因为actin(gu984779.1)，其引物为

actin-f：5′-gtcggaatgggacagaaggatg-3′(seqidno.7)；

actin-r：5′-gtgcctcagtcaggagaacagggt-3′(seqidno.8)；

5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用easydilution(试剂盒提供)将标准品cdna溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cdna溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行real-timepcr扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的pcr扩增产物。通过标准曲线确定模板cdna的合适稀释倍数。

6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cdna第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，real-timepcr反应在ftc-3000实时定量仪上进行，反应体系为20μl。反应采用三步法，95℃变性1min，接着40个循环：95℃30s；58℃30s；72℃45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

7.采用2^-△△ct法作相对定量分析。结果如图2表示，表明nacl胁迫下，可以显著诱导茄子cu/znsod的表达。在nacl胁迫处理12h时，表达量显著高于对照，为对照的3.92倍，达到最高水平。随后逐渐降低，在处理48h时，表达量已接近对照水平。说明cu/znsod基因与茄子抗盐胁迫有关，可以显著提高茄子的耐盐性。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。